Method Article

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelecek nesillere biyolojik bilgilerin kodlama genellikle DNA dizisi değişiklikler yoluyla elde edilir. Uzun ömürlü devralma protein biçimi (yerine sıra) kodlanmış uzun paradigma kayması ama nadir olarak incelendi. En iyi karakterize epigenetik gibi öğeleri yeni fenotipleri kalıtsal tezahürü sürücü kendi kendine montaj bir davranış sahip Prionlar örnekleridir. Birçok arketipik Prionlar çarpıcı bir N/Q-zengin sıra önyargı görüntülemek ve amiloid bir sürüye bir araya. Bu sıradışı özellikler yeni prion protein tanımlamada çoğu tarama çabaları bildirdi. Ancak, en az üç bilinen Prionlar (kurucu prion, PrPScde dahil olmak üzere) bu biyokimyasal özellikleri liman değil. Biz bu nedenle kitlesel eylem bir özelliğine göre protein bazlı devralma kapsamını soruşturma için alternatif bir yöntem geliştirdik: hangi bir öz-şablon uyum elde frekans prion protein geçici overexpression artırır. Bu yazıda Maya ORFeome kapasitesi protein bazlı devralma temin için analiz etmek için bir yöntem açıklanır. Bu stratejiyi kullanarak, daha önce bulduk > Maya proteinlerin % 1 uzun ömürlü, sağlam, ve genetik mutasyon daha sık ortaya çıkan biyolojik özellikleri ortaya çıkması yakıt. Bu yaklaşım içinde yüksek üretilen iş karşıdan karşıya tüm ORFeomes veya belirli genetik ağlar veya çevresel uyaranlara için hedeflenen tarama paradigma olarak istihdam edilebilir. Sadece ileri genetik ekranlar çok sayıda gelişimsel ve sinyal yolları tanımladıkça, bu teknikleri protein bazlı miras biyolojik süreçlerin etkisini araştırmak için bir yöntem sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik sistemlerin sık protein bereket geçici dalgalanmalar deneyim. Bunlar bir organizmanın veya gelecek nesillerin fenotip şekillenmesinde kalıcı bir etkisi olup belirsizdir. Bu Biyoloji en iyi bilinen örnekleri proteinlerin, genom yapılmaksızın kalıtsal özellikleri ortaya çıkması sürücü Prionlar nadir bir sınıf içerir. Bunun yerine, bu proteinaceous ve içindefectious parçacıklar fenotipleri protein conformation1,2için kendi kendini devam ettiren değişiklikleri yoluyla iletmek. Bu tür devralma alışılmadık kalıtım kalıpları bir yıkıcı nörodejeneratif hastalığın nedeni olarak keşfedilmiştir. Ancak, mantar memeliler3,4,5,6,7,8,9,10 ' a kadar çeşitli organizmalar çalışmalarda beri deli dana gibi öğeleri adaptif değer görüşmek indirdik. Yine de, Prionlar büyüleyici bir nadir biyolojik gariplik olarak incelendi var.

Protein bazlı devralma karakterizasyonu uzun örnekler küçük bir kümesi tarafından kısıtlanmış çünkü bu egemen bilgelik kısmen düzenlenmektedir. Son sistematik tarama çabaları bu resim önemli ölçüde yakıt deli dana gibi konformasyon dönüşüm kapasitesine sahip birkaç yeni bona fide Prionlar11 ve yaklaşık iki düzine protein etki alanları12 tespit ederek genişletilmiş. Ancak, bu yaklaşımlar genellikle güçlü amino asit dizisi önyargıları üzerinde odaklanmıştır çünkü keşfedildi Prionlar kurucu Maya Prionlar [PSI+]13,14, [URE3]15ve [RNQ+]11,16biyokimyasal özelliklerini paylaşır. Bu içerir: asparagine (N) ve glutamin (Q), 2) bir amiloid [PRION+] conformation17,18,19, derlemeye uzun polimer menziller bakımından zengin olan ve 3) tam güven disaggregase kız13,20,21anneden sadık yayma için Hsp104 işlev 1) Modüler etki alanları. Dahil olmak üzere, birçok bona fide Prionlar, [GAR+], [Het-s] ve hatta orijinal prion (PrPSc), böyle sıkı kriterleri altında özledim. Belki daha da önemlisi, herhangi bir roman mekanizmaları protein bazlı devralma22yakalamak mümkün olacaktır. Böylece, bu tür olayların gerçek biyolojik etki derecesini daha önceden kabul doğada çok daha yaygın olabilir.

Bu soruyu araştırmak için bir yüksek üretilen iş, Proteom çapındaki strateji istihdam edildi. PrPSc, [GAR+], dahil olmak üzere tüm Prionlar damgasını ve [Het-s], nedensel proteinlerin geçici overexpression kuvvetle deli dana Alım15,23,24,25,26oranını arttırır. İstikrarlı protein bazlı, epigenetik Birleşik geçici bireysel proteinlerin overexpression inducing tarafından başlatılan Eğer biz sistematik olarak sormak, karşıdan karşıya tüm ORFeome, Maya için bu özelliği kullandı. Bu protein overexpression fenotipleri27değiştirebilirsiniz de bilinir. Ancak, birçok nesiller ilk overexpression sonra yüzlerce kalıtsal fenotip bir değişiklik geçici onların aşırı üretimi üretir çünkü prion proteinleri alışılmadık. Daha önce bu özelliğin avantajlarından, hem de genetik öğeleri protein bazlı heritably fenotipik manzara genom28değiştirmeden yeniden kablolama özelliği olan proteinler onlarca tanımlamak için sıradışı kalıtım kalıpları aldı. Bazı rağmen tespit proteinler daha önce bilinen Prionlar, en yeni formlar protein bazlı miras ortaya çıkarmak için bu yaklaşım gücünü vurgulayan değildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İlk Aşırı İfade

  1. Daha önce YPD sıvısında (10 g maya özütü, 20 g pepton ve 1 L başına 20 g glikoz) büyütülen maya hücrelerini (bu durumda, BY4741 MAT a haploidler) FLEXGene ORFeome kütüphanesinden istenen aday yapılarla dönüştürün (URA3 işaretli sentromerikplazmit omurgasında galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altındaki maya ORF'leri, pBY01129).
  2. Biyolojik kopyalar olarak hizmet etmek üzere bu dönüşümlerden dört ayrı koloni seçmek için otoklavlanmış kürdan kullanın. 96 oyuklu plakalarda 150 μL SRaffinose-URA'da (0.74 g CSM-URA, amino asitsiz 6.7 g maya azot bazı ve 1 L başına 20 g rafinoz) 48-72 saat büyütün. İlk ORF'den kolonileri tüm plakaların A1 kuyusuna, ikinci ORF'den kolonileri tüm plakaların A2'sine aşılayın, vb.
    NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm büyüme adımları 30 °C'de ve atmosferik CO2 (407.05 ppm) seviyelerinde gerçekleştirilir.
  3. Kültürlerin doymuş olduğunu onaylayın (her oyuğun dibinde gözle görülebilen hücreler) ve her 96 oyuklu plakadan 1 μL'lik 1:4'lük bir diziyi 45 μL SGal-URA (0.74 g CSM-URA, Amino asit içermeyen 6.7 g maya azot bazı ve 1 L başına 20 g galaktoz) kuyucuk başına.
    NOT: Bu, her ORF'nin 4 biyolojik kopyasının kare şeklinde dizildiği bir kompozit plaka oluşturur.
  4. Aynı zamanda, oyuk başına ilgilenilen stresörlerle (örneğin, 20 mM'de manganez klorür) 45 μL SGal-URA içeren ayrı 384 oyuklu plakalar hazırlayın. Bu plakayı adım 1.3.
    'deki gibi aşılayın NOT: Fenotipik tespit için en büyük dinamik aralığı elde etmek için, belirli bir stresörün LD2 konsantrasyonu etrafında 50 katlı bir seyreltme serisi önerilir. Bu, hem artmış hem de azalmış büyümeyi gözlemlemek için optimum konsantrasyonu belirlemek için önceden yapılabilir.
  5. Son bir paralel kontrol olarak, üçüncü bir 384 oyuklu plakayı aynı şekilde, plazmit ekspresyonunu indüklemeyecek ortama dahil edilen aynı stresör ile aşılayın. Plakanın oyuk başına 45 μL SD-URA (0.74 g CSM-URA, amino asit içermeyen 6.7 g maya nitrojen bazı ve 1 L başına 20 g glikoz) içerdiğinden ve adım 1.3 ve 1.4'teki gibi aşılandığından emin olun.
  6. Hücreli plakaları hemen bir mikroplaka istifleyiciye yerleştirin ve OD600'ü oda sıcaklığında ve atmosferik CO2'de (407,05 ppm) istifleyicilerle donatılmış bir mikroplaka okuyucu ile ölçerek 72 saatlik sürekli döngü protokolünü ayarlayın.
    Not: Büyüme ölçümünün sıklığı, çalışmada kullanılan plakaların sayısına (nihai olarak araştırmacının araştırmak istediği gen ve koşulların sayısı ile belirlenir) bağlı olacaktır. Ne kadar çok plaka kullanılırsa, plaka okuyucunun bir döngüyü tamamlaması o kadar uzun sürer ve dolayısıyla ölçümler arasındaki süre o kadar uzun olur (plaka başına ölçüm süresi, kullanılan enstrümantasyona bağlı olarak ~ 45 s'dir).
  7. Büyüme ölçümlerinden sonra, SGal-URA ile indüklenen kültürlerin (yani, protein aşırı ekspresyonu yaşayanların) kuyu başına 1 μL'sini, oyuk başına 45 μL SD-URA içeren yeni 384 oyuklu plakalara aktarmak için aynı sıvı işleme robotunu kullanın (plazmidin protein ekspresyonuna izin vermeyen ortam).
    1. Paralel olarak, stresörlerin varlığında SD-URA'da büyütülen kültürlerden (yani, adım 1.5'teki kültürlerden) oyuk başına 45 μL SD-URA içeren ikinci bir 384 oyuklu plaka setinin benzer aşılamalarını gerçekleştirin.
    2. Plakaları nemlendirilmiş bir odada (yani, içinde nemli bir kağıt havlu bulunan sızdırmaz bir plastik kutu) doygunluğa ulaşana kadar 30 °C'de 48 saat büyütün.
  8. Önceki adımdaki plakaları alın ve 45 μL SD-URA içeren 384 oyuklu plakalarda kuyu başına 1 μL'yi yeniden aşılayın. Ardından, stresör ile 45 μL SD-URA içeren ayrı bir 384 oyuklu plakaya aynı kaynak plakasından oyuk başına 1 μL'lik ayrı bir reinokülasyon gerçekleştirin.
    NOT: Bu, protein aşırı ekspresyonu durduktan sonra bir stres etkenine karşı duyarlılık/direnç fenotiplerinin devam edip etmeyeceğini belirleyecektir.
  9. Hücreli plakaları hemen bir mikroplaka istifleyiciye yerleştirin ve OD600'ü oda sıcaklığında ve atmosferik CO2'de (407.05 ppm) bir mikroplaka okuyucu ile ölçen 48 saatlik sürekli döngü protokolünü ayarlayın.
  10. Plaka okuyucu yazılımını kullanarak OD600 ölçümlerine karşı zamanı bir XY tablosu olarak dışa aktarın. Her biyolojik çoğaltma için OD600'ün sütunlarını gruplandırın ve ortalamayı hesaplayın. Büyüme eğrileri oluşturmak için OD600'e karşı bir XY zaman grafiği oluşturun.
    1. Geçmişte aşırı ekspresyona maruz kalmış kültürlerin büyüme oranlarını (yani, SD-URA'da yeniden aşılamadan önce başlangıçta galaktoz içeren ortamda indüklenenler) ve maruz kalmamış kültürlerle (yani, glikozda çoğaltılanlar) karşılaştırın, daha önce açıklandığı gibi30.
  11. Atalardan kalma protein aşırı ekspresyonuna bağlı olarak, belirli bir stres etkenine yanıt olarak önemli büyüme farklılıkları gösteren kültürler için, her biyolojik kopyadan 1 μL alın, 10 mL su ile seyreltin ve daha sonra 5-FOA içeren plakalara 50 μL plaka (0.74 g CSM-URA, 1 g 5-FOA, 50 mg urasil, Amino asit içermeyen 6.7 g maya azot bazı, 20 g glikoz ve litre başına 20 g agar). 30 °C'de 3 gün boyunca büyütün.
    1. Bu, plaka başına çok fazla veya çok az koloni ile sonuçlanırsa, seyreltme faktörünü buna göre ayarlayın.
      Not: 5-FOA, urasil biyosentez yolu ile toksik bir ara maddeye dönüştürülür. Bu, ilk adımda dönüştürülen URA3 işaretli ekspresyon plazmidinin kaybına neden olacaktır.
  12. Otoklavlanmış kürdan ile 8-32 tek koloniyi seçin ve bunları 150 μL SD-CSM içeren 96 oyuklu plakalara sabitleyin. 30 ° C'de nemlendirilmiş bir odada 48-72 saat doygunluğa kadar büyütün. Bu kültürleri, adım 1.11'deki stresörler olsun ve olmasın, 150 μL SD-CSM içeren iki yeni 96 oyuklu plaka setini aşılamak için kullanın.
  13. Plakaları bir mikro plaka istifleyiciye yerleştirin ve OD600'ü 48 saatlik sürekli bir döngüde ölçmek için protokolü ayarlayın.
  14. Verileri adım 1.10'daki gibi analiz edin ve adım 1.10'da görülen önemli büyüme farklılıklarının plazmit kaybından sonra da korunduğunu onaylayın.
    NOT: Bu hücreler, protein bazlı kalıtımın göstergesi olabilecek kararlı fenotipik durumları barındırır.
  15. Protein bazlı kalıtımın klasik ayırt edici özellikleri için indüklenmiş fenotipleri koruyan hücreleri test edin (aşağıya bakınız).

2. Prion Benzeri Kalıtım Testleri

  1. Refakatçi aracılı "kürleme"
    1. Hsp104 şaperon bağımlılığını test edin.
      1. Stabil bir fenotipik durumu barındıran bir maya suşunun bir kolonisini seçin, 3 mM GdnHCl içeren bir YPD plakasında (10 g maya özütü, 20 g pepton, 20 g glikoz ve 1 L başına 20 g agar) tek kolonilere çizgi çizin ve 30 ° C'de 3 gün boyunca büyütün. Paralel olarak, aynı şekilde kontrol olarak YPD + 3 mM GdnHCl'deki saf bir suştan tek kolonilere bir koloniyi çizgileyin.
      2. 3 mM GdnHCl içeren taze YPD plakalarında 2 kez daha tekrarlayın.
      3. GdnHCl'ye maruz kalma, minyon hücrelerin ortaya çıkma sıklığını artırabileceğinden, GdnHCl üzerinde 3 geçiş geçirmiş birden fazla koloni seçin ve 7 gün sonra YP-Gliserol plakalarında (10 g maya özütü, 20 g pepton, 20 mL gliserol ve 1 L başına 20 g agar) görünür kolonilere dönüşme yeteneklerini inceleyerek fonksiyonel mitokondriyal solunumu kontrol edin.
      4. YP-Gliserol plakalarından birden fazla koloni seçin ve "kürlenmemiş" ve naif (yani, fenotipik durumu barındırmayan izojenik hücreler, örneğin BY4741 MATa haploidler) ile karşılaştırıldığında stresör varlığında büyümeyi kullanarak kararlı fenotipik durumların korunmasını test edin.
    2. Hsp70 şaperon bağımlılığını test edin.
      1. Bir plazmit yoluyla "Tedavi".
        1. Güçlü bir kurucu promotöründen (GPD) Hsp70 (K69M)25,31'in baskın bir negatif alelini ifade eden URA3 işaretli plazmitlerle hem saf hücreleri hem de kararlı fenotipik durumları barındıran hücreleri dönüştürün.
        2. Her biri için tek transformatörler seçin, bir SD-URA plakasında (0.74 g CSM-URA, amino asitsiz 6.7 g maya nitrojen bazı, 20 g glikoz ve 1 L başına 20 g agar) tek kolonilere çizgi çizin ve 30 ° C'de 3 gün boyunca büyütün ve atmosferik CO2.
        3. Bu geçişi SD-URA plakalarında 2 kez daha tekrarlayın.
        4. Birden fazla koloni seçin ve plazmidi ortadan kaldırmak için 5-FOA plakalarında tek kolonilere çizgi çizin.
        5. Her izolat için birden fazla tek koloni seçin ve adım 1.13'te tarif edilene benzer şekilde kararlı fenotipik durumların tutulmasını (veya kaybını) test edin.
      2. Genetik geçiş yoluyla "tedavi".
        1. Çapraz BY4741 MAT, kararlı fenotipik durumları barındıran bir haploid suş ve zıt çiftleşme tipindeki naif suşları (bu durumda, BY4742 MATα) dört maya Hsp70 paralogunun ikisinde genetik delesyonları barındırır (ssa1Δ ssa2Δ).
          NOT: Bu suş, Hsp70 şaperon fonksiyonunda eksiktir.
        2. SD-LYS-MET (0.74 g CSM-LYS-MET, amino asit içermeyen 6.7 g maya nitrojen bazı, 20 g glikoz ve 1 L başına 20 g agar) üzerinde tek kolonilere çizgi çizerek diploidlerin büyümesini seçin.
        3. Tek diploid kolonileri seçin ve 8 mL ön sporülasyon ortamında (% 0.8 maya özütü,% 0.3 pepton,% 10 dekstroz ve 100 mg / L adenin sülfat) 30 ° C'de 24 saat büyütün.
        4. Kültürleri 3.000 xg'de 3 dakika döndürün, ön sporülasyon (SPO öncesi) ortamı aspire edin ve peletleri bir kez steril suyla yıkayın.
        5. Peletleri 2 mL sporülasyon ortamında (% 1 potasyum asetat,% 0.1 maya özütü,% 0.05 glikoz ve% 0.01 amino asit geri karışımı (2 g histidin, 10 g lösin, 2 g lizin ve 2 g urasil)) yeniden süspanse edin. 5 gün boyunca 25 ° C'de büyütün.
        6. Kültürleri 30 °C'ye taşıyın ve 48 saat daha inkübe edin.
        7. Bir ışık mikroskobu32 kullanarak tetradların varlığına bakarak sporülasyonun verimliliğini değerlendirin.
        8. 40 μL kültür alın, 1.5 mL'lik bir tüpte 3.000 xg'de 1 dakika döndürün ve eşit hacimde zimolyase enzim karışımı (1 M sorbitol, 0.1 M EDTA ve 10 mg / mL zimolyas, 100T) içinde yeniden süspanse edin
        9. 25 °C'de 5 dakika inkübe edin.
        10. Çok kuru, çok düz bir YPD agar plakasına 10 μL sindirilmiş kültür uygulayın ve kültürün plakadan düz bir çizgide yavaşça yayılmasına izin verin.
        11. Plakaların laminer akış başlığında en az 30 dakika kurumasını bekleyin.
        12. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, sporları tetradlara ayırın ve plaka üzerine yerleştirin.
        13. Bireysel haploid sporların koloniler halinde büyümesine izin verin ve SD-HIS-LEU (0.67 g CSM-HIS-LEU, amino asit içermeyen 6.7 g maya nitrojen bazı, 20 g glikoz ve 1L başına 20 g agar) plakalarında büyüme yeteneklerini test edin, bu da her iki genetik delesyonu (ssa1Δ ssa2Δ) barındırdıklarını gösterir.
        14. Hsp70 eksikliği olan arka plandaki fenotipik durumun bakımı için her birini, adım 1.13.
          'da açıklandığı gibi test edin NOT: Bu sporları, restore edilmiş Hsp70 fonksiyonuna sahip vahşi tip bir suşa geri çaprazlamak, prion fenotipini eski haline getirmemelidir.
  2. Mendel dışı kalıtım testi.
    1. Kararlı fenotipik durumları ve izojenik naif kontrolleri barındıran bir haploid suş olan BY4741 MAT'ı, zıt çiftleşme tipindeki izogenik naif bir suşla çaprazlayın (bu durumda, BY4742 MATα).
    2. SD-LYS-MET çift bırakma ortamında tek kolonilere çizgi çizerek diploidlerin büyümesini seçin.
    3. Tek diploid kolonileri seçin ve 8 mL ön sporülasyon ortamında 30 ° C'de 24 saat büyütün.
    4. Yukarıda açıklandığı gibi 2.2.2.3-2.2.2.12 adımlarını tekrarlayın.
    5. Bireysel haploid sporların koloniler halinde büyümesine izin verin ve her birini, adım 1.13.
      'de olduğu gibi, büyüme testini kullanarak mayoz bölünme yoluyla fenotipik durumun sürdürülmesi için test edin Not: Prionların bir başka tanımlayıcı özelliği, orijinal rasgelite proteininin çıkarılması yoluyla kalıtsal olarak elimine edilebilmeleridir. Bu nedenle, bir prion suşunun, orijinal indüklenmiş proteinin genetik delesyonunu barındıran bir suşla benzer şekilde çaprazlanması, delesyonu miras alan sporlardaki prion fenotiplerini iptal edecektir. Ayrıca, silinen genin prion fenotipini tezahür ettirmesi gerektiği, ancak prionun kendisini yaymadığı takdirde, prionun böyle bir mutantta prionun "kriptik" bir durumda tutulmasının mümkün olduğunu unutmayın. Bu iki olasılık arasında ayrım yapmak için, sporları naif bir vahşi tip suşuna geri çaprazlayın ve prion fenotipinin, genin işlevinin geri yüklendiği diploid bir genetik arka planda yeniden ortaya çıkıp çıkmadığını test edin.
  3. Sitülasyon.
    1. İlk BY4742 alıcı türünü oluşturun.
      1. Dönüşüm yoluyla, çiftleşme sırasında nükleer füzyonu önleyen kusurlu bir KAR aleli (kar1-15) ekleyin23.
      2. YPD suyunda tek bir koloniyi% 0.25 etidyum bromür ile aşılayarak bu suşu "minyon" (yani mitokondriyal solunum için yetersiz) yapın.
      3. Kültürü 30 ° C'de geç üstel / durağan faza (OD600 ~ 1) kadar büyütün.
      4. Taze YPD'de 1: 1.000'i% 0.25 etidyum bromür ile seyreltin ve iki kez tekrarlayın.
      5. Kültür geç üstel/erken durağan faza (OD600 0.8-1.2) ulaştığında, steril suda 1:10.000 seyrelterek ve bir YPD plakası üzerine 50 μL kaplayarak tek kolonilere plakalayın. 30 ° C'de 3 gün büyüdükten sonra, birden fazla koloni seçin ve 7 gün sonra YP-Gliserol plakalarında görünür kolonilere dönüşme yeteneklerini inceleyerek her birini solunum yetersizliği açısından test edin.
    2. BY4742'ye ilk sitülksiyonu gerçekleştirin.
      1. Stabil bir fenotipik durumu barındıran donör BY4741 suşunun hücrelerini, bir YPD agar plakasının yüzeyindeki naif BY4742 kar1-15 alıcı suşunun hücreleri ile karıştırın.
      2. 30 ° C'de ve atmosferik CO2'de (407.05 ppm) 24 saat boyunca büyütün ve gliserol içeren metiyonin bırakma ortamına aktarın (SGly-MET: 0.74 g CSM-MET, amino asitsiz 6.7 g maya azot bazı, 20 mL gliserol ve 1 L'de 20 g agar).
        NOT: Bu, sitoplazmik değişim yoluyla fonksiyonel mitokondrinin restorasyonuna izin vermenin yanı sıra her iki BY4742 nükleer belirtecini de seçer.
      3. 3-5 gün sonra, birden fazla tek koloni seçin ve SD-MET üzerinde başka bir seçim turu yapın (0.74 g CSM-MET, amino asitsiz 6.7 g maya azot bazı, 20 g glikoz ve 1 L başına 20 g agar).
      4. Paralel olarak, SD-LYS-MET ortamından geçerek kolonilerin diploid olmadığını doğrulayın.
    3. Ters sitodüksiyonlar gerçekleştirin.
      1. Yeni donör suşları (bu sefer, başarılı BY4742 kar1-15 sitodüktanları) YPD agar üzerinde minyon saf BY4741 hücreleri (yukarıdaki gibi üretilen) ile karıştırın.
      2. Lizin içermeyen gliserol ortamında BY4741 alıcı nükleer belirteçlerinin seçilmesi dışında, daha önce tarif edildiği gibi (adım 2.3.2.1-2.3.2.4) sitülasyonları tekrarlayın (SGly-LYS: 0.74 g CSM-LYS, 6.7 g maya nitrojen bazı amino asitler olmadan, 20 mL gliserol ve 1 L başına 20 g agar).
      3. Birden fazla sitodüktan seçin ve daha önce adım 1.13'te olduğu gibi büyüme testini kullanarak stabil fenotipik durumların korunmasını test edin.
  4. Protein dönüşümü.
    1. Lizatı hazırlayın.
      1. 30 ° C'de 18 saat boyunca YPD'de kararlı fenotipik durumları barındıran 50 mL hücre büyütün.
      2. Kültürleri 4 dakika boyunca 3.000 x g'da pelet haline getirin ve ardından iki kez yıkayın: bir kez otoklavlanmış H2O ve daha sonra 1 M sorbitol içinde.
      3. Hücreleri 200 mL SCE tamponunda (1 M sorbitol, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 mM sodyum sitrat ve 50 mL başına 1 mini-EDTA içermeyen proteaz inhibitör tableti, pH 5.8) 50 U / mL maya litik enzimi 100T ile yeniden süspanse edin.
      4. Karışımı 35 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      5. Hücreleri 20 kHz'de ve% 20 yoğunlukta 10 saniye boyunca sonik bir dismembrator ile buz üzerinde sonikleştirin.
      6. Hücre kalıntılarını 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleme ile çıkarın.
      7. Süpernatanları temiz bir tüpe taşıyın ve RNase I ve biyotinillenmiş DNaz'ı 3 kat fazlalıkta (aktivite birimleri tarafından belirlendiği gibi) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      8. Fazla streptavidin-agaroz boncukları ekleyerek, 5 dakika inkübe ederek ve 1.5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyerek DNaz I'i çıkarın.
      9. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
    2. Alıcı sferoplastiyi hazırlayın.
      1. YPD'de 5 mL saf alıcı hücreyi orta üstel faza kadar büyütün (OD600 0.5-1 arasında değişir).
      2. Santrifüjleme ile hasat edin (4 dakika boyunca 3.000 x g) ve 4 kez yıkayın: iki kez H2O'da ve iki kez 1 M sorbitolde.
      3. Hücreleri 200 U / mL maya litik enzimi içeren 1 M sorbitol içinde yeniden süspanse edin ve hücre duvarlarını sindirmek için 35 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
      4. Elde edilen sferoplastları 5 dakika boyunca 600 x g'da hafif santrifüjleme ile hasat edin ve 1 mL 1 M sorbitol ile ve ardından tekrar 1 mL STC tamponu (1 M sorbitol, 10 mM Tris pH 7.5 ve 10 mM CaCl2) ile yıkayın.
      5. Yıkanmış sferoplastları 50 μL STC tamponunda tekrar süspanse edin.
        NOT: Pipet ucunun son ~0.7 cm'sini kesmek için makas kullanın; Bu, daha geniş bir ağız oluşturacak ve sferoplastilerin parçalanmasını önleyecektir.
    3. Saf hücreleri protein ile dönüştürün.
      1. 50 μL sferoplast alikotunu 50 μL donör lizat, 20 μL somon sperm DNA'sı (2 mg / mL) ve 5 μL URA3 işaretli seçim plazmidi (örneğin, pAG426-GFP) ile dönüştürün 28,33.
      2. Karışımı 25 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      3. Sferoplastları toplamak için 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve 150 μL SOS tamponu (1 M sorbitol, 7 mM CaCl2,% 0.25 maya özütü ve% 0.5 pepton) içinde yeniden süspanse edin.
      4. 30 °C'de 30 dakika iyileşin.
      5. Tüm kültürü SD-URA plakaları üzerine yerleştirin.
      6. Kaplanmış kültürü, %0,8 agar.
        içeren ılık (~ 45 ° C) SD-RA ile hızlı bir şekilde kaplayın Not: Bu, sferoplastların patlamasını önleyecektir
      7. Dönüşüm plakalarını 30 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.
      8. Bir kürdan kullanarak, üst üste binen plakadan başarılı bir şekilde büyüyen hücreleri toplayın ve SD-URA plakaları üzerinde tek koloniler halinde yeniden çizgi oluşturun.
      9. Her biri için düzinelerce koloni seçin ve URA3 işaretli taşıyıcı plazmidi ortadan kaldırmak için 5-FOA plakaları üzerinde çizgi çizin.
      10. 5-FOA plakalarında büyüyen kolonileri seçin ve daha önce olduğu gibi büyüme testini kullanarak stabil fenotipik durumların transferini test edin (adım 1.13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein aşırı ekspresyonunun hücresel fenotipleri önemli ölçüde değiştirdiği bilinmektedir27. Gerçekten de, ilk tarama yaklaşımıyla, sadece on stresör kullanılarak maya ORFeome'dan klonların aşırı ekspresyonundan yüzlerce yeni fenotip tekrarlanabilir bir şekilde geri kazanıldı. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan tahliller, hücrelerin bu aşırı ekspresyonu takiben herhangi bir uzun vadeli kararlı fenotipi koruyup korumadığının değerlendirilmesine izin verir. Böyle ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk Maya Prionlar onların sıradışı fenotipleri ve şaşırtıcı desenleri miras tarafından tespit edilmiştir. Bu Prionlar özellikleri sonra algoritmaları ve ekrana ek prion protein için Hesaplama araçları oluşturmak için kullanılan. Burada, açıklanan yöntemi buna ek olarak, deneysel ve geçici overexpression protein uyum içinde devlet olarak kodlanmış kalıcı bir değişiklik-a kararlı oluşturmak için kullanır. "Deli dana derleme tarafından verilen herhangi bir protein için overexpression tohum" verimliliği çok düşük ise, ancak,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kınalıada Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard o ve Susan Lindquist yorumcular yanı sıra bu kağıt onların düşünceli yorum için kullanılan deneyleri gelişmekte olan onların yardım için teşekkür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Guanidin hidroklorürSigma Cat# G3272-25G
Kimyasal Manganez klorürSigmaCat # M8054-100G
Kimyasal Etidyum bromürSigmaE1510Kimyasal
5-Floroorotik AsitSigmaCat # F5013-50MGKimyasal
BY4741 MATa (his3 & Delta; 1 leu2 ve Delta; 0 LYS2 met15 ve Delta; 0 ura3 ve Delta; 0)Winston ve diğerleri, 1995; Brachmann ve diğerleri, 1998N/AMaya suşu
BY4741 MATα (onun3Δ 1 leu2 ve Delta; 0 lys2Δ 0 MET15 ura3 ve Delta; 0)Winston ve diğerleri, 1995; Brachmann ve ark., 1998N/AMaya suşu
Hsp70 (K69M) Jarosz ve diğerleri, 2014bN/APlazmid
FLEXGene kütüphanesiHu ve ark., 2007N/APlazmit kütüphanesi
Dekstroz (glikoz)Fisher ScientificD16-3Medya bileşeni
RafinozSigmaR0250-25GMedya bileşeni
GalaktozFisher ScientificBP656-500Medya bileşeni
CSMSunrise Science1001-100Medya bileşeni
CSM-URASunrise Science1004-100Medya bileşeni
CSM-LYSSunrise Science1032-100Medya bileşeni
CSM-METSunrise Science1019-100Medya bileşeni
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Medya bileşeni
maya özüFisher BilimselBP1422-2Medya bileşeni
peptonAraştırma Ürünleri UluslararasıP20240-5000Medya bileşeni
bacto-peptonBD211677Medya bileşeni
gliserolEMD MilliporeGX0185-2Medya bileşeni
maya azot bazı, amino asitler olmadanBD291920Medya bileşeni
agarIBI BilimselIB49172Medya bileşeni
Adenin sülfatSigmaA3159-25GMedya bileşeni
Potasyum asetatSigmaP1190-500GMedya bileşeni
UrasilSigmaU0750-100GMedya bileşeni
HistidinSigmaH8000-100GMedya bileşeni
LösinSigmaL8000-25GMedya bileşeni
LysineSigmaL5501-25GMedya bileşeni
RNase I Thermo Fisher ScientificEN0601Enzim
biyotinile DNazThermo Fisher ScientificAM1906Enzim
zymolyase 100T (maya litik enzimi)Gündoğumu BilimiN0766555Enzim
Mikroplaka okuyucuBioTekSynergy H1Ekipmanları
Mikroplaka istifleyiciBioTekBioStack3Ekipman
Plakası dolguBiotTekEL406
Ekipmanları Sıvı taşıma robotuBeckman CoulterBiomek FXEkipmanları

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
  2. Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).
  3. Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
  4. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
  5. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  6. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
  7. Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  8. Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
  9. Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
  10. Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
  11. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
  12. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
  13. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  14. Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
  15. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  16. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
  17. Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
  18. Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  19. King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
  20. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
  21. Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
  22. Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
  23. Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
  24. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
  25. Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
  26. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
  27. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  28. Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
  29. Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
  30. Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766(2016).
  31. Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
  32. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  33. Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).
  34. Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
  35. Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
  36. Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
  37. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
  38. Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
  39. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
  40. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
  41. Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
  42. Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
  43. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein based InheritanceYeast ORFeome ScreeningHigh throughput PhenotypingPrion Protein DetectionManganese Chloride StressorHSP104 DisaggregasePSP1 Open Reading FrameNon mendelian InheritanceYeast Prion FieldEpigenetic Screening

Related Articles