Yöntem makalesi

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

DOI:

10.3791/56063

⸱

9 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel davranışlarını incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, hızlandırılmış video-ayrıntılı bir inceleme, birincil sinir kök hücreleri farklı nöronlar ve glia lineage ilerleme sırasında yürürlüğe giren aşamaları sağlayan mikroskobu Primer serebral korteks hücre için bir protokol açıklayın.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serebral korteks geliştirme sırasında progenitör hücrelerin yeni ataları veya postmitotic nöronlar oluşturmak için simetrik ve asimetrik hücre bölümler birkaç tur tabi. Daha sonra bazı ataları gliogenic kadere bağlı, astrocyte ve oligodendrocyte nüfus ekleme geçin. Primer serebral korteks hücre kültürleri, hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak, hücre bölünmesi modu ve progenitör hücre hücre döngüsü parametreleri kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek mümkündür. Benzer şekilde, kader postmitotic hücrelerinin hücre özgü floresan muhabir proteinler kullanarak veya immunocytochemistry sonrası Imaging incelenebilir. Daha da önemlisi, tüm bu özellikler belirli hücre tiplerinin üretimi için taahhüt ataları tanımlaması sağlayan tek hücreli düzeyinde analiz edilebilir. Gen ifadesinin manipülasyon da hücre özerk ve hücre özerk olayların çalışma izin transfection, viral aracılı kullanarak gerçekleştirilebilir. Son olarak, seçili proteinler simetrik ve asimetrik dağıtım sırasında bölünme ve kızı hücreleri kaderi ile korelasyon çalışma füzyon floresan proteinler kullanımına izin verir. Burada, birkaç gün kadar Primer serebral korteks fare hücreler için görüntü ve hücre bölünmesi, hücre döngüsünün uzunluğu ve kader yeni oluşturulan hücre modu çözümlemek için hızlandırılmış video-mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz de genlerin ilgi yönetmek veya sadece muhabir proteinler hücrelerle etiket için uygulanan progenitör hücre transfect için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir kök hücreleri (NSC) serebral korteks geliştirme sırasında neurons ve macroglial hücreleri oluşturur. Erken-corticogenesis, NSCs birkaç tur simetrik hücre bölünmesi geçmesi ve progenitör havuzu genişletin. Sonra NSCs nöronlar ara ürün1ile doğrudan veya dolaylı olarak oluşturmak için asimetrik olarak bölün. Sadece orta - için geç-corticogenesis,2,3,4astrocytes ve oligodendrocytes oluşturmak için ataları geçin. Ancak, hücre çoğalması ve farklılaşma gibi kader tarafından kısıtlanmış ataları benzersiz türde nöronlar ve macroglial hücreleri nesil katkısını kontrol tam mekanizmaları meselesi yoğun tartışmalar4,5,6kalır. Nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes oluşturmak için bireysel kortikal NSCs potansiyelini kapsamlı bir şekilde okudu vitro ve in vivo gibi sayısız teknikler kullanarak olmuştur: tek hücre kültürleri7,8,9,10,11,12,13; görüntüleme yaşamak yüksek yoğunluklu kültürler kültürler3,14,15' te görüntüleme canlı; dilim kültürler16,17,18içinde görüntüleme canlı; viral vektör-aracılı genetik yüksek yoğunluklu kültürler14,15,19,20,21' etiketleme klonal analizi; klonal analiz vivo içinde retrovirüsü22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33kullanarak; ve Transjenik hayvanlar34klonal analiz vivo içinde kullanma.

Bu tekniklerin herbirini artılarını ve eksilerini sunar. Örneğin, in vivo soy izleme bireysel kortikal ataları potansiyeli hakkında çelişkili sonuçlar için önde gelen topaklanmasını bölme hataları ve3, duyarlı olduğunu. Ayrıca, hem içinde in vitro ve in vivo çalışmalar progenitör hücrelerin erken zaman noktalarda etiketleme üzerinde temel ve posterior analizi hücre soy soy-ilerleme35sırasında hücre ölümü tespit edilmeden oluşumu tarafından etkilenebilir. Bu nedenle, tek NSCs potansiyelini analiz etmek için uygun bir sistem tüm hücreleri oluşturulan tanımlaması, hem de hücre kaderi lineage içinde uygun karakterizasyonu izin vermesi gerekir. Birincil hücre kültürü ve canlı görüntüleme bu ayarı sağlar. Tek hücre kültür ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak, tapınak ve ark. göstermiştir geçiş gliogenesis11neurogenesis üzerinden bireysel serebral korteks ataları soyundan içinde. Daha sonra nöronların farklı türleri tek kortikal progenitör12den oluşturulur göstermek için aynı sistem kullanılır. Ancak, bu sistemi önemli bir uyarı sunar: %1 kortikal ataları erken corticogenesis izole klonlar 4 veya daha fazla döl9oluşturmak sadece. FGF2 eklenmesinden sonra 8-%109' a 4 veya daha fazla hücre üreten hücreleri sıklığı artar. Yine de, bu hemen hemen tüm kortikal ataları proliferatif bu aşamada düşünüldüğünde çok küçük bir sayıdır. Ayrıca, kader-teknik FGF2 potansiyel etkileri36yönetilen olamaz. Bu sınırlamaları aşmak için biz hızla çoğalmak-in her ikisi Ventriküler (Pax6 ifade etme) destek yüksek yoğunluklu hücre kültürlerinde kullanılan ve subventricular (Tbr2-ifade) kortikal ataları15. Ayrıca, gerçek zamanlı gözlem bu kültürlerin çeşitli özellikler NSC lineage progresyon3,15bu koşullar altında hücre bölünmesi, hücre döngüsü uzatma, sinir hücreleri ve glia, diğerleri arasında oluşturmak için potansiyel tek hücre modu gibi çoğaltılabilir göstermiştir. Son zamanlarda, biz de CREB sinyalli fareler37nöronlarda olgunlaşmamış serebral korteks hücre yaşama etkiler göstermek için bu sistemi kullandık. Böylece, biz inanıyoruz Bu hızlandırılmış video mikroskobu birincil fare serebral korteksin yüksek yoğunluklu yetiştirilen hücrelerin hücre döngüsü progresyon hücresel ve moleküler mekanizmaları, hücre bölünmesi, hücre hayatta kalma ve hücre kader belirtimi modu çalışmaya bir araçtır güçlü ve erişilebilir. İkinci Transjenik hayvanlar, belirli hücre kaderi gerçek zamanlı38,39,40 tanımlaması veya immunocytochemistry3,38,41,42sonrası Imaging kullanım izin kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Burada, Primer serebral korteks hücre kültürü destekleyen NSCs yayılması ve nöronlar ve macroglial hücreleri sonraki nesil hazırlamak için adım adım bir protokol sağlar. Biz de tespit ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak tek hücre düzeyinde izlenen bireysel hücrelerin gen ekspresyonu işlemek için transfection retroviral aracılı kullanımı tartışıyorlar. Bu protokolü en başından sonuna kadar corticogenesis Rodents izole Primer serebral korteks hücreleri çalışma için kullanılabilir, ama bir kaç ayarlama göre sahne14gerekli olabilir. 2D kültürlerin time-lapse video mikroskobu kullanarak diğer kaynaklardan izole NSCs da okudu olabilir ama uygun kodlamayla sistemi cep davranışları vitro ve in vivo38,43karşılaştırarak tespit edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan canlı hayvanları içeren tüm deneyler, Ulusal ve Uluslararası yasalara göre yürütülür ve 009/2014 lisansı altında yerel Üniversite Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (CEUA/UFRN) tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki protokol steril bir ortamda gerçekleştirilir. Temel hücre kültürüne aşinalık beklenir.

1. Dorsolateral Telencefalon Mikrodiseksiyonu

  1. Diseksiyon ortamını hazırlayın (100 mL): 98.5 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 0.5 mL 5 M HEPES pH 7.4, 1 mL penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL ve 10.000 μg / mL).
  2. Diseksiyon ortamını filtreyle sterilize edin.
  3. İzofluran ile anestezi altında hamile bir fare C57 / Bl6'dan (Mus musculus) embriyonik gün 14 (E14) embriyolarını çıkarın.
    NOT: E0'ı vajinal tıkaç tespit günü olarak düşünün. Diseksiyon, hamile fareden çıkarıldıktan sonra en geç 1 saat içinde tamamlanmalıdır. Bu protokol aynı zamanda E11-E17 embriyoları için de geçerlidir.
  4. Steril koşullar altında histerektomi ile embriyoları çıkarın.
  5. Embriyoları soğuk diseksiyon ortamı (4 °C) olan bir Petri kabına aktarın.
  6. Uzunlamasına çatlak boyunca keserek beyinleri kafatasından çıkarın. Embriyo sayısı genellikle beş ila on arasında değişir. Her E14 beyni, progenitörler ve postmitotik nöronlar (1: 1 oranı) dahil olmak üzere yaklaşık 2 x 106 hücre verir
    NOT: Aşağıdaki adımlar için stereomikroskobu kullanın.
  7. Diseksiyon forsepsleri kullanarak meninksleri çıkarın. Yarım küreleri ayırmak için telensefalonu ortadan bölün. Dorsolateral telensefalonu izole etmek için, diseksiyon forsepsleri kullanarak dorsomedial eğri ve pallial-subpallial sınır boyunca kesin. Dorsolateral telensefalonu, tüm beyinler diseke edilene kadar soğuk diseksiyon ortamı (4 ° C) olan 2 mL'lik bir tüpe aktarın.

2. Hücre Ayrışması ve Kaplaması

  1. Proliferasyon ortamını hazırlayın (50 mL DMEM +% 10 FCS): 44 mL Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM), 5 mL Fetal Buzağı Serumu (FCS), 0.5 mL% 40 glikoz, 0.5 mL penisilin / streptomisin (10.000 ünite / mL ve 10.000 μg / mL). Proliferasyon ortamını filtreyle sterilize edin.
  2. Farklılaşma ortamı hazırlayın (50 mL DMEM +% 2 B27): 48 mL DMEM, 1 mL B27, 0.5 mL% 40 glikoz, 0.5 mL penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL ve 10.000 μg / mL). Farklılaştırma ortamını filtreyle sterilize edin.
  3. Dorsolateral telensefalonun E14 farelerinden alınan mikro diseksiyonundan sonra, dokuyu çökeltmek için tüpü toplanan doku ve soğuk diseksiyon ortamı (4 ° C'de 5 dakika, 340 x g) ile santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı bir pipetle çıkarın ve kimyasal sindirim için 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) Tripsin-EDTA (% 0.05) ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Tripsin aktivitesini durdurmak için 2 mL proliferasyon ortamı ekleyin.
  5. Diyaframı biraz daraltmak için bir cam Pasteur pipetinin ucunu bir gaz brülörü veya Bunsen brülörü üzerinde birkaç saniye parlatın. Pipeti, ucu kaplamak için FCS'yi aspire ederek yıkayın. Kabarcıklardan kaçınarak, hücreleri ateşle parlatılmış ve FCS kaplı bir Pasteur pipeti ile mekanik olarak ayırın.
  6. Hücreleri santrifüjleyin (4 ° C'de 5 dakika, 340 x g). Süpernatanı bir pipetle çıkarın. 1 mL proliferasyon ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
  7. % 0.4 Tripan Mavisi çözeltisi kullanarak hücre süspansiyonunun 1: 1 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Canlı olmayan hücreler mavi olacaktır. Bir Neubauer odası kullanarak canlı hücrelerin (boyanmamış) sayısını sayın.
  8. 106 hücre / mL elde etmek için hücreleri proliferasyon ortamında seyreltin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna (yaklaşık 2.5 × 105 hücre /cm2) 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2.
    'de inkübe edin NOT: Deney sırasında hareket edebilecekleri ve gözlem alanını değiştirebilecekleri için cam lameller kullanmayın. Alternatif olarak, cam alt doku kültürü plakaları kullanın.
    NOT: Hücre kültürü ile işlem görmüş çok tabaklı kullanmıyorsanız, plakalarınızı 37 °C'de 2 saat Poli-D-Lizin (50 μg/ml) ile ön işleme tabi tutmanız önemlidir. PDL ile muamele edilmiş plakalar, damıtılmış su ile yıkandıktan sonra 4 °C'de saklanabilir.

3. Retroviral Aracılı Transfeksiyon

NOT: Bu, yalnızca progenitör hücreleri transfekte etmek için basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücrelere ilgilenilen genleri eklemek için diğer viral vektörler veya kimyasal / elektriksel transfeksiyon kullanılabilir.

  1. Gen ekspresyonunu manipüle etmek ve hücreleri floresan raportör proteinlerle etiketlemek için, hücre kaplamasından 2 saat sonra ilgilenilen genlere sahip plazmitleri taşıyan retrovirüsleri ekleyin.
    NOT: Retroviral vektörler yalnızca bölünen hücrelerin genomuna entegre olur. Bu nedenle, proliferasyonun yüksek olduğu durumlarda hücreleri enfekte etmek önemlidir.
    NOT: Beta-aktin/CMV füzyon dizisini (CAG) ve bir dahili ribozomal giriş bölgesini (IRES) içeren bir plazmit ve ardından pCAG-IRES-GFP44 olarak adlandırılan yeşil floresan proteini (GFP) için kodlama dizisini kullandık. İlgilenilen genler, CAG promotörü ve IRES dizisi37 arasında klonlanabilir.
  2. İstenilen mL başına partikül sayısını elde etmek için retrovirüsü farklılaşma ortamında seyreltin. Her kuyucuğa retrovirüslü 500 μL farklılaşma ortamı ekleyin.
    NOT: Kullanılan retrovirüslerin miktarı titresine bağlıdır ve oyuk başına 50 ila 100 enfekte hücre elde etmek için hesaplanmalıdır. Bu titre, izole edilmiş GFP eksprese eden klonların tanımlanmasına izin verir ve bunların ilişkisi, faz kontrast görüntülerinin izlenmesi ile daha da doğrulanabilir (bkz. bölüm 6). Retrovirüsün titrasyonu, aynı hücre popülasyonu45 kullanılarak gerçekleştirilmelidir.

4. Hızlandırılmış Video mikroskobu

NOT: Bu adım, inkübasyon hazneli ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu gerektirir (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Retrovirüs enfeksiyonundan sonra, doku kültürü plakasını sıcaklık ve CO2 kontrolörlerine bağlı bir inkübatöre yerleştirin.
    NOT: Görüntülemeye başlamadan önce hazneyi 3 saat önceden ısıtmak, çekim sırasında kaymayı ve odak bozukluğunu en aza indirmeye yardımcı olabilir.
    NOT: Oda, hücreleri 37 °C ve% 5 CO2 sabit koşullarında tutmalıdır.
  2. Sıfır noktası (XY = 0) görevi görecek XY ekseninde bir konum seçin. Bu, bir referansın gelecekte, örneğin görüntüleme sonrası immünositokimyadan sonra pozisyonları tekrar bulmasına izin verecektir (bkz. bölüm 5).
    NOT: Plakaya sıfır noktasını belirlemek için referans olarak kullanılabilecek bir işaret çizilmesi tavsiye edilir.
  3. 10X büyütmede görüntülenecek konumları seçin.
    NOT: Retroviral olarak transfekte edilmiş hücreleri gözlemleme olasılığını artırmak için oyuk başına 10-15 pozisyon seçin.
    NOT: Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için uzun mesafeli yüksek büyütme hedefleri (20X veya 40X) kullanılabilir. Hedeflerin çalışma mesafesine bağlı olarak, cam tabanlı plakalar gerekebilir.
  4. Fototoksisiteyi azaltmak için her 5 dakikada bir faz kontrast görüntüleri ve her 3 saatte bir floresan görüntüleri elde edin. Deneyin ilk 3 saatinde odağı kontrol edin ve ayarlayın, çünkü sıcaklık dengelenirken değişebilir. Odağı günlük olarak kontrol edin ve ayarlayın.
    NOT: İlk 24 saatten sonra netlemenin stabil hale geldiğini gözlemliyoruz. Bununla birlikte, odağın izlenmesi tavsiye edilir. Alternatif olarak, yazılım tabanlı bir otomatik odaklama sistemi kullanın.
  5. 7 gün sonra alımı durdurun ve görüntüleme sonrası immünositokimyaya geçin (bkz. bölüm 5).
  6. İmmünositokimyadan sonra, mikroskop inkübatöründeki plakayı değiştirin, sıfır noktasını bulun, XYZ = 0'ı sıfırlayın ve deneyi kaydedilen pozisyonlarla yeniden yükleyin. Uygun floresan filtreleri kullanarak her konumun floresan görüntülerini elde edin.

5. Görüntüleme Sonrası İmmünositokimya

  1. Kültürde 7 gün sonra, hücre kültürünü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 Paraformaldehit (PFA) fiksatif ile sabitleyin.
    DİKKAT: PFA toksiktir ve kimyasal bir davlumbaz içinde kullanılmalıdır.
  2. 0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.
  3. PBS 0.1 M.
    'da% 0.5 triton ve% 10 normal keçi serumunda 4 ° C'de gece boyunca primer antikorlarda inkübe edin NOT: Nöronal fenotipi doğrulamak için anti-Mikrotübül İlişkili Protein 2 (MAP2) antikoru (fare IgG1, 1: 1,000) ve transdüksiyona uğrayan hücreleri etiketlemek için anti-GFP (tavuk antikoru, 1:500) kullanın. Progenitör veya glial hücreleri tespit etmek için başka antikorlar da kullanılabilir.
  4. 0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.
  5. İkincil antikorları PBS 0.1 M'de% 0.5 triton ve% 10 normal keçi serumunda seyreltin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Önerilen seyreltme: 1: 1.000.
  6. 0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.
  7. Çekirdek boyama için, hücreleri PBS 0.1 M'de 0.1 μg / mL 4 "6" -diamino-2-fenilindion (DAPI) ile 5 dakika inkübe edin.
  8. 0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.
  9. Hücreleri PBS 0.1 M'de tutun ve ışıktan koruyun (örneğin, plakayı folyo ile sarın).

6. Hücre İzleme

NOT: Burada, Malzeme Tablosu'nda verilen bağlantıda bulunan İzleme Aracı (tTt) yazılımını kullanarak hızlandırılmış video mikroskobu verilerini analiz etmek için ana adımları kısaca açıklıyoruz.

NOT: Görüntü alımı başka bir yazılımla gerçekleştirilirse, görüntü verilerini tTt yükleyicisinde bulunan tTt Converter ile içe aktarın (bağlantı Malzeme Tablosunda verilmiştir). Yalnızca png, tif veya jpg resim formatları kabul edilir. tTt Dönüştürücüyü başlattıktan sonra Şekil 1 A - B'de gösterilen adımları izleyin.

  1. tTt yazılımını başlatın ve bir kullanıcı adı seçin. "Kullanıcı ekle" ve "devam" düğmesine tıklayın (Şekil 2A). "TTTWorkFolder" (Şekil 2B) öğesini bulun ve seçin. Soy ağaçları, istatistikler ve dışa aktarılan görüntüler bu klasöre kaydedilecektir. Ardından, analiz edilecek deneyi seçin ve yükleyin (Şekil 2B).
  2. Görüntüler daha önce tTt Converter tarafından dönüştürülmüşse, "LogFileConverter" (Şekil 3A) üzerine tıklayın ve LogFileConverter penceresinde iki ardışık zaman noktası arasındaki saniye sayısını belirtin. "Tüm deney için günlük dosyalarını dönüştür" (Şekil 1C) üzerine tıklayın.
  3. tTt penceresinde görünen bir görüntü listesinde, manuel olarak yükleyerek veya programda görüntülenen seçeneği kullanarak istediğiniz görüntüleri seçin. Görüntüleri yükleyin (Şekil 3).
  4. Dosya > Yeni koloni > aç'ı seçin. İzlemeyi seçilen bir konumda başlatmak için "İzleme"ye ve ardından "İzlemeye Başla"ya tıklayın.
  5. Bir film penceresi görünecektir (Şekil 4). İzleme dairesini kullanarak hücreyi seçin ve 0 tuşuna basın. Yazılım bir sonraki kareye geçecektir. Fareyi kullanarak izleme çemberini izlenen hücrenin etrafına yerleştirmeye devam edin ve hücreye bir izleme işareti eklemek için her karede 0'ı tıklayın.
  6. Sırasıyla önceki veya sonraki kareye geçmek için 1 ve 3 tuşlarını kullanın. Bir parça işaretini silmek için, işaretlemek üzere doğru konuma tıklayın ve 0'a basın.
  7. Hücre bölünmüşse, "bölme" düğmesini seçin (Şekil 4'teki kırmızı dikdörtgen). Shift + D tuşlarına basarak bir alt hücreyi izlemeye devam edin. İkinci ek hücreyi izlemek için, hücre düzenleyicisinde hücreyi seçin ve F2 tuşuna basın.
  8. Hücre video mikroskobu sırasında öldüyse, "apoptoz" u seçin (Şekil 4'teki mavi dikdörtgen).
    NOT: Yazılım olayı "apoptoz" olarak etiketlese de, hücre ölümünden başka mekanizmalar sorumlu olabilir.
  9. Hücre gözlem alanından ayrılırsa veya komşu hücrelerle karışırsa ve izlemeyi engellerse, "kayıp"ı seçin (Şekil 4'teki yeşil dikdörtgen).
  10. İzlemeyi durdurmak ve daha sonra devam etmek için "kesme"ye tıklayın (Şekil 4).
    NOT: Hücre düzenleyici penceresinde, izleme sırasında bir ağaç oluşturulacaktır. Köken ağacını kaydetmek için Dosya'yı seçin > Geçerli ağaç > Kaydet'i seçin (Hücre düzenleyicisi penceresinde).
  11. Farklı bir hücreyi izlemeye başlamak için, farenin sağ tuşunu kullanarak hücreye tıklayın veya farenin sol düğmesini kullanarak hücreyi seçin ve İzlemeye Başla'> tıklayın.
  12. Filmi izleme verileriyle dışa aktarmak için yazılımın "izleme modunda" olmaması gerekir. İzleme modunu kapatmak için 6.10 adımını uygulayın. Film penceresinde Filmi Dışa Aktar>ı seçin. Biçimi, kare aralığını, saniyedeki kare sayısını ve bit hızını ayarlayın. "Dışa aktarmayı başlat" ı tıklayın.

7. Nicelikler

NOT: Video mikroskobu data46 kullanılarak çeşitli ölçümler yapılabilir. Burada, daha sonra "temsili sonuçlar" bölümünde örneklenen üç olasılığı açıklıyoruz.

  1. Farklı zaman noktalarında canlı olan hücre sayısını, bu zaman noktalarına ulaşılmadan önce üretilen toplam hücre sayısına tek tek clones37 içinde bölerek her hücre soyu için hücre sağkalımını ölçün.
  2. Simetrik progenitör (SP, her iki yavru hücre de çoğalmaya devam eder), asimetrik (A, bir yavru hücre çoğalmaya devam eder ve diğeri postmitotik olur) veya simetrik terminal (ST, her iki yavru hücre de postmitotik hale gelir) oranını ölçün15,38.
  3. Çoğalan hücrelerin nesilleri ve bölünmeleri arasındaki zaman aralığını hesaplayarak hücre döngüsü uzunluğunu ölçün15.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E14 embriyolarından izole edilen serebral korteks hücrelerinin birincil kültürleri hem progenitör hem de nöronal hücreleri içerir. Görüntüleme süresi boyunca, progenitörler birkaç tur hücre bölünmesi geçirir ve hücre sayısını arttırır (Şekil 5 ve Video Şekil 1).

Birkaç progenitör hücrenin retroviral aracılı transfeksiyonu, hücre klonlarının tanımlanmasını kolaylaştırır (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerçek zamanlı gözlem Primer serebral korteks hücre hücre çoğalması analizi, hücre bölünmesi, hücre döngüsünün uzunluğu, hücre farklılaşma ve hücre hayatta kalma3,14,15,37modu sağlar. Daha da önemlisi, bu tek hücreli soy, NSCs üzerinden ilerleme nöronlar3sırasında yürürlüğe giren ara aşama tanımlaması için önde gelen çalışma izin verir. Son olarak, gen ekspresyonu işleme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), BURUNLARI (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) tarafından desteklenen ve FAPERN (Fundação de Amparo Pesquisa Rio Grande do Norte).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Canlandırıcı Yaşam Teknolojileri14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penisilin / streptomisinGibco15140122
Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM)Gibco12400-024
Fetal Buzağı Serumu (FCS)Gibco10437028
GlikozGibcoA2494001
B27Gibco17504044
tripsin-EDTA (% 0.05)Gibco25300054
ParaformaldehitSigma16005
Keçi serumuSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
IsofluranSigma792632
anti-MAP2, fareSigmaM4403
anti-GFP tavukAves0511FP12
DAPISigmaD9542
Keçi anti-fare alexa 594InvitrogenA11005
Keçi anti-tavuk alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zürih
Hücre gözlemci mikroskobuZeiss
Pasteur pipet
PBS
İzleme Aracı (tTt) yazılımıhttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmlindirme bağlantısı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zaman Atlamal Video mikroskopiH cre B l nmesi AnaliziH cre D ng s S resiProgenit r H cre KaderiViral Arac l TransfeksiyonFloresan Raporcu ProteinlerSimetrik Asimetrik B l nmeTek H cre D zeyinde AnalizN ral K k H creler

İlgili makaleler