Şarj edilmiş veziküller Floresans mikroskobu ile izlenen simetrik ve asimetrik çözüm koşullarda davranışını faz

Özet

Ayrılmış faz dev unilamellar veziküller (GUVs) üzerinde deneyler sık fizyolojik çözüm koşulları ihmal. Bu çalışma yüksek tuzluluk arabellek etkisi ücret uygulamasının GUVs trans-membran çözüm asimetri ve sıcaklık sıvı-sıvı faz ayrılmaya bir fonksiyonu olarak çalışmaya yaklaşımlar sunar.

Özet

Dev unilamellar faz ayrılmış veziküller (GUVs) eşlik sergilenmesi sıvı-emretti ve sıvı düzensiz etki alanlarında lipid Sal hipotez araştırmak için ortak bir biyofiziksel araç. Birçok çalışma, ancak, fizyolojik çözüm koşulları etkisini ihmal. İlgili hesapta, mevcut iş dolu GUVs dioleylphosphatidylglycerol, yumurta sphingomyelin ve kolesterol yüksek tuzluluk tampon ve trans-membran çözüm asimetri etkisi sıvı-sıvı faz ayrımı sunar. Etkileri izotermal ve değişen sıcaklık koşullar altında incelenmiştir.

Biz ekipman ve deneysel stratejiler coexisting sıvı etki alanları simetrik ve asimetrik yüksek tuzluluk çözüm koşullar altında ücret veziküller kararlılığını izlenmesi için uygun tarif. Bu yüksek sıcaklıklarda yüksek tuzluluk arabellekte ücret uygulamasının GUVs hazırlamak için bir yaklaşım içerir. Protokol vezikül seyreltme en aza indirirken basit seyreltme adım harici çözüm kısmi bir değişimi gerçekleştirmek için seçeneğini gerektirir. Alternatif bir yaklaşım için bir tam dış çözüm değişimi sağlayan bir mikrosıvısal aygıt kullanan sunulur. Faz ayrımı çözüm etkisi altında değişik sıcaklıklar da incelenmiştir. Bu amaçla, biz temel tasarım ve faydalı bir kurum içi yapılı sıcaklık kontrol odası mevcut. Ayrıca, Şef faz devlet değerlendirilmesi yansıtacak ve onları aşmak nasıl ile tuzaklar ilişkili.

Giriş

Lipid Sal hipotez^1,2 araştırmak için bir model sistemi olarak GUVs kullanılmıştır hiç mikron büyüklüğünde etki alanlarında bulunan sıvı-sıvı faz ayrılmış dev unilamellar veziküller (GUVs) floresan mikroskopi tarafından gözlenmesi beri ^{, 3} . Bu dizi biyolojik hücreleri kendi müstakil bilayer alan yatıyor onlar plazma hypothesized sallar featuring membranlar, uygun taklit eder şunlardır. Böyle GUVs çok sayıda çalışmalar saf su, sukroz veya düşük-tuzluluk çözümler^4,5,6,7,8dağınık veziküller ile gerçekleştirilmiş. Hücreler için koşullar gibi bu koşullar, ancak, biomembranes fizyolojik ilgili maruz kalma yüksek tuzluluk ortamları ve trans-membran çözüm asimetri yansıtmıyor.

Bu eser ve bir önceki yayın bizim grup⁹, ücret uygulamasının GUVs faz Birleşik membran arasında tuz ve çözüm asimetri varlığı bir fonksiyonu olarak incelenmiş. GUVs dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), yumurta sphingomyelin (eSM) ve kolesterol (CHOI) Sükroz çözüm (ile Osmolarite 210 mOsm/kg) veya yüksek tuzluluk arabellek (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210 farklı oranlarda karışımları hazırlanan mOsm/kg). Lipid seçim zaten bu karışımı^6,8faz diyagramı üzerinde elde edilen veriler tarafından haklı idi.

Birkaç yöntem GUVs hazırlanması için edebiyat^10,11,12 ' kullanılabilir (buraya dikkat edin, biz bir sulu faz lipidler ve yağ bazlı üzerinden aktarımı ilgili olanlar dikkate almayacağım ^{13 , 14} faz davranışını etkileyebilir zarda kalan yağ artıkları doğal tehlikesi nedeniyle). Yüksek tuzluluk arabellek GUVs hazırlanmasında belirli sorunlarla ilgili olduğu. Düşük iyonik gücü çözümler için electroformation yöntemi^15,16 küçük kusurları^10,17ile yüksek verimleri GUVs hazırlamak için hızlı bir yol sunar. Bu yöntem lipidler tabakası bir iletken yüzeye (elektrot) yatırmak, onları kurutma ve onları bir AC alanı uygulanırken sulu bir çözüm ile nemlendirici dayanır. Ancak, bu yöntem ayarlamalar eğer tuz sulu çözüm^18,19' mevcut gerektirir. Electroformation tarafından vezikül büyüme için itici güç electroosmosis¹⁶ yüksek iletkenlikleri²⁰, engel olduğu varsayılır. Farklı tuz konsantrasyonları şişme çözümde mevcut için en iyi duruma getirme gerektirdiği dolayısıyla, GUVs electroswelling yüksek tuzluluk çözümlerinde basit bir yaklaşım değildir. Jel yardımıyla vezikül^21,22 şişme electroformation bile daha hızlı oluşumu süreleri ile potansiyel bir alternatiftir. Bir jel (özel veya polivinil alkol (PVA)) bir substrat kullanıldığında bu yaklaşım gelişmiş lipid film nemlendirme üzerinde oluşturur. Bu yaklaşımlar, ancak, özel tabanlı şişme²³ ve/veya sıcaklık sınırları PVA tabanlı şişme durumunda olduğu gibi durumunda membran bulaşma riskini ile geliyor. Benzer şekilde, GUVs selüloz kağıt substrat büyümek için bir protokol kurulan²⁴son zamanlarda. Bu yöntemin genel sorunlar substrat saflık üzerinde kontrol eksikliği yanı sıra kullanım lipid büyük miktarda vardır. Bu çalışmada, tanıtmak ve en geleneksel yöntem Şef hazırlık, yani kendiliğinden şişme yöntemi^25,26için avantajları mevcut. Su buharı atmosfer ve istenen şişme çözümde sonraki şişlik nemlendirici bir lipophobic substrat lipid katmanda kurutma oluşur (bkz: şekil 1 ve ayrıntıları protokol bölümünde). Bu yöntem vezikül boyutu dağılımı üzerinde kontrol sunmuyor ve polimer substrat veya mikrosıvısal anlamına gelir ile karşılaştırıldığında nerede üretim elektrik alanı tarafından destekli yöntemleri genel olarak daha küçük veziküller sonuçları. Ancak, vezikül kalite ve boyutu burada membran faz durumu araştırdı olarak incelenmesi için uygun.

Asimetri vezikül membran arasında çözüm arasında oluşturma belli sorunlarla karşı ilişkilidir. Bir sık kullanılan yaklaşımdır istenen harici çözüm^27,28vezikül süspansiyon doğrudan seyreltme. Ancak, bu aynı zamanda vezikül dağılım sıklığı azalır. Başka bir strateji yavaş yavaş dış çözüm için çözüm içinde - sağlayan bir akış-hücre alt kısmında yerleşmiş GUVs etrafında değişimi için olduğunu ve outflux. Rahatsız edici veya bile akışı ile veziküller kaybetme önlemek için bu yaklaşım zaman verimsiz işleyen uygulanan⁸, düşük akış oranları vardır. Ayrıca, bu yaklaşımlardan hiçbiri tam harici çözüm Satım garanti eder. Onları bir harici çözüm alışverişi sırasında kaybetmemek için veziküller hareketsiz açık bir çözümdür. Örneğin, biotinylated GUVs bir streptavidin kaplı yüzey²⁹gergin. Ancak, bu yaklaşım yapıştırılır kompozisyon varyasyonları neden olabilir ve bu nedenle sigara yapıştırılır membran^30,31kesimleri. Manyetik uygulanması veya elektrik alanları membran heybetli veziküller sonuçları yakalamak için³²gerilim. Bir vezikül yakalamak için optik cımbız istihdam gerektirir bir kolu olan optik sedye kullanımı yerel Isıtma³³içerebilir iken (Yani bir boncuk), bağlı. GUVs yakalama son dekolmanı³⁴olmadan Platin teller üzerinde büyüyerek da yapılabilir. Bu ancak ince lipid tüpler (bağları) tarafından hangi izole değildir ve hangi genellikle için kabloların takılı olduğundan veziküller ya da diğer veziküller verir.

Yukarıda belirtilen sınırlamalar üstesinden gelmek için stratejiler sunulan iş vurgulamaktadır. Biz ilk spontan şişme yönteminin uyarlanmış ve iyimserlik GUVs üretimde yüksek tuzluluk arabellekleri için ayrıntılı bir açıklama mevcut. Biz o zaman verimli bir şekilde basit seyreltme veya bir mikrosıvısal cihazın kullanımını tarafından asimetrik çözüm koşulları oluşturmak için iki yaklaşım tanıtmak. Amacımız GUVs membran faz durumunu farklı çözüm koşullarında analizini olduğundan, başarılı istatistiksel analiz ölçütlerini ve yanlış Kategori önlemek için mevcut ipuçları sonraki bölümlerde açıklanmaktadır.

Analizleri izotermal koşullar altında yanı sıra değişik sıcaklıklar altında yapıldı. Sıcaklık c iseTim yaygın olarak istihdam, deneysel sıcaklık kontrol odaları ayrıntılarını nadiren açıklanmıştır. Burada, çeşitli sıcaklık koşullarında GUVs gözlemlemek için bir kurum içi yapılı Kur sunulur.

Protokol

1. GUVs spontan şişme

Not: kloroform yüksek uçucu zararlı bir madde olduğunu. Bir duman başlık altında kloroform içeren tüm işlemleri gerçekleştirir. Pipet ipuçları veya plastik kaplar gibi plastik aygıtlar transfer ve/veya depolama kloroform çözümleri için kullanmayın. Kloroform çözüm kirlenmektedir plastik erir. Kaplar yerine cam ve cam şırınga kullanın. Ayrıca, membranlar ile etkileşime girebilir gibi yabancı maddelerin giriş önlemek için mümkün olduğunca temiz iş. Son Şef hazırlıklar konsantrasyonlarda tipik lipid micromolar aralığında olan, böylece bu konsantrasyon aralıktaki yabancı maddelerin membran davranışı üzerinde güçlü etkiye sahip olabilir dikkat edin.

1. Temel ekipman dışında aşağıdaki öğeleri hazır mı.
   1. Hazırla bir polytetrafluorethylene (PTFE, Teflon bilinen) plaka boyutu ~1.5 cm x 1,5 cm ve uygun kalınlık lipid birikimi için. İnce zımpara kağıdı ile bir tarafta plaka kabartmak.
      Not: PTFE lipophobic ve kloroform çözümleri tarafından Eğer yumuşak ıslak değil. Her iki PTFE plaka lipid birikimi için doğru yüzü hakkında kafa karışıklığı önlemek için pürüzlü. Plaka kalınlığı kolay işlemek için bu çok esnek değildir ve kolayca tarafından hidrasyon eriyik-ebilmek var olmak örtülü örneğin seçilmelidir (bkz. şekil 1). Burada biz ~ 2 mm kalınlığında levhalar kullanılır. Bir kez pürüzlü, PTFE plaka yeni deneyler için uygun (Adım 1.3) temizlendikten sonra yeniden kullanılabilir.
   2. Son lipid film nemlendirme ve vezikül büyüme için uygun birim (~ 15 mL) yapışmalı cam şişe hazırlayın.
   3. İçine ~ 15 mL cam şişe uyuyor; bkz. şekil 1 lipid film öncesi şişmiş mi diye su doymuş bir atmosfer oluşturmak için kullanılacak bir yapışmalı cam kaba hazırlayın.
2. 4 mM 1,2 istenilen oranda lipid stokları hazırlamak - dioleoyl - sn - glycero - 3 - fosfo-(1 ' - rac - gliserol) (sodyum tuzu) (DOPG), yumurta sphingomyelin (eSM) ve kolesterol (CHOI), ek 0,1 mol % 1,1 ile ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DiIC ₁₈) toplam lipid konsantrasyonu 4 mm. Kloroform bir çözücü kullanın. Tablo malzemelerin bakın.
3. PTFE plaka ve ticari bulaşık deterjanı, etanol ve kloroform ile cam kap o sırada iyice durulayın ve nihayet onları kurutun.
4. Cam kullanarak, mevduat ve 10-15 µL lipid stokunun yapısı yan bir üniforma lipid film oluşturmak için PTFE plaka üzerine eşit olarak yayılmış. Gerekirse çözüm yaymak için şırınga iğne kullanın.
5. PTFE plaka temiz bir yüzey üzerine yerleştirin ve yatırılan lipit filmin 60 ° C'de kloroform kaldırmak için 2 h için birlikte yazılıolduğu. Kolaylık uğruna, plaka temizlenir ve mühürsüz 15 mL cam kap kuruma sırasında mevduat.
   Not: Yüksek sıcaklık lipit filmin bu ve tüm sonraki adımları homojen bir tek-sıvı durumdaki sağlanır.
6. Sonra kuruma, yüzdürme ~ 15 mL cam şişe (~ 1 cm) üzerinde knock, şekil 1 bakınız izin vermeyen bir seviyeye kadar deiyonize su ile önceden şişme cam kap doldurmak.
7. ~ 15 mL cam şişe PTFE plaka ile konteyner içine ve su doymuş bir atmosfer ortaya çıkabilir ki, kapak yerine bkz: şekil 1B.
   Not: İç kapsayıcı duvarlar, yoğunlaştırılmış su başarılı su buharı doygunluk için iyi bir gösterge verir.
8. İzin yatırılan lipit filmin ön 4 h için 60 ° C'de kapalı cam kap içinde şişer. Bu süre içinde istenen şişme çözüm hazırlayın.
   Not: sıcak su doymuş azot veya argon için ön şişlik kullandıysanız daha düşük sıcaklıkta yürütülen vezikül hazırlıkları için bu kez son derece - birkaç dakika aşağı - kısaltılabilir onun yerine.
   1. Hazırla 200 mM Sükroz veya 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 ayarlanabilir HCl ve 60 ° c ısı ile şişme çözüm olun.
9. Sonra ön şişlik, konteyner dışında PTFE plaka ile ~ 15 mL bardak alın. 0,45 µm filtre bağlı bir şırınga şişme çözüm ~ 5 mL lipit filmin hidrat için 15 mL cam şişe ekleyin.
   Not: filtre için bir iğne sabitleme şişme çözüm ekleme kolaylaştırır. Şırınga ve filtre öncesi ısınma şişme çözüm eklerken lipit filmin tek-sıvı faz durumunu sağlamak için tavsiye olabilir. Çözüm filtreleme bakteri veya tuz acele vb (içinde-) organik contaminations en aza indirir
10. sulu lipit filmin buharlaşma en aza indirmek için PTFE plaka üzerinde tutarak ~ 15 mL cam şişe mühür. Gerekirse, parafin film mühürleme geliştirmek için kullanın. Sulu lipit filmin 60 ° C'de gece şişme son Şef için bırakın.

2. GUVs hasat

Not: şişmiş ve gözle görünür bir küçük (~ 1 mm) bulut benzeri yığın PTFE substrat sonuçlarından müstakil GUVs toplama. Hiçbir Floresans boya kullanıldığında beyazımsı görünür. Aksi takdirde, fluorophore Absorpsiyon spektrumu göre renklidir. Ayrıca DiIC ₁₈ işler bulut pembe (bkz. Şekil 2). Veziküller toplu olarak konsantre ve bu hasat maksimize vezikül verim.

Küme için bir pistonlu pipet plastik ucu sivri sonu veya toplamak, ağız uyacak veziküller

1. serin aşağı oda sıcaklığına ~ 1 h. kesim içinde veziküller ~1/10.
   Not: Soğutma hızı katı etki alanlarının boyutunu değiştirir gibi katı-sıvı faz ayrılması bekleniyor, özellikle önem kazanır. Burada, aşağı soğutma yavaşlatmak için biz örnek bir metal blok boyutu 5 cm x 9,5 cm x 7,5 ile temas halinde yerleştirilen cm (H x u x G) bu için 1 h. içinde oda sıcaklığında soğuduktan
2. Pipet yukarı küme çözüm şişme uygun bir birim ile birlikte (bkz. Şekil 2). Toplam simetrik çözüm koşulları oluşturmak için şişme çözümde yeniden askıya alma veya herhangi bir ISO ozmotik çözüm asimetrik çözüm koşulları yaratmak için istenen.
   Not: Birimin alt sınırı tamamen hasat toplama boyutuyla sınırlıdır. Harici çözüm seyreltilmiş ve tam konsantrasyon değerlendirmek için vezikül çözüm hacmi dikkate alınması gerekiyor.

3. GUVs faz durumu değerlendirme kullanarak floresan mikroskopi için gözlem

Not: GUVs DiIC ₁₈ floresan bir işaretleyici olarak katkılı. Bu fluorophore tercihen sıvı düzensiz (Ld) aşamasında içine bölümleri. Bu aşama ayrılma GUVs için ortaya çıkan etki alanlarının Floresans mikroskobu gözlem için sağlar. Faz durum değerlendirmesi epi-Floresans mikroskobu ile gerçekleştirilen. Prensip olarak, bu gözlemler aynı zamanda da (membran unilamellarity belirlemek için örneğin) sinyal miktar için izin veren mikroskobu (CLSM), tarama confocal lazer kullanılarak uygulanabilir. Ancak, CLSM için daha karmaşık ekipman ve (genellikle) epi-floresan gözlemler taramadan önce herhangi bir durumda faydalıdır.

1. GUVs gözlemlemek ve sürekli aşama Birleşik farklı çözümleri aynı kompozisyon karşılaştırırken kullanmak bir amaç (örneğin 40 X büyütme ile 0.6 sayısal diyafram (NA) olarak kullanılan burada) üzerinde kararn koşulları. Kullanılan fluorophore (örneğin 560 ± 40 nm ve 630 ± 75 nm ile bir 585 nm kiriş kırık arasında DiIC ₁₈ için kullanılan olarak uyarma) ile floresan gözlemler etkinleştirmek için uygun uyarma ve emisyon dalga boyu filtreleri kullanın.
   Not: Mikro algılanabilmesi için etki alanları arası en az boyutunu tanımlar amaç elde çözünürlüğü üzerinde faz Devlet sınırları içinde bir faz diyagramı bağlıdır.
2. Analiz için yalnızca aşağıdaki kalite ölçütlerini karşılayan GUVs ı.
   1. Şef membran unilamellarity farklı veziküller görsel gözlem tarafından sağlamak ve onların yoğunluklarda karşılaştırın; veziküller en düşük Floresans emisyon yoğunluğu ile büyük olasılıkla unilamellar.
      Not: Spontan şişme vezikül toplu işlemleri dev veziküller büyük bir kısmı nerede değil unilamellar verim.
   2. Sözde unilamellar dev veziküller Floresans emisyon yoğunluğu miktarının tarafından ek bir denetimi gerçekleştirmek ve saçılma nüfus içinde karşılık gelen sinyali kontrol edin. Eğer farklı GUVs arasında hiçbir tamsayı farklılıklar gözlenir, hepsini unilamellar olması muhtemeldir.
      Not: veziküller geleneksel lipidler spontan şişme, için yukarıda açıklanan yaklaşım gibi kurulmuş bir yöntem kullanarak üzerinden hazırlanan unilamellar veziküller tespiti yeterli olduğunu. Yeni bir şef hazırlık iletişim kuralı oluşturma veya sıradışı lipidler kullanarak, daha ayrıntılı çalışmalar unilamellarity onaylamak için gerekli olacak eğer. Örneğin, yeni bir iletişim kuralı tarafından hazırlanan etiketli veziküller membran floresan sinyallerini bu kurulan bir yöntemi tarafından hazırlanan GUVs karşılaştırıldığında olabilir; veya membran gözenek protein α-hemolysin vezikül membranlar ²⁴ eklenebilir. Boya eklendi veziküller dışa doğru o zaman onların iç ya da değil, uni - veya multilamellar veziküller, varlığını bağlı olarak sırasıyla girersiniz.
   3. Şef hala tanınabilir olmak etki alanları için makul bir minimum çap olduğundan emin olun.
   4. Şef (hemen hemen) hiç kusur çıkıntılı veya yapıştırılan bölümü veya iç yapıları gibi olduğundan emin olun.
3. Bir aliquot Şef süspansiyon mikroskop slayt üzerine, transfer ve düzgün mühür. Bir gözlem odası hazırlamak.
4. Örnek mikroskop slayda Kasası. Bir merkezi dairesel kesme ile silikon ayırıcı tarafından çevreleyen. Kirlenmesini önlemek için ara parça ile temas halinde örnek olmadığından emin olun. İç kapak notu silikon spacer üstüne yerleştirerek mühür.
   Not: yerine silikon silikon gres veya ev yapımı polydimethysiloxane (PDMS) çubukları spacer bir kullanabilirsiniz. Odası mühürleme örnek en az buharlaşma sağlar ve ISO-osmolar koşulları korur.
5. ~ 5 min için olası etki alanlarının yeniden denge için örnek bırakın.
   Not: pipetting gelen mekanik stres reformu için zamana ihtiyacım membran etki karışımı.
6. Mikroskop Sahne Alanı'na örnek ile mikroskop slayt yerleştirin ve Şef toplu istatistiksel bir yaklaşım içinde faz durumunu analiz etmek. Toplu iş başına 30'dan fazla GUVs gözlemlemek ve faz durumlarına Şef faz durum değerlendirmesi ile DiIC ₁₈ ( şekil 3) için aşağıdaki ölçütlere göre belirlemek.
   Not: sonra onların büyüme, veziküller bireysel kendi besteleri (örneğin) kapalı filizlenen etki alanı veya exchange nanotüpler yoluyla membran malzemenin nedeniyle değişebilir. GUVs bu nedenle aynı toplu iş ³⁵ içinde kompozisyon çeşitleri sergi. Ya sıvı-sipariş (Lo) olmak
   1. tek-sıvı faz veya sıvı düzensiz (Ld): genel Şef şekli küresel ve pürüzsüz ve DiIC ₁₈ homojen membran içinde dağıtılmış olun (ilk görüntüleri alt ve üst panellerinde < güçlü sınıfı "xfig" = > şekil 3).
   2. İki aşamalı Lo + Ld bir arada bulunma durumu: davranış bölümleme DiIC ₁₈ göre veziküller ile pürüzsüz sınırları dairesel görünür etki alanları sergi sağlamak; etki alanları parlak kırmızı (Ld) ya da koyu kırmızı/siyah (Lo) (ikinci üst Albümdeki ve alt panellerinde şekil 3 ' te sahte renk). Etki alanlarını vezikül yüzeyinde yaygın ücretsizdir ve birleşim kontrol edin.
   3. İki aşamalı katı (ler) + sıvı bir arada bulunma durumu (S + Lo veya S + Ld): etki alanları parmak benzeri veya yuvarlakça ama açısal sınırları ile görünebilir sağlamak (üçüncü Albümdeki üst ve alt panellerinde şekil 3). Sıvı etki alanları (kırmızı) (Difüzyon görüntülenmez bir katı siyah) arka plan üzerinde gözlemlemek. Aksine, katı (siyah) etki alanları bir sıvı arka plan (kırmızı) üzerinde yaygın için ücretsiz olacaktır.
   4. Üç fazlı S + Lo + Ld bir arada bulunma: üç çeşit görünen etki alanı gözlemlemek: (i) açısal siyah etki alanları (S), (II) dim (Lo) ve (III) parlak (Ld) kırmızı etki alanları katıştırılmış.
7. GUVs nüfusu arasında rasgele örnek, aşağıdaki örneklerde olduğu gibi baskın olduğu tespit edilmiştir faz devlete atfetmek:
   1. Eğer tek-sıvı GUVs ve 15 Lo + Ld GUVs gözlenen, 20 düşünün için toplu bir Tek-sıvı faz.
   2. Eğer 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs ve 25 tek-sıvı GUVs gözlenen, toplu bir Lo + ld olmak için düşünün

4. Şef gözlem mikrosıvısal cihazın

Not: ilk mikrosıvısal aygıt imal; mikrosıvısal aygıt tasarım ve montaj detayları verilmiştir başka bir yerde ^{36 , 37}; kısa bir açıklama için bkz. şekil 4.

1. Taze Şef çözüm (tuz veya sukroz adım 1.8.1 göre) şişme hazırlamak ve 0,45 µm filtre.
   Not: Herhangi bir yabancı maddelerin akan çözümlerinde mikrosıvısal aygıt yapışmasına neden.
2. Kesmek 200 µL piston plastik ipuçları pipet ve cihazın PDMS parçası delik içine koyun. 100 µL ve taze ve filtre uygulanmış havzanın çözüm şişme 5 µL ekleyin (bkz. şekil 5A) ve her kesme ipuçları, sırasıyla pipet. 900 x g de tam aygıt için aygıt-ön doldurma ve havayı çıkarmak için salıncak rotor santrifüj 10 min santrifüj kapasitesi.
3. 1 mL cam şırınga-ön doldurma ve boru şişme çözüm ile bağlı ve dalgıç konuma taşımak için 0 mL.
4. Tüp sıvı çıkış aygıtının içine yerleştirin ve şırınga şırınga pompa yerleştirin.
   Not: Şırınga ve şırınga pompa marka seçimi önemli değil. Ancak, cam şırınga daha kesin ve pompa-meli muktedir µL/dk akış aralığı içinde ameliyat.
5. Bağlan özel basınç kontrol ünitesi mikrosıvısal denetiminin 8 alıcılar için katman (bkz. şekil 5A). Basınç kontrol ünitesi 3 (Hava, azot veya argon) bar basınç ayarlı ama vanaları kapalı konumda mikrosıvısal aygıta ayarlayın.
6. Şimdi bir ters confocal mikroskop sahneye şırınga pompa ve basınç kontrol birimine bağlı mikrosıvısal cihazın yerleştirin.
   1. Kullanım amacı ile aynı bir büyütme ve toplu gözlemi sırasında olarak NA. Diğer bir amaç farklı kararları üzerinde temel alan gözlem eserler önlemek için kullanılırsa, adım 3.7 açıklandığı gibi faz Devlet İstatistik aynı kalır Eğer kontrol.
7. GUVs cihazın içine yük.
   1. İlk, pipet uzağa 25-50 µL rezervuar kalmıştır çözüm hariç hepsi. Şef çözüm 150 µL ekleyin (sukroz veya adım 1.8.1 göre tuz, ama eşleşen adım 4.1 cihazda önceden doldurmak için kullanılan çözüm) rezervuar ve nazik pipetting tarafından mix. Set 10 µL/dk akış hızı için şırınga çekme modu için yaklaşık 20 dk veya kadar fazla tuzaklar % 90'ı işgal etti.
      Not: Rezervuar kuru çalıştırmak için izin verilmemelidir. Bu durumda, hava kabarcıkları mikro kanallar girer. Daha fazla Şef çözüm için reservoi EkleYükleme sırasında r ama hava kabarcıkları cihazın içine pipetting zaman tanıtmak değil dikkat.
8. Tüm mikrosıvısal yüzük-Vana çevresinde tuzakları/GUVs kapatmak için basınç kontrol birimi vanaları açın. Enjektör pompa 0 µL/dak için ayarlayın. 1 saat sonra GUVs ve kayıt confocal görüntüleri gözlemlemek. Heyecanlandıracak ve GUVs kullanılan fluorophore (örneğin 561 nm ve algılama gelince DiIC ₁₈ 580-620 nm arasında uyarma) göre tespit. Adım 3.6 , aynı seçim ölçütünü kullanın ve her Şef (Yani sütun ve satır sayısı, bkz. şekil 4) konumunu not alın için özen
9. Çözüm değişimi GUVs çevreleyen .
   1. Şırınga pompa 0 µL/dak için ayarla ve havzanın Şef çözümden uzak tüm ama 25-50 µL pipet. 2 çözümde (sukroz veya adım 1.8.1, bağlı olarak GUVs dışında istediğiniz çözüm göre tuz) 150 µL rezervuar için nazik pipetting tarafından ekleyip karıştırın. Pipet havzanın arabellek çözümden uzak tüm ama 25-50 µL.
      Not: Bu çözüm de 0,45 µm filtre kullanarak filtre uygulanmış gerekir.
10. En az 5 kez iyice havzanın çözümde değiştirmek için önceki adımı yineleyin. Şırınga 10 µL/dk akış oranını ayarlamak modu mikro kanallar çözümde yerine ~ 10 dk için çekilme.
11. Azaltın 1 µL/dak için akış hızı (açılış ve kapanış mikrosıvısal yüzük valfleri kaynaklanan) 8 basınç kontrol valf 2 s ve yakın tekrar açın. Akış hızı 0 µL/dak için tekrar ayarla.
12. Sonra 1 h, gözlemlemek GUVs ve kayıt confocal görüntüleri. Tekrar, Not sütun ve satır her Şef olduğu aynı Şef karşılaştırmalar önce ve sonra dış arabellek Satım izin vermek için mikro-odası için özen gösterin.

5. Tasarım ve Kalibrasyon, sıcaklık kontrol odasının

Not: sıcaklık kontrolü için uygun bir oda ya ticari olarak elde edilebilir veya ev yapımı. Sıcaklık kontrolü genellikle termal kaplin odasının Şef örnek bir su banyosu veya Peltier bir öğe ile elde edilir. Burada, tasarım ve karakterizasyonu, bir ev inşa sıcaklık kontrol odasının bir harici su termostat ile çalışma açıklar. Böyle Termostatlar birçok laboratuvarlarda kullanılabilir veya lazerler veya Spektrometreler gibi eski ekipmanlardan kurtardı.

1. Araya bir ısı akışı odası, burada, bir su banyosu konnektör ile bir alüminyum blok şekil 6 ' da gösterildiği gibi yaptık. Üst ve alt açıklıklar mühür ve parlak alan gözlem örnek kapak gözlük bloğuna yapıştırma tarafından etkinleştirin.
2. Akışı odası nerede örnek yer alacak ve yaklaşık 100 µL adım 1.8.1 göre deneylerde kullanılan çözüm bir damlacık pipette yan çevirin. İsteğe bağlı olarak, bir fiber optik sıcaklık probu (örneğin FISO FTI-10) eklemek veya bir sıcaklığa duyarlı boya uygun bir konsantrasyon, örneğin 500 µM rodamine B. ekleyin
3. Silikon gres halka şekli veya bazı diğer pul (PTFE veya kauçuk) içinde yatırılır kullanarak Şef gözlem odası oluştur ve bir 0,17 µm cam ile kapatın. Açılan yabancı maddelerin giriş önlemek için sızdırmazlık Ajan veya pul ile temas olmadığından emin olun.
4. Yavaş yavaş derleme ters açın ve bunu uygun boru ile harici su termostat bağlayın. Herhangi bir su sızıntıları özel dikkat.
5. Küme en düşük sıcaklık harici su termostat istenilen ve sıcaklık sensörü okuma stabil olana equilibrate sistem izin; denge için gereken süreyi sistemi en az tepki süresi tahmini verecek.
6. En az bir kez odası kullanmaya başlamadan önce kontrol deneyleri yapmak.
   1. (Örneğin bir cam elyaf sonda ile) çözüm ısısını ölçmek ve termostat okumaya ilgi sıcaklık aralığında karşılaştırın.
   2. Termostat okuma ve doğrusallık ölçülen sıcaklık en az bir ofset için onay.
   3. Sıcaklık değişimi bir sıcaklık hassas boya kullanarak gözlem odası içinde olup olmadığını denetleyin. Floresan yoğunluğu veya floresan mikroskobu (FLIM) alt kapak notu ⁴⁰ farklı mesafeler için Imaging ömür boyu yoluyla çözüm ısısını ölçmek. Ayrıca Şef gözlem, bölgede herhangi bir sıcaklık gradyanı olup olmadığını Şekil 7 ' de gösterildiği gibi kontrol.

6. Şef gözlemler değişen sıcaklıklarda

Not: genellikle, GUVs için kimin membranlar potansiyel faz ayrı ve bu gibi görünüyor gözlem sıcaklık T _obs homojen, faz ayrımı olacak T _obs indüklenen (bu gözlenen olup olmadığını bağlıdır araştırıldı Sıcaklık aralığı). Tersi, faz ayrılmış veziküller haline homojen T _obs yüksek bir sıcaklıkta. Ancak, bu durum belirli (karmaşık) lipid kompozisyon için gerekli değildir ve her zaman tüm erişilebilir Sıcaklık aralığı ³⁸ taramak ilginç olabilir. İletişim kuralı gözlem ve değerlendirme aşaması geçiş sıcaklıklar için sıcaklık kontrolü için kullanılan belirli yöntem dayanmaz.

1. Sıcaklık gözlem odası göre Bölüm 5 fiber optik sıcaklık probu veya sıcaklığa duyarlı fluorophore atlama, araya.
2. Harici su banyosu oda sıcaklığında (23 ° C) için set ve 10-15 dk. için equilibrate sistem
3. Saymak adım 3.6 ölçüt kullanarak ayrılmış faz veziküller sayısı; genel faz Şef popülasyon durumunu sistem geçiş sıcaklığını bölge hakkında bir ipucu vereceğim. Faz devlet çapında vezikül nüfus oldukça heterojen ise doğrudan adım 6.5 gidin.
4. (Veziküller çoğunluğu faz ayrılmış varsa) artırmak veya azaltmak (veziküller çoğunluğu homojen değilse) yaklaşık 2 dk. yeniden değerlendirmek için faz durumunu sıcaklık kaba aralıklarla (örneğin 1-2 ° C) ve izin vermek belgili tanımlık sistem equilibrate Şef nüfus tarafından anlamına gelir bir rasgele örnek ve vezikül nüfusun heterojen faz durumunu gösterir kadar sıcaklık değişir.
Nüfus faz geçiş noktasının yanını olduğunda
5. (Faz devletler arasında bireysel GUVs Yani daha ziyade heterojen), sıcaklık (örneğin 0,5 ° C) çözünürlüğünü artırmak için aralığı azaltmak. Sistem ~ 2 min için equilibrate ve Şef nüfus faz durumunu rasgele örnek aracılığıyla yeniden değerlendirmek izin.
6. Faz geçiş noktası geçti sonra tüm GUVs şimdi sırasıyla homojen veya faz ayrılmış olana sıcaklık değişen devam.
7. Histeresis değerlendirmek denge kez yeterli olup olmadığını kontrol edin.
   1. Değişiklik sıcaklık yönünü tarama, ben.e. tarama sıcaklığı artırmak için Eğer, tarama sıcaklığı ortaklarda.
   2. Sıcaklık Şef nüfus faz devlet oranı (örneğin % 80 faz ayrılmış) değerlendirmek için en az bir alt kümesini seçin.
   3. Arasında her iki yönde de aşama devlet oranı önemli sapmalar histeresis gösteriyorsa, sıcaklık adım boyutunu azaltmak ve/veya denge zaman adım 6.4 ve 6.5 artış.
   4. Tarafından eşit oranlarda gösterilen hiçbir histeresis ise, adım boyutu ve/veya denge zaman çıkartabilirsiniz.
8. Faz devlet oranları sıcaklık karşı arsa. Miktar için uygun modeline ( şekil 8) verileri sığdırmak.
   Not: Faz geçiş eğrileri sık sigmoidal bir yörünge özelliği ve sigmoidal Boltzmann modeli parametreleri uygun uygun bir dizi sağlar:
   
   y: üniforma/faz-ayrılmış GUVs kısmını
   bir ₁: ilk kesir değeri
   bir ₂: son kesir değeri
   T: sıcaklık
   T _mix: yarı-azami y sıcaklıkta
   Y homojen GUVs kısmını olduğu gibi A ₁ ve A ₂ 0 ve 1, sırasıyla sabit olmalıdır. Miscibility geçiş kesir değeri 0 belirli bir ısıda sıcaklık aralığının tüm kesir değerleri 0 olarak kabul edilir olmak ölçülür bir kez sigmoidal, olduğu varsayılır. Kesir değeri belirli bir sıcaklık 1 olduğunda, tersi, tüm kesir değerleri yukarıdaki sıcaklık aralığının 1 olduğu varsayılır.

Sonuçlar

Şişme Şef

Burada açıklanan spontan şişme yaklaşım ile GUVs DOPG, eSM, beste ve CHOI gecede 210 mM Sükroz veya 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 görünür bir toplamak oluşturan yetiştirilen. Toplam hasat yüksek vezikül verimi sağlar. Resuspension şişme çözümde simetrik trans-membran çözüm koşullarda sonuçlandı. Asimetrik koşulları oluşturmak için toplama işlevinde bir ISO-osmolar Sükroz veya yüksek tuzluluk çözüm, sırasıyla resuspended (Resim 2). Elde edilen seyreltme GUVs sayısı seyreltme en aza indirirken bir yarı harici çözüm değişimi karşılık gelir.

Faz diyagramı eşleme Floresans mikroskobu kullanılarak GUVs

0,1 mol % faz özgü DiIC₁₈ GUVs varlığı faz durumlarına geniş alanlı Floresans mikroskobu ile gözlenmesi için izin. S + L faz ayrımı sergilenmesi veziküller ile 63 x gözlendi / ince çözümleyebilmeleri için 1.2NA parmak benzeri etki alanları yapılandırılmış. Tüm durumlarda, bir 40 x / 0.6 kalan NA amaç kullanıldı. Eserler GUVs görsel denetim sırasında önüne geçmek ve tekrarlanabilirlik en üst düzeye çıkarmak için belirli ölçütlere bu ayarlanmış faz durumu analiz (iletişim kuralı adım 3.6) için göz önünde bulundurulacak hangi veziküller belirlenir.

Sükroz veya yüksek tuzluluk çözüm şişmiş ve oda sıcaklığında gözlenen oranları geniş bir üçlü DOPG/eSM/CHOI karışımları hazırlanan gUVs homojen Lo veya Ld aşama, Lo + Ld ve S + L faz ayrımı sergilenen, şekil 3' e bakın. Şekil 9 veri analizi dahil edilmemesini exemplarily arızalı veziküller gösterir ve ayrıca multilamellar veziküller tanımlamak için nasıl gösterir.

Kendi bilinmeyen geçmişi nedeniyle, GUVs toplu iş içinde kompozisyon varyasyon³⁵sergilemek muhtemeldir. Bu nedenle, belirli bir kompozisyon genel faz durumunu istatistiksel bir yaklaşım belirlendi. Şef nüfus belirli bir lipid bileşimi rasgele örnek (iletişim kuralı adım 3.6) içinde hakim olmak gözlendi faz durumuna atfedilen. Henüz, Lo + Ld bir arada bulunma bölge yakın besteleri kez nerede baskın faz ülke kadar dar bir çoğunluk yapılan toplu işlemleri vermiştir. Böyle belirsiz durumlarda, görsel kontrol ile en az üç bağımsız örnekleri tekrarlandı. Veziküller ile aynı faz durumu (örneğin sergileri Lo + Ld faz ayrımı) içinde rasgele örnekleri mevcut kısmını sonuç (şekil 10) alınmış denemeler sayısı üzerinden ortalama.

Açıklanan protokoller üzerinden DOPG, eSM ve CHOI farklı oranları yüksek tuzluluk ve sukroz çözümleri geniş bir yeterli Şef büyüme sonuçlandı. Üçlü faz Diyagramı içindeki geniş bölgeleri (Şekil 11) simetrik hem de asimetrik yüksek tuzluluk çözüm koşullarda eşleştirilebilir. Farklı çözüm koşullar altında gözlenen vezikül faz davranış farklılıkları başka bir yerde ayrıntı⁹' tartışıldı.

Faz davranış gözlemleri mikrosıvısal yöntemini kullanarak tam arabellek exchange sonra

Artıkları seyreltme sonuçlarını dışında şişme çözüm asimetrik çözüm koşulları oluşturma. Bizim mikrosıvısal yaklaşım için bir tam dış çözüm geçişine izin verir. Şekil 5A tamamen akışkan çıkış ve basınç kontrol girişleri ile birlikte confocal mikroskop sahnede monte mikrosıvısal aygıtı gösterir. Tüpler ışık yukarıdan Imaging aktarılan için yer sağlamak için 90 ° metal kanallar üzerinden bağlanır.

Gözlem mikrosıvısal aygıt içinde 63 x olan confocal mikroskop için / 1.2NA su daldırma objektif lens uygulanmaktadır. Önceki gözlemleri ile gibi toplu olarak, DiIC₁₈ membran leke için kullanıldı. GUVs durumunu tuzağa faz gözlemlerini cihazda yaparken, verileri yanlış anlaşılabilir değil bakım alınması gerekir. Mesaj GUVs yakın yakınlık nedeniyle, uyarma ve emisyon ışık yolları kısmen etki alanları (şekil 12) yanlış görünümünü lider PDMS tarafından engellenebilir. Burada, iletilen ışık algılama mesaj, GUVs konumunu denetlemek yararlıdır. Bu istenmeyen etki çapı özellikle önemli az 10 µm küçük GUVs için. Bu gibi durumlarda, verileri geri çevrildi. Şekil 13A confocal görüntüde bir Lo etki alanı mevcut Şef vezikül üzerinde haçlar bir düzlemsel vezikül bölümü göstermektedir. Bu durumda, düzlemsel kesit taramaları daha da üstünde veya bölümün altındaki neden bu cevapsız olurdu ve vezikül şef olan bir homojen faz durumda olarak kabul etki alanı karşılaştırıldığında küçük boyutu nedeniyle göstermiştir değil. Bu nedenle, confocal z-yığın tüm Şef yüzey incelemek için kullanılır. Çünkü bütün vezikül hemen yansıma geniş alanlı mikroskopi için bu bir sorun olmayabilir.

Son olarak, örnek GUVs önce ve sonra Döviz dış çözüm membranlar Devletleri (Şekil 14) vardır ne aşaması açık nerede verilmiştir. 60 chambers (her bir tek Şef tuzak mesajların bir çift), her aygıtın vardır deneyler aygıt başına onlarca izin (bkz. şekil 4). Ancak, bazı GUVs harici çözüm değişimi sırasında kayıp alabilirsiniz. Bu aşağıdaki adımları tarafından minimize edilebilir: 1) Şef yapışma/rüptürü, mesaj; önlemek için sığır serum albumin (BSA) kaplama kullanarak kaplama 20 mg/ml BSA 60 dk ve sonraki çalışma arabellek ile durulama için odası duvarları açarak yapılır. Kullanılabilecek başka bir yapıştırıcı poly(L-lysine)-greft-poly(ethylene glycol)³⁹moleküldür. 2) mesaj merkezi üzerinden geçebileceği sarkık GUVs önlemek için iç ve dış çözümleri dikkatli ozmotik eşleşen veya GUVs patlama. 3) Şef hazırlık yordamı veziküller ~ 8 µm mesaj merkezi geçitle önlemek için çapı daha büyük elde etmek için en iyi duruma getirme.

Tasarım ve ısı kontrollü odası Şef gözlenmesi karakterizasyonu Birleşik faz

Harici su termostat (şekil 6) bağlantı özellikleri basit akış odası dizayn ettik. Biz eldeodası tarafından freze bir alüminyum blok. Genel olarak, odası malzeme örnek su banyosu 6B anlamaya ve 6 Cgösterildiği gibi alt kapak cam ile birleştiğinde gibi ısı iletken, olması gerekmez.

Odası performansını tam tasarım bağımsız olarak değerlendirilmelidir. Özellikle dışarıdan-set sıcaklık, herhangi bir sistematik sıcaklık ofset ve odanın içinde sıcaklık değişimi ile numune sıcaklığı doğrusallık için kontrol ettik. İlk iki nokta bir fiber optik sıcaklık sondası tarafından (örneğin FISO FTI-10) doğrudan sıcaklık ölçüm içinde odası tarafından ele alındı. Ayrıca Şef süspansiyon içinde sıcaklık değişimi için kontrol ettik. Böyle bir degrade odasının dışarıya ısı akışı kaynaklanıyor olabilir. Dağınık şekilde çözülmüş sıcaklık ölçümleri bir sıcaklık hassas fluorophore⁴⁰ile elde edilebilir, Şekil 7bkz.

Veri çizme ve TGUVs faz ayrılmış,_karışımı elde etmek için uygun

Homojen GUVs kısmını gözlemlenen sıcaklık aralığında komplo bir sigmoidally şeklinde veri noktası yörünge sonuçlandı. Biz hangi T_mix olabilir sonucuna ()şekil 8Boltzmann modeli (protokol bölümünde 6,8) verilere uygun).

Şekil 1: deneysel adımları sırasında karşılık gelen sahne vezikül büyüme (alt paneli) ile spontan şişme Protokolü (üst panel). (A) A homojen lipid film yayılmış bir yapısı PTFE tabağa ve herhangi bir çözücü kurutulmuş. (B) kurutulmuş lipid film sonra bilayer hidrasyon kolaylaştırmak için su ile kapalı bir kap içinde su doymuş bir atmosferde önceden şişmiş. Geçersiz cam şişe PTFE plaka içerir ve bu hidrasyon adımı sırasında açık kalır. (C) önceden şişmiş lipid film sonunda tamamen cam şişe içinde lipid kaplı PTFE plaka üzerine istenilen şişme çözüm eklenmesiyle sulu olur. Buharlaşma önlemek için cam şişe düzgün gecede kuluçka sırasında kilitlendi. Bir toplu iş içinde kompozisyon çeşitleri en aza indirmek için tüm adımları lipid karışımı tam karışan nerede bir sıcaklıkta gerçekleştirilmesi gerekir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: hasat Şef. (A) A yatırılır lipid film 20/60/20 0,1 mol % DiIC₁₈ yüksek tuzluluk arabellekte şişmiş molar oranları, DOPG/eSM/Choi oluşan oluşan 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5. Cam kap kapağı Ayrıca parafin film ile mühürlendi. Büyütülmüş bölgenin ilgi elde edilen Şef toplama içerir. Kırmızı görünümünü DiIC₁₈varlığı bir sonucudur. (B) GUVs kesilmiş pipet ucu ile hasat edildi. Bu görüntüde, toplam kadar çözüm, şişme 50 µL birlikte taze bir şişe aktarılma pipetted. (Çözüm koşulları, asimetrik trans-membran oluşturmak içinC) toplam başka bir izotonik dış çözümde düşürülmüştü. Burada, agrega ile birlikte 50 µL çözüm şişme şişme çözüm içinde bir 20 x seyreltme kaynaklanan 950 µL Sükroz çözüm resuspended. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Şef Imaging. Geniş alan ile hazırlanan ve simetrik tuz ya da DOPG, eSM ve CHOI farklı oranları oluşan Sükroz çözümleri gözlenen 0,1 mol % DiIC₁₈ katkılı GUVs görüntülerini floresan (soldan sağa doğru salt arabellek içinde: 40/20/40; 50/20/30; 30/60/10; içinde sukroz, soldan sağa: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). Görüntüleri GUVs Protokolü adım 3.6 ölçütlere göre değerlendirilir farklı eyaletlerde (coexisting) faz tasvir. Burada, veziküller ile 40 X / 0.6 görüntüsü NA amaç. Ölçek çubukları 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: mikrosıvısal kanal tasarım düzen. GUVs bir rezervuar aşağıda giriş yolu ile alt sıvı tabaka (anahat kanal) girin. Bir filtre istenmeyen enkaz aygıttan engeller. O zaman 60 chambers (8 satır ve 15 sütun) bir dizi içeren her mesaj tek Şef yakalama için girdikleri (bkz: Ekle). Her oda bir denetim katmanı (dolgulu siyah kanalları) sıvı katmanının tarafından tahrik bir yüzük Vana içinde ayrılmış olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: mikrosıvısal cihaz. (A)fotoğrafı tek GUVs tuzak ve tamamen dış çözüm değişimi için kullanılan bir mikrosıvısal aygıt. Etiketler Çözümleri (1), 8 x basınç alıcılar eklemek için rezervuar basıncı kontrol ünitesi (2) için bağlı ve akışkan çıkış şırınga ve pompa (3) bağlı belirtir. Paneli (B) her 1 tüp düzenleyen mikrosıvısal aygıta bağlı 8 valf featuring basınç kontrol ünitesi gösterir. Burada vanalar #1 ve #2 açık ve dolayısıyla karşılık gelen halka vanaları kapalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: sıcaklık kontrol odası. (A) odasımontaj önce. (B) (yukarı bakacak şekilde) monte odası 2 mm kapak alt ve üst yapıştırılmış gözlüklü. Turuncu kauçuk rondela 0.5 mm içinde yükseklik ölçer ve gözlem kapalı Şef süspansiyon için 0.17 mm kapak makbuzu ile mühürlenmiş. Bu görüntüde bir sıcaklık probu kalibrasyon amaçlar (kahverengi fiber odası sağda çıkmadan) için eklenir. (C) sıcaklık probu olmadan ters bir mikroskop sahnede son montaj. Turuncu kauçuk rondela şimdi geldiðinden. Kauçuk örnek tutmak için yapışkan olduğunu. Işık epi-floresan ve parlak alan gözlemler etkinleştirme örnek iletilebileceğini unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: gözlem odası içinde dağınık şekilde çözülmüş sıcaklık veri elde edilen bir sıcaklık hassas boya FLIM ölçümleri tarafından (burada: 500 µM rodamine B) ⁴⁰. veri noktaları elde 0, 10, 30, 300 ve 400 µm alt kapak notu yukarıda. Kırmızı ve mavi veri noktası sıcaklığı 30 ° C ve 12 ° C, sırasıyla ayarlamak su banyosu için ölçüldü. Oda sıcaklığına equilibrate için su banyosu Soldaki siyah veri noktaları gösterir. Küçük ısı farklılıkları odası boyunca gözlenen ama 0.5 ° C (gri çubuklar) altında kaldı. Ara parça kalınlığı (yukarı bakın) göre yaklaşık 500 µm toplam odası yüksekliğidir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: miscibility sıcaklık konumlandırılması. Grafik tek tek veri noktalarını homojen (tek-sıvı devlet) ile 0,1 mol % DiIC₁₈ üç bağımsız rasgele örneklerinden katkılı oranında 30/40/30 DOPG/eSM/CHOI hazırlanan GUVs kısmını gösterir (N = 20-40). Hata çubukları temsil eden standart hata anlamına gelir. Veri noktaları hangi etki alanı karıştırma sıcaklığı T_mix sonucuna 6,8 (sürekli siyah çizgi) adımda açıklanan Boltzmann modeline (takip kırmızı sürekli çizgi apsis için) yarım en fazla sigmoidal göre monte edildi eğri üzerinde koordine (Kesikli siyah çizgi). İlk ve son değerleri (₁ ve₂) 0 ve 1, sırasıyla tespit edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 9: arızalı veziküller. Dev veziküller örnekleri 20/60/20 DOPG/eSM/CHOI hazırlanan ve adım tarafından geniş alanlı Floresans mikroskobu görüntüsü 4.2 ölçütlerine uymayan DiIC₁₈ ayarlarsanız 0,1 mol % ile katkılı. Yoğunluğu ekran aralıkları bireysel görüntülerin her zaman görülen vezikül floresan yoğunluğu için optimize. Ek membran malzeme ve kapsüllenmiş daha küçük veziküller varlığı nedeniyle, vezikül(a)faz durumunu açıkça tanımlanamaz. Bu dev. sivilce görünümünü lamellarity için güvenilir herhangi bir görsel denetim için izin vermez. Paneli (B) iç zar malzeme ile kalabalık olduğu bir vezikül gösteriyor. Sonuç olarak, dış vezikül membran Floresans sinyalinin lamellarity ve potansiyel etki alanları bir görselleştirme imkansız rendering onun iç sinyal ile eklenmiş olan. (C) üç farklı dev veziküller Floresans yoğunluklarda doğrudan karşılaştırma aynı görüntü yoğunluk aralığı içinde gösterilir. Bu görüntü dev multilamellar veziküller (1, 2) (3) Şef'e göre artan floresan sinyallerini tarafından tespit edilebilir gösterir. Burada, multilamellar gibi unilamellar dev veziküller sergi Lo + Ld faz ayrımı. Veziküller içinde tüm görüntüleri 40 x / 0.6 görüntüsü NA amaç. Ölçek çubukları 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 10: Lo + Ld faz kısmını ayrılmış en az üç bağımsız örnekleri üzerinde ortalama GUVs. Veziküller 30/40/30 DOPG/eSM/CHOI Lo + Ld bir arada bulunma bölgesinin sınırına yakın oluşan. Hata çubukları simetrik Sükroz koşulları için toplu iş toplu iş saçılma göstermektedir. Ordinat etiket çözümleri iç/dış veziküller açıklar; Sükroz: 210 mM sükroz; tuz: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 11: faz diyagramı DOPG, eSM, hazırlanan GUVs ve 210 mM sukroz (sukroz) ve 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (tuz) kullanarak farklı çözüm koşullar altında eşlenen CHOI. Şef faz devletler araştırdı Sükroz/Sükroz içinde (A; üst kısmında), sukroz/tuz (giriş/çıkış) (A; alt poligonal bölümünde), tuz/tuz (B; üst kısmında) ve tuz/sukroz (B; alt poligonal bölümünde). Karikatürler vurgulanan bölümler ve ilgili çözüm koşulları içinde baskın etki alanı model göstermektedir. Vezikül faz Birleşik alt poligonal bölümlerde temsil 20 x Şef seyreltme üzerine asimetrik çözüm koşullarda tespit edildi. Başvuru⁹uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 12: kapana GUVs aktarımında. Nerede yanlış bir etki görülebilir mesajlar ile yakınlığı nedeniyle küçük bir şef örneği (DOPG/eSM/CHOI 60/20/20). Alanını parlak ışık görüntü mesajları (gr gösterilen aktarılanEy) Şef (turuncu) confocal floresan görüntü ile overlaid. Mesaj alan parlak görüntüde bir kesişim deseni oluşturmak için görülmektedir. Mesaj (sağda) faz ayrımı görünümünü veren azalır Floresans sinyal yakın. Ölçek çubuğu 5 mikron =.

Şekil 13: faz Birleşik nerede açıkça görünür PDMS postalar yakalanan iki farklı GUVs örnekleri. (A)Lo + Ld aşama ayrılmış vezikül DOPG/eSM/Choi 60 yapılan/20/20. (B) A vezikül 40/30/30 Ld veya Lo Monofaze sergilenmesi yaptı. Confocal z-bolca bütün vezikül hiçbir (odak-) etki alanı mevcut olduğunu onaylamak için incelenmiştir. Mesaj kenarlarını (gri) görüntülerin sağ tarafta görülür. Ölçek çubuğu 5 mikron =.

Şekil 14: elde edilen faz davranış mikrosıvısal aygıt kullanan tam bir sıvı alışverişi sonra. Aynı Şef öncesi ve sonrası (A) simetrik tuz/tuz (giriş/çıkış) karşılığında çözüm için tuz/sukroz (giriş/çıkış) gösterilir (DOPG/eSM/CHOI 60/20/20, ölçek çubuğu olduğunu 2 µm) ve (B) simetrik Sükroz/sukroz (giriş/çıkış) Sükroz/tuz (ın/out) (DOPG için / eSM/CHOI 30/40/30, ölçek çubuk = 3 µm). Başvuru⁹uyarlanmış.

Tartışma

GUVs başarılı üretim aşamasında devlet gözlemler simetrik ve asimetrik yüksek tuzluluk koşullar altında için

Burada sunulan protokolleri yüksek tuzluluk tampon ve çözüm asimetri kompozisyonlar geniş bir yelpazesi üzerinde etkisi dolu GUVs membran faz durumunu değerlendirmek için bir strateji tanıtır. Bu amacı gerçekleştirme yolunda büyük zorluklardan biri yüksek tuzluluk arabellekleri dolu GUVs üretim oldu.

Biz başarıyla GUVs Sükroz çözüm ve yüksek serum tampon tarafından yatırılan lipit filmin ön hidrasyon adım ve vezikül büyüme için bir gecede son hidrasyon adım içeren basit bir spontan şişme yaklaşım, üretti. Lipid birikimi unilamellar veziküller vermeye bile lipid yayılmasını sağlamak için bir yapısı PTFE tabağa yapılması gerektiğini unutmamak gerekir. Ayrıca, lipit filmin bir homojen ve sıvı faz durumda nerede bir ısıda vezikül hazırlık sırasında her adımı gerçekleştirmek için önemlidir. Başka vezikül nüfus polydisperse bileşiminde olması ve son nüfus faz durumu analiz önyargı. Spontan GUVs verimi bir yandan küçük cilt olarak elde etmek için yeniden askıya alma imkanı sunan bir vezikül yığın şişlik için belirli iletişim kuralı vezikül dağıtıcıları son derece konsantre ve öte yandan asimetrik bir çözüm sağlar koşullar veziküller^8,28seyreltme en aza indirirken membran arasında. Vezikül seyreltme veya harici çözüm sırasında değişimi, iç ve dışında osmolarities Morfoloji değişiklikleri Osmolarite uyuşmazlıkları tarafından kaynaklanan ikna etmek ya da Lo + Ld faz ayrımı⁴¹ önlemek gibi Hipotonik durumunda eşleşen kalma ve esastır koşullar, vezikül patlama için neden olabilir.

Burada, PVA destekli şişme multilamellar veziküller vermiştir iken electroformation iletişim kuralları'nda yüksek tuzluluk çözüm en iyi duruma getirmek için girişimleri yok GUVs üretiminde sonuçlandı. Uzun hazırlık süreleri ve sonuçları vezikül kümeler halinde daha düşük kalite^10,17, şarj edilmiş veziküller başarılı imalatı spontan tarafından gerektirir rağmen şişme ek avantajları ile gelir. En az çaba yeterli verimleri istatistiksel toplu iş analizleri için sonuçlanan talepleri ve electroformation farklı olarak, hiçbir karmaşık ekipman veya optimizasyon gerekli. Ayrıca, hiçbir contaminations lipid oksidasyonu ile^42,43gözlemledim. Edebiyat göre veziküller lipid kompozisyonlar ve hangi onlar^7,17yetiştirilmiştir karşılık gelen hisse senetleri arasında hiçbir fark vardır. Ayrıca, vezikül oluşumu PTFE yüzey üzerinde herhangi bir contaminations şişme yöntemleri jel yardımıyla nerede yabancı molekülleri substrat²³tarafından tanıtıldı aksine eklenmesi sormaz. Electroformation aşırı vezikül seyreltme için asimetrik çözüm koşulları oluşturma ile ilgili daha fazla sakıncaları ile gelir. Electroformation tarafından üretilen gUVs genellikle homojen bir dağılım (aksine son derece yoğun vezikül Süspansiyon sırasında kendiliğinden şişlik oluşmuş bir yığın şeklinde) olarak mevcuttur. Harici çözüm herhangi bir seyreltme önemli ölçüde de veziküller sayısı sulandırmak. Ayrıca, bu gözlenmiştir Bu eser boyunca DOPG/eSM/Choi GUVs Sükroz electroformation tarafından üretilen yüksek tuzluluk arabellekte seyreltilmiş Eğer kararsız oldu. Floresan mikroskop slayt lipid yamalar dan onların görsel denetim mümkün oldu önce veziküller patlama gösterdi. Böyle istikrarsızlık veziküller ile karşılaştırıldığında bu kendiliğinden şişme¹⁰tarafından elde edilen electroformation tarafından hazırlanan bir yükseltilmiş membran gerginlik atfedilir.

Vezikül seyreltme asimetrik Şef çözüm koşulları oluşturmak için kolay ve hızlı bir yaklaşım olmakla birlikte, bu yalnızca bir kısmi çözüm dış Satım, yüksek bir kısmı de olsa için gerçekleştirir (burada: % 95, Resim 2), seyreltme, izler gibi çözüm şişlik devam edecektir. Harici çözüm Satım derecesini vezikül yığın şişme çözüm (Bölüm 2) ile birlikte pipetting ve çok fazla sulandrarak değil arasında bir ticaret-off seçimdir. Bu nedenle, biz başka bir yerde izin veren bir hızlı ve eksiksiz harici çözüm değişimi için Şef faz devlet gözlemler sırasında seyreltilmiş için yapılan faz devlet gözlemleri doğrulamak için ayrıntı³⁷ içinde tartışılan bir alternatif mikrosıvısal yaklaşım tanıttı veziküller. Simetrik asimetrik çözüm koşullar değiştirirken faz devlet varyasyonları gözlemleri sözleşmesinde olmak gerçekten de tespit edildi. Ayrıca, her iki yöntem burada nispeten hızlı gösterilir asimetrik çözüm koşulları (Ref.⁸Karşılaştır) oluşturmak ve yerel kompozisyon değişiklikler (başvurular^30,31karşılaştırmak) hiçbir bilinen riskleri ile gelmek için membran gerilim (karşılaştırma referans³²) artırın veya yerel Isıtma (karşılaştırma referans³³), alternatif yöntemler gelince giriş bölümünde bahsedilen. Mikrosıvısal yakalama sırasında vezikül içte ve dışta arasında ozmotik bir denge faz devlet yapıları yukarıda da belirtildiği gibi aynı zamanda hipertonik çözüm koşulları neden deflasyon önlemek için sadece temel kayma kapana GUVs neden olabilir değil Harici çözüm değişimi sonra mesaj yoluyla.

Spontan şişme doldurulmamış büyümeye başarıyla uygulanmış olsa bile veziküller DOPC/eSM/CHOI sistemden, diğer durumlarda, ücretleri yokluğu itme bireysel bilayers^{44 arasında ortaya çıkan eksikliği nedeniyle şişlik Şef bozabilen} . Önceden şişme süresini uzatma veya hantal lipid headgroups tanıtan bu sorunu⁴⁵counter. Ayrıca, vezikül istikrar sonra onların seyreltme çözümlerinde şişlik için kullanılandan farklı farklı lipit kompozisyonları ve biz burada araştırdık değil seyreltme medya için farklı olabilir. Ayrıca burada sunulan hazırlama yöntemi ile ortalama Şef çap ayarlama olanağı araştırılmalıdır değil. Ancak vezikül kompozisyon ve çözüm şişme gibi parametreleri sonuçlarını etkilemek. Alternatif yöntemler⁴⁶ uygulanması daha büyük veziküller lipidler ve burada kullanılan çözümler için verim, ancak, yöntemi ile ilişkili diğer dezavantajları ile gelebilir. GUVs simetrik ve asimetrik yüksek tuzluluk koşullarda üretmek için yukarıda açıklanan yaklaşım daha da farklı lipid kompozisyonlar oluşan ve farklı medyada dağınık veziküller çalışmaları için potansiyel bir araç sağlar. Biz bu olanakları keşfedilmeyi değil gibi gelecek çalışmalar nasıl genellikle Şef hazırlık ve seyreltme yöntemleri uygulanabilir gösterir.

Faz ayrımı değişen sıcaklıklarda gözlemleyerek

Farklı deneysel kurulumları GUVs değişen sıcaklıklarda çalışmaya uygun adlı biri yok. Bu ayarlar genellikle edebiyatı içinde ayrıntılı olarak açıklanan değildir süre, mevcut iş bu tür çalışmalar için geçerli bir temel derleme sunar.

_content "> kontrol ölçümleri göster bu şirket içinde tasarlanmış ve odası inşa sıcaklığı tam bir termostat tarafından kontrol edilir ve sıcaklık degradeleri odasının içinde içinde deneysel sıcaklık çözünürlüğü vardır. Deneysel termal durumların termostat okuma ile tutarlı sağlanmaktadır.

Şef faz Birleşik geniş sıcaklık aralığı boyunca değerlendirme sırasında sıcaklık değiştirildikten sonra gözlenen veziküller de equilibrated önemlidir. Bunu sağlamak için tek mümkün yolu histeresis için kontrol etmektir. Histeresis varsa, sıcaklık adımları azalma / veya denge kez arttı. Sıcaklık Bu eser denetiminde kurulmuş su bazlı bir termostat tarafından çalışma Sıcaklık aralığı 0 - 100 ° c için ideal bir konuma sahip sınırlıdır Bu Aralık diğer sıcaklık kontrol sıvı yağı kullanarak veya diğer kurulumları, örneğin istihdam Peltier aygıt genişletilebilir. Uygulamada, çalışma sıcaklığı da mümkün yoğunlaşma veya buharlaşma ile sınırlıdır. Ayrıca, oda sıcaklığında uzakta sıcaklıklar için kararlı duruma sıcaklık degrade boyunca gözlem odası oluşumunu daha büyük olasılıkla olur. Ayrıca, görüntüleme cihazları aşırı sıcaklıklarda zarar. Tipik sıcaklık aralıkları lipid vezikül çalışmaları (~ 10-50 ° C^7,9) için uygun gözlem ekipman hasar düşünülmesi gereken ancak genellikle değil bekleniyor.

Vezikül etki alanı gözlem eserler

Geniş alanlı Floresans mikroskobu kullanarak gözlem eserler için kaynakları vardır. Her şeyden önce bir vezikül faz Birleşik görsel denetim için uygulanan nesne maksimum çözünürlük r lipid etki alanlarına göre algılama sınırını belirler hususlara dikkat etmelidir:

Burada λ emisyon dalga boyu ve NA amacın sayısal diyafram olduğunu. Tipik bir amaç 40 x büyütme ve yeşil emisyon algılar 0,6 bir NA ışık yaklaşık 560 nm ~0.6 µm. dolayısıyla, belirli lipid karışımları farklı arasında yapılan veziküller faz durumları karşılaştırmak çalışmalar optik çözünürlük ulaşmak koşullar aynı amaç için aynı lipid karışımı kullanmalısınız.

Lipid etki sonucu olarak lipid fotoğraf-oksidasyon nedeniyle uzun bir pozlama uyarma ışık⁴¹geçtiği başka bir eserdir. Fotoğraf-hasar tercihen doymamış hidrokarbon lipid moieties üzerinde oluşur. Aslında, bazı lipid besteleri için başlangıçta homojen veziküller böyle etki alanı oluşumu burada uyarma ışık pozlama uzun bir süre sonra gözlenmiştir (~ 30 s). Bu konuda kalkması için uyarma ışık bir görüş alanı yalnızca bir kaç saniye faz durum değerlendirmesi için odaklı tutuldu. Bu nedenle, DiIC₁₈ bizim amacımız için uygun oldu. Diğer boya, ancak, çok daha duyarlı olabilir ve daha düşük uyarma yoğunluklarını ve daha kısa uyarma ışık pozlama süreleri ile ele alınması gerekebilir.

Veziküller pipet transferini mekanik makas stresten potansiyel etki alanlarını geçici olarak, böylece belirgin vezikül faz davranış bozan karışımları. Bazı toplu işlemler için farklı veziküller gösterdi farklı faz davranışları 0 dk ve 5 dk sonra pipet transfer mikroskop coverslip. Ayrıca kesme mikrosıvısal cihaz sıvı akış tarafından indüklenen stres⁴⁷karıştırma etki alanında neden olduğu gösterilmiştir. Veziküller gözlem önce denge için yeterli süreyi için rahatsız edilmeden bırakılmalıdır. Bu çalışma içinde mikrosıvısal aygıtta tuzağa veziküller vezikül yükleme ve çözüm alışverişi gözlem önce sonra 1 h için rahatsız edilmeden kalmıştı.

Yukarıda bahsedilen zorluklar yanı sıra hafif kırınım sınırı, Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi⁴⁸ veya süper çözünürlük mikroskobu teknikleri⁴⁹ gibi alternatif yöntemler tarafından dayatılan kısıtlama bazı önlemek için istihdam olabilir.

Sonuç ve outlook

Sunulan çalışma yüksek tuzluluk simetrik ve asimetrik çözüm koşulları etkisi membran faz ayırma analizi için sağlar bir dizi yöntem gösterir. Tüm sunulan yöntemleri diğer uygulamalar için uygundur. Mikrosıvısal aygıt örneğin etki alanı oluşumu ve kaybolması üzerine çözüm asimetri indüksiyon Kinetik çalışma için bir platform sağlar. Ayrıca, etki alanı görünüm tuz konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak bu şekilde muayene. Tüm yöntemleri de ilgi diğer çözümleri kullanarak faz davranışları üzerindeki etkisi bakmak için kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rak-gliserol), sodyum tuzu	Avanti Polar Lipids	840475C	metinde DOPG olarak kısaltılmıştır
tavuk yumurtası sfingomyelin	Avanti Polar Lipids	860061	eSM kolesterol olarak kısaltılır
(küçükbaş yünü, > %98)	Avanti Polar Lipids	700000	Chol
olarak kısaltılır1,1'-dioktadesil-3,3,3',3',3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat	Moleküler Problar	D-282	DiIC 18< / sub> olarak kısaltılır
Kloroform, HPLC derecesi (≥ %99,8)	Merck
NaCl (> %99,8)	Roth
HCl (% 37)	Roth
Tris (≥ %99,9)	Roth
Sükroz (≥ %99,5)	Sigma Aldrich
Parafilm
Dişli flakon 45x27 mm, 15 mL	Kimble		Soda düz tabanlı, beyaz vidalı kapaklı
pH metre	Mettler Toledo	MP220
Ozmometre	Gonotec	Osmomat030
Epi-floresan mikroskobu	Zeiss	Axio Observer D1
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Leica	TCS SP5
Objektif 40x, 0.6 NA	Zeiss	LD Achroplan
Objektif 40x, 0.75 NA	Leica	506174
Objektif 63x, 0.9 NA	Leica	506148
Mikroskop slaytı, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Glä ser
Kapak kayması, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Glä aser
Parafilm "M"	Bremix Esnek Ambalaj
Şırıngaları, 5 mL, 10 mL	Braun
0.45 & mikro; m şırınga filtresi	GVS Kuzey Amerika	Cameo 25AS, 1213723	Asetat, steril