Yöntem makalesi

Toll benzeri Reseptör Sinyali Önleyicileri İçin Fagositik Bağışıklık Hücrelerinde Biyoaktif Nanopartiküllerin Taranması

DOI:

10.3791/56075

⸱

26 Temmuz 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toll benzeri reseptör (TLR) sinyali birçok insan iltihaplı hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır ve biyoaktif nanoparçacıklar ile TLR yanıtlarının düzenlenmesinin pek çok iltihaplanma koşulunda faydalı olacağı öngörülmektedir. THP-1 hücre bazlı raportör hücreleri, TLR sinyallemesinin yeni inhibitörlerini tanımlamak için çok yönlü ve sağlam bir tarama platformu sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toll benzeri reseptör (TLR) yanıtlarının farmakolojik olarak düzenlenmesi birçok iltihaplı hastalığın tedavisinde umut vaat ediyor. Bununla birlikte, şimdiye kadar TLR sinyalini zayıflatmak için sınırlı bileşikler mevcuttu ve klinik kullanımda klinik olarak onaylanmış TLR inhibitörleri (sıtma önleyici ilaç olan hidroksiklorokin hariç) henüz mevcut değildi. Nanoteknolojideki hızlı gelişmeler ışığında, nano-cihazları kullanarak bağışıklık tepkisi manipülasyonu, bu hastalıkları tedavi etmek için yeni bir strateji sağlayabilir. Burada, fagositik immün hücrelerde TLR sinyalini inhibe eden yeni biyoaktif nanoparçacıkların hızla tanımlanması için yüksek verimli bir tarama yöntemi sunuyoruz. Bu tarama platformu, kolorimetrik ve lusiferaz tahlilleriyle THP-1 hücre bazlı raportör hücreler üzerine kurulmuştur. Muhabir hücreler iki tetikleyici muhabir yapısının stabil entegrasyonu ile insan THP-1 monositik hücre hattından üretilir. Birincisi, salınmış bir embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) genini ifade ederTranskripsiyon faktörleri NF-κB ve AP-1 tarafından indüklenebilir bir promotörün kontrolü altındadır ve diğeri, interferon düzenleyici faktörler (IRF'ler) tarafından indüklenebilir promotörlerin kontrolü altında salgılanmış bir lüsiferaz raporlayıcı geni ifade eder. TLR uyarımı ile, muhabir hücreleri harekete geçirir Transkripsiyon faktörleri üretmek ve daha sonra ilgili substrat reaktiflerini kullanarak tespit edilebilen SEAP ve / veya lusiferaz üretmektir. Önceki çalışmalarımızda örnek olarak verilen peptid-altın nanopartikül (GNP) hibritlerinin bir kütüphanesini kullanarak, prototipik ligand olan lipopolisakkarid (LPS) tarafından tetiklenen TLR4 sinyal zincirinin iki kolunu etkin bir şekilde engelleyebilen bir peptid-GNP hibridi tespit ettik. Bulgular immünoblotlama da dahil olmak üzere standart biyokimyasal tekniklerle doğrulanmıştır. Daha fazla analiz, bu kurşun melezin TLR2, 3, 4 ve 5 dahil olmak üzere birden fazla TLR yolağı üzerinde etkili geniş bir inhibitör spektruma sahip olduğunu tespit etti. Bu deneysel yaklaşım, whethe'in hızlı bir değerlendirilmesine olanak tanırRa nanopartikül (veya diğer terapötik bileşikler), fagositik bağışıklık hücrelerinde spesifik TLR sinyallemesini modüle edebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin enfeksiyonlara karşı savunmanın ilk safhasına katkıda bulunan en önemli unsurlardan biridir. TLR'ler, patojenle ilişkili moleküler kalıpların (veya PAMP'lerin) bir repertuarını tanıyarak ve bir dizi sinyal iletimi ile savunma reaksiyonlarını monte ederek işgalci patojenleri algılamaktan sorumludur 1 , 2 . Tanımlanan 10 insan TLR'si vardır; Ligand (lar) ın belirsiz kaldığı TLR10 hariç, her bir TLR farklı, korunmuş bir PAMP grubunu tanıyabilir. Örneğin, öncelikle hücre yüzeyi üzerinde bulunan TLR2 ve TLR4, sırasıyla Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilerden lipoproteinleri ve glikolipitleri tespit edebilir; Başlıca endozom bölmelerinde bulunan TLR3, TLR7 / 8 ve TLR9, RNA ve DNA ürünlerini virüslerden ve bakterilerden algılayabilir 3 . PAMP'lar tarafından uyarıldığında TLR'ler, pro-inf salınarak gerekli immün yanıtları tetiklerLammatuvar mediatörler, efektör immün hücrelerini işe alma ve aktive etme ve müteakip adaptif bağışıklık olaylarını koordine etme 4 .

TLR sinyal iletimini basitçe iki ana yola 5 , 6 sınıflandırabilirsiniz. Biri bağdaştırıcı protein miyeloid farklılaşma faktörü 88'e (MyD88) bağımlıdır - MyD88'e bağımlı yolağı. TLR3 dışındaki tüm TLR'ler aktive B hücrelerinin (NF-κB) ve mitojen ile ilişkili protein kinazların (MAPK'lar) nükleer faktör kappa hafif zincir arttırıcıyı aktive etmek için bu yolu kullanır ve bu da TNF-α gibi pro-inflamatuar mediatörlerin ekspresyonuna yol açar. Α, IL-6 ve IL-8. İkinci yol, interferon (IFN) düzenleyici faktörleri (IRF'ler) ve NF-κB'yi aktive etmek için TIR-alanını içeren bağdaştırıcıyı uyaran interferon-β (TRIF) - TRIF'ye bağımlı veya MyD88'den bağımsız yol - kullanır ve sonuç olarak Tip I IFN'ler. Bozulmamış TLR sinyali vermeMikrobik ve viral enfeksiyonlardan günlük koruma için kritik önem taşır; TLR sinyal yolaklarındaki kusurlar bağışıklık yetersizliğine yol açabilir ve genellikle insan sağlığına zararlıdır. 7

Bununla birlikte, TLR sinyallemesi 'çift taraflı bir kılıç' ve aşırı kontrolsüz TLR aktivasyonu zararlıdır. Aşırı aktif TLR yanıtları birçok akut ve kronik insan iltihaplı hastalıklarda patogeneze katkıda bulunur 8 , 9 . Sistemik inflamasyon ve çoklu organ yaralanması ile karakterize edilen, örneğin, sepsis için TLR2 ve TLR4 sepsis patofizyolojisinde 10, 11, 12 çok önemli bir rol oynayan, enfeksiyon doğru akut, ezici bağışıklık tepkilerinin en başta gelen nedeni. Buna ek olarak, TLR5'in kistik fibrozisli hastaların kronik akciğer inflamasyonuna katkıda bulunduğu bulunmuştur 13, 14 . Ayrıca, düzeni bozulmuş endozomal TLR sinyalinin (örneğin, TLR7 ve TLR9) kuvvetli sistemik lupus eritematozus (SLE), romatoid artrit (RA), 15, 16 dahil olmak üzere birçok otoimün hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde ile ilişkilidir. Bu yakınsayan kanıt çizgileri, birçok iltihaplı hastalık için potansiyel bir terapötik hedef olarak TLR sinyalini tanımlar 17 .

TLR yanıtın farmakolojik düzenleme birçok enflamatuar koşullarda faydalı olması beklenmektedir, ancak ne yazık ki, şu anda TLR 9, 17, 18 sinyal inhibe etmek için klinik olarak kullanılabilir, çok az sayıda bileşik mevcuttur. Bu kısmen bağışıklık homeostazı ve hastalık patolojisinde yer alan TLR yolaklarının karmaşıklığı ve fazlalığından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, yeni, poten aramakBirden fazla TLR sinyal yolunu hedefleyen terapötik ajanlar, temel bir boşluğu kapatabilir ve TLR inhibitörlerinin kliniğe ilerletilmesi zorluğunu aşabilir.

Nanobilim ve nanoteknolojideki hızlı gelişmeler ışığında, nanodeviler 19 , 20 , 23 benzersiz özelliklerinden dolayı yeni nesil TLR modülatörleri olarak ortaya çıkıyor. Nano ölçekli boyut, bu nano-terapötiklerin daha iyi biyolojik dağılımı ve sürekli dolaşımını sağlar 24 , 25 , 26 . Arzu edilen farmakodinamik ve farmakokinetik profilleri 27 , 28 , 29 karşılayacak şekilde daha da işlevsel hale getirilebilirler. Daha heyecan verici biçimde, bu yeni nanodevitelerin biyo-aktivitesi, kendilerine özgü özelliklerinden ortaya çıkmaktadır; bunlar,Sadece terapötik bir madde için bir verme aracı olarak hareket etmek yerine, Örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) benzeri bir nanoparçacık, TLR4 ligandı LPS 23'ü süpürerek TLR4 sinyalini inhibe etmek üzere tasarlandı. Buna ek olarak, süslenmiş peptitlerin altın nanopartiküllerinin yüzey özelliklerini değiştirebilecekleri bir peptit-altın nanopartikül hibrid sistemi geliştirdik ve çeşitli biyolojik etkinliklere 30 , 31 , 32 , 33 sahip olmalarını sağladık. Bu, onları yeni nesil nano-terapötik maddeler olarak özel bir ilaç sınıfı (veya "nano-ilaç") haline getirir.

Bu protokolde, fagositik immün hücrelerdeki çoklu TLR sinyal yolaklarını güçlü bir şekilde inhibe edebilen yeni bir peptit-altın nanopartikül (peptid-GNP) hibrid sınıfı tanımlamak için bir yaklaşım sunuyoruz 32 , 33 . Yaklaşım, piyasada bulunan THP-1 raportör hücre çizgilerine dayanıyor. Muhabir hücreler, iki istikrarlı, uyarılabilir raportör yapılardan oluşur: biri, transkripsiyon faktörleri NF-κB ve aktivatör protein 1 (AP-1) tarafından indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında bir salgılanan embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) geni taşır; Diğeri, interferon düzenleyici faktörler (IRF'ler) tarafından indüklenebilir promotörlerin kontrolü altında bir salgılanan lüsiferaz raportör geni ihtiva eder. TLR uyarımı üzerine, sinyal iletimi, muhabir genlerini SEAP ve / veya lusiferaz haline getiren NF-κB / AP-1 ve / veya IRF'lerin aktivasyonuna yol açar; Bu gibi olaylar, bir spektrofotometre veya luminometre ile karşılık gelen substrat reajanları kullanarak kolayca tespit edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak önceden kurulmuş peptid-GNP melez kitaplıklarımızı taramak için, TLR4 sinyal yollarını güçlü bir şekilde önleyebilecek kurşun adaylarını tespit ettik. Kurşun peptit-polimerazın önleyici aktivitesi,GNP melezleri daha sonra immünoblotlama için başka bir biyokimyasal yaklaşım kullanılarak doğrulandı ve diğer TLR yolakları üzerinde değerlendirildi. Bu yaklaşım, TLR sinyal yollarını hedefleyen yeni ajanların hızlı ve etkili bir şekilde taranmasına izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Kültür Ortamı ve Reaktiflerinin Hazırlanması

  1. RPMI-1640 ortamına% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat ekleyerek komple hücre kültürü ortamı R10 hazırlayın.
    1. SEAP'in ekspresyonunu NF-кB / AP-1 aktivasyonu kontrolü altında tutmak için R10'a Zeocin antibiyotiği (200 ug / mL) ekleyerek seçme kültür ortamı R10-Z'yi hazırlayın. SEAP ve lusiferaz raporlayıcı genleri eksprese eden hücreleri seçmek için hem Zeocin (100 μg / mL) hem de blastisidin (10 μg / mL) R10'a ekleyin (R10-ZB olarak).
  2. Temiz 125 mililitrelik bir cam kabın içinde 100 ml ultra saf, endotoksin serbest su (e .g., Quanti-Mavi) alt-tabaka tozu bir kese eritilerek SEAP alt-tabaka çözeltisi hazırlayın.
    1. Çözümü yavaşça döndürün ve alt tabakaların tamamen çözülmesini sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Sterilizasyonu sağlamak için 0,2 um'lik bir membran kullanarak çözeltiyi filtreleyin (opsiyonel) ve kullanımdan 2 hafta öncesine kadar 4 ° C'de saklayın.
  3. Lusiferaz substrat solüsyonunu, bir kutu substrat tozu ( örn. , QUANTI-Luc) 25 mL'lik ultrapure, steril bir 50 mL'lik santrifüj tüpünde endotoksin içermeyen suya çözünerek hazırlayın.
    1. Tozu tamamen çözdükten sonra çözeltiyi derhal kullanın. Alternatif olarak, çözümü kullanımdan önce 4 ° C'de (bir haftaya kadar) veya -20 ° C'de (bir aya kadar) saklayın.
      DİKKAT: Her iki alt katman çözeltisi ışık hassasiyete sahiptir ve mümkün olduğunda ışığa maruz kalmamalıdır. Çözeltinin çoklu donma-çözülme çevrimi, alt tabakanın istikrarsızlığına ve raf ömrünün kısalmasına neden olabilir.
  4. Florbol 12-miristat 13-asetat (PMA) stok çözeltisini moleküler derece dimetil sülfoksid (DMSO) içinde 500 μg / mL konsantrasyonda hazırlayın. Stok solüsyonunun alikotlarını yapın (10 mcL 500 mcL tüp içinde) ve -20 ° C'de saklayın.
  5. LPS (E-coli K12) stok solüsyonunu 5 mg / mL'lik bir konsantrasyonda steril endotoksin içermeyen suda hazırlayın ve -20 ° C'de uzun süreli saklama için alikuotlar hazırlayın. Stok LPS'yi, 100 μg / mL'lik bir konsantrasyonda fosfat tamponlu salin (PBS) içine seyrelterek çalışan bir LPS çözeltisi hazırlayın ve kullanımdan önce -20 ° C'de saklayın.
    DİKKAT: Kültür kullanımları için reaktif hazırlama biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır ve tüm kaplar kullanımdan önce sterilize edilmelidir. PMA ve LPS solüsyonlarının tekrar tekrar donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır.

2. THP-1 raportöründen hücre kaynaklı makrofajların kültürü

  1. İki THP-1 raportör hücre hattı kullanın: THP-1-XBlue ve THP-1-Dual hücreler. Birincisi, NF-κB / AP-1 tarafından kontrol edilen bir SEAP raportör genine ve ikinci bir raportör gen sistemi, aynı SEAP raportör geni ve bir IRF kontrollü lüsiferaz genine sahiptir.Kültür kültürü prosedürleri seçim kültürü ortamı dışında aynıdır.
    1. 10 mL R10 ortamında çalışan bir hücre stokunu (~ 5 x 10 6 hücre) eritin, hücreleri 5 dakika 300 x g'de döndürün. Hücreleri 10 mL R10 ortamında süspansiyon haline getirin ve bir T75 kültür şişesine aktarın. Hücreler 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğa ulaşana kadar her 2-3 günde bir kültür ortamını değiştirin.
    2. Hücre büyümesi kapasitesine ulaştığında, hücreleri hücre yoğunluğunu 2-5 x 10 5 hücre / mL aralığına düşürmek için geçirin, böylece hücreler büyümeye devam edebilir.
    3. En az 1 geçildikten sonra seçme kültür ortamında hücrelerin kültürlenmesine başlayın: THP-1-XBlue için R10-Z ve THP-1-Dual için R10-ZB. Hücreleri seçme kültürü ortamı ile en az 1 geçiş için kültürledikten sonra hücreler deney için hazırdır.
      DİKKAT: Hücre aşırı büyümesi önemli hücre ölümüne neden olabilir; Hücre yaşayabilirliği>% 98 seviyesinde olmalıdır. Geçiş numarasını cel olarak kaydedinBirçok pasajdan (> 20 pasaj) sonra farklı davranıyor olabilir.
      NOT: Hücre kültürü şişeleri maliyetleri azaltmak için birkaç kez tekrar kullanılabilir; Bununla birlikte, bu uygulama, farklı flasklar arasında (aynı anda farklı hücre hatlarını kullanıyorsa) kontaminasyon ve çapraz bulaşma riskini artırabilir. Medya değişimi ve hücre geçişi sırasında, santrifüj, 5 dakika boyunca 300 xg'de ayarlanır.
  2. Muhabir hücresi tahlilini yapmak için, tohum hücrelerini 96 oyuklu düz dipli hücre kültürü plakasına koyun ve makrofajlara ayırın. İşlemler aşağıda açıklanmıştır.
    1. Bir sürahi santrifüj tüpüne hücreleri aktarın, hücreleri aşağı 300 xg 5 dakika spin ve 1 x 10 6 hücre / mL bir konsantrasyonda R10 orta tekrar süspansiyon haline getirin. 50 ng / mL'lik nihai konsantrasyonla hücre süspansiyonlarına PMA solüsyonunun bir kısımlarını ilave edin.
    2. 96 μl'lik her oyuğa 100 μL hücre süspansiyonu aktarın.Çok kanallı bir pipet kullanarak plakaya yapıştırın. Plakayı 37 ° C'de (bir hücre kültürü inkübatöründe) 24 saat inkübe edin.
    3. Kuluçkadan sonra dikkatlice bir vakum aspiratörü (veya bir çok kanallı pipet ile) kültür ortamı çıkarın ve hafifçe PBS (100 mcL / iyi) ile iki kez hücreleri yıkayın; Her oyukta 100 uL taze R10 ortamı ekleyin. Gazeteci tahlilini yapmadan önce hücreleri bir inkübatöre 2 gün dinlendirin.
      DİKKAT: Dinlenme aşaması, hücrelerin normal sessiz durumlarına PMA stimülasyonundan sonra sakinleşmelerine izin vermek için çok önemlidir. Bu, uyarılmamış koşullar altında raportör genlerin arka plan sinyallerini önemli ölçüde azaltabilir.
      NOT: PMA ile 24 stimülasyondan sonra hücreler, kuyunun dibinde bir hücre yapışması karakteristiği ve psödopodinin morfolojik bir özelliği olan makrofaj benzeri fenotipe ayırdedilir.

3. Reporter Hücrelerini Kullanarak Potansiyel TLR4 Nano-inhibitörlerinin taranması

NOT: TLR4 sinyallemesi hem MyD88'e bağlı hem de TRIF'ye bağlı yolaklardan yararlandığından, bir dizi TLR sinyal yolunu kapsayan birincil hedef olarak seçilmiştir. THP-1-Dual hücreler, TRIF'ye bağlı sinyal transdüksiyonundan IRF aktivasyonu için iken THP-1-XBlue raporlayıcı hücreler ağırlıklı olarak NF-κB / AP-1 aktivasyonunu incelemek için kullanılırlar.

  1. Taramadan önce bir doz-yanıt eğrisi üreterek optimal LPS dozunu belirleyin.
    1. Çalışan LPS solüsyonunu, R10 ortamında 0.01 - 100 ng / mL son konsantrasyonda seyreltin (log10 ölçeğinde seyreltin). Plaka tasarımını yerleştirin ve 96 oyuklu bir yuvarlak tabanlı kültür plakasında seyreltin. Seyrelttikten sonra her kuyucuğun en az 110 μL çözeltiye sahip olduğundan emin olun.
    2. Bir vakum aspiratör kullanarak hücre ekim tabakından (2.2.3'den) kültür ortamını yavaşça çıkarın.
    3. Seyreltme plakasında (3.1.1) hazırlanan R10 ortamı içeren LPS'yi transfer edin iNumunelerin düzenine göre kültür plakasına yerleştirin. Plakayı 37 ° C'de (bir hücre kültürü inkübatöründe) 24 saat inkübe edin.
    4. 24 saat sonra, süpernatantları (80 uL / ​​çukur) yeni bir 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakaya dikkatlice aktarın. Bu solüsyonlar üzerine doğrudan kolorimetrik ve / veya lusiferaz lüminesans testi uygulayın veya test gelişmeden önce 4 ° C'de (birkaç saatte) veya -20 ° C'de (günler) saklayın.
      NOT: Deney ve veri analizi için plaka düzeni tasarımı basit ve net olmalıdır. Her koşul için, 2-4 çoğaltılması düşünülmelidir. Her zaman bir negatif kontrol grubu (LPS boş) ekleyin. Dual hücrelerin makrofajlara ayrıldıktan sonra nispeten yüksek NF-кB / AP-1 aktivasyonuna sahip olması nedeniyle NF-κB / AP-1 aktivasyonu için THP-1-XBlue hücrelerinin kullanılması önerilir. Bununla birlikte, İkili hücreleri hem NF-κB / AP-1 hem de IRF aktivasyonunu bildirmek için kullanmak mümkündür.
  2. Rengi geliştirinImetrik tahlil ve IRF aktivasyonu için lusiferaz lüminesans analizi.
    1. NF-κB / AP-1 aktivasyonunu değerlendirmek için, her numunenin 20 uL'lik süpernatantını yeni bir 96 oyuklu düz tabanlı kültür plakasına aktarın; Ve her oyuğa önceden ısıtılmış SEAP substrat çözeltisi 180 uL ekleyin. Renk gelişimine izin vermek için plakayı 37 ° C'de 1-2 saat inkübe edin (pembeden koyu maviye kadar). Bir plaka okuyucuda 655 nm'de absorpsiyonu toplayın.
      DİKKAT: Kuluçka süresi, renk gelişimine (30 dakika ila gece inkübasyona kadar) göre değişebilir. Renk gelişiminin doygunluğundan kaçınırken (OD> 3), en koyu renkteki optik yoğunluğun (OD) 1'in üzerine çıkmasını beklemeniz önerilir.
    2. IRF aktivasyonunun analizi için, her numunenin 10 uL'lik süpernatantını 96 oyuklu şeffaf düz tabanlı beyaz bir tabak içine aktarın. Lusiferaz çözeltisini (50 μL) ekleyin ve hemen lüminesans wElinden geleni yap.
      NOT: Işık okumasındaki kıvamdan iyiye ve plakadan plakaya kadar tutarlılığı sağlamak için otomatik enjeksiyon işlevine sahip bir lüminesans plaka okuyucusu kullanılması kesinlikle önerilir. Substrat çözeltileri elle püskürtülürse, lütfen her bir kuyunun tutarlı bir kuluçka süresi ve okuma kurulumunu sağlayın.
  3. Tarama testini 10 ng / mL LPS uyarımı ile çeşitli peptid-GNP melezleri üzerinde gerçekleştirin (3.1'e dayalı olarak). Gazeteci tahlilinin gelişimi için 3.2'deki prosedürü izleyin.
    1. Santrifüj yöntemi kullanılarak R10 ortamında peptid-GNP melezlerini 200 nM'ye konsantre edin. Hibrid çözeltinin (10 nM) 20 hacmi 18,000 xg'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanları dikkatli bir şekilde atın. Melezleri (tübün alt kısmında) bir tüpe toplayın, iki kez PBS ile yıkayın ve melezleri R10 ortamının bir hacminde yeniden askıya alın.
    2. Konsantre melezlerin eşit hacimlerini karıştırın veHibridlerin nihai konsantrasyonu elde etmek için R10 ortamı içeren LPS (20 ng / mL) ve sırasıyla 100 nM ve 10 ng / mL olacak şekilde LPS'dir.
    3. Kültive edilmiş plakadan (2.2.3) kültür ortamını çıkarın ve her oyuğa 100 μL karışık solüsyon ekleyin (her durum için 3 tekrarlayın); Negatif bir kontrol (sadece orta) ve bir LPS kontrolü (melez içermeyen 10 ng / mL LPS) içermelidir.
    4. 37 ° C'de 24 saat inkübasyondan sonra, her oyuğun ortamını bir tüp içine aktarın ve tüpleri 18,000 xg, 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatantları (50-80 uL / ​​tüp) bir 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plaka halinde toplayın ve 3.2'de anlatıldığı gibi raportör analizi yapın.
      DİKKAT: Santrifüjden sonra süpernatanları atarken tüpün altındaki melezleşmeleri çalkalamayın.
      NOT: Adım 3.3.4'teki santrifüj, iç ortamda tutulmamış nanopartikül hibridlerini kültür ortamından çıkarmak için çok önemlidir ve hibritlerin co ile karışmasını önleyebilirRenk ölçüm / lüminesans okumaları. Bunun nedeni, altın nanopartikülleri, boyutlarına ve aglomerasyonuna bağlı olarak geniş dalga boyundaki ışıkları emebilir.

4. Potansiyel Adayların Önleyici Etkisinin Doğrulanması

NOT: Potansiyel adayların taramadan önleyici etkisini doğrulamak için iki yaklaşım uygulanmaktadır. Birincisi, sabit bir hibrid konsantrasyonda uyarıcıların (LPS) doz yanıtlarını incelemektir (veya bunun tersi yolu); Diğeri immünoblotlama yoluyla NF-κB / AP-1 ve IRF3 sinyallerindeki inhibisyona doğrudan bakmaktır.

  1. Birinci yaklaşımda, 3.3'de açıklanan işlemlerin aynısını takiben, 100 nM kurşun hibridleri ve iki LPS konsantrasyonuyla 1 ng / mL ve 10 ng / mL muhabiri gerçekleştirin. Karşılaştırma için hibrid bir kontrol olarak aktif olmayan bir hibrid (tarama sonuçlarına dayanarak) ekleyin.
  2. İmmünopotiplendirme yaklaşımı için lütfen standart eKusursuz işlemler.
    1. R10, ortam içinde kültür THP-1 hücreleri, 24 saat dinlenme ardından için / ml PMA 12-çukurlu kültür plakasının (2 x 10 6 hücre / göz) içine hücreleri, tohum ve 50 ng ile hücrelerin işlemden geçirilmesi ile makrofajlara ayırt 2 gündür.
    2. Hücrenin farklılaşmasından sonra, hücreleri 10 ng / mL LPS ile hibridli / hibridsiz (100 nM) zamanla (4 saate kadar) uyarın. Çeşitli zaman noktalarında (0, 5, 15, 30, 60, 120 ve 240 dakika), immünoblotlama için hücre lizatlarını hazırlayın. Kontrol olarak etkin olmayan bir hibrid ekleyin.
    3. Kurşun hibritlerinin NF-κB ve IRF3'ün aktivasyonu üzerindeki inhibe edici etkisini incelemek için IκBα, fosforile edilmiş p65 ve fosforile IRF3 sinyallerini araştırın. Β-aktin ve toplam IRF3 sinyallerini iç kontrol olarak araştırın.
      NOT: Sinyal iletimi, daha sonra (birkaç saat içinde) çok daha hızlı gerçekleşir ve ardından, muhabir enzim SEAP ve lusiferaz'ın (24 saat) ekspresyonu oluşur. Ayrıca perfor için de önerilir.Test edilen hibridlerin bir diğer validasyon metodu olarak 24 saat canlılık testi.

5. TLR Özgüllüğünün Değerlendirilmesi

NOT: Kurşun peptit-GNP hibridinin TLR özgüllüğünü araştırmak için, TLR2, TLR3 ve TLR5 de dahil olmak üzere diğer TLR sinyal yolu test edilmiştir. THP-1 kaynaklı makrofajlar nedeniyle TLR7, 8 olmaması ve makrofajlar 34 9 ekspresyonu bu TLR'lerin uyarıya cevap vermemesi için TLR7, 8 ve 9 hariçtir.

  1. Hem raportör hücrelerden türetilmiş makrofajlar üzerinde TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I: C) ve TLR5'e (flagellin) spesifik ligandların çeşitli konsantrasyonlarını (1 ng / mL ila 25 μg / mL) test edin ve bunu takiben optimum konsantrasyonu elde edin 3.1 ve 3.2'deki prosedür.
  2. Kurşun h (100 nM) ve her bir TLR ligandı karışımı ile hücreleri, 5.1'den elde edilen konsantrasyonda muamele ederek, h'nin engelleyici özgünlüğünü değerlendirin h3.3'de tarif edilen deneysel prosedüre göre yendi. İnaktif melezi karşılaştırma için bir kontrol olarak ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel deneysel yaklaşım Şekil 1'de gösterilmektedir. THP-1-XBlue ve THP-1-Dual olmak üzere iki THP-1 raportör hücre dizisi, sırasıyla NF-кB / AP-1 ve IRF'lerin aktivasyonunu saptayarak TLR yanıtlarını hızlı ekranlamak için kullanılır. NF-κB / AP-1'in aktivasyonu SEAP kolorimetrik analizi ile tespit edilebilirken, IRF aktivasyonu lusiferaz lüminesansı ile izlenir. Monositik THP-1 hücreleri, doğuştan gelen fagositik bağışıklık hücreleri üzerindeki bağışıklık d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TLR'ler birçok iltihaplı hastalığın patogenezinde yer aldığından, immün yanıtların ve inflamatuar koşulların modülasyonu için terapötik hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, TLR sinyal yollarını inhibe etmek için kullanılan terapötiklerin klinik gelişimi bugüne kadar sınırlı bir başarı elde etmiştir. TLR7 ve TLR9 inhibe antimalarial hidroksiklorokin, klinik kullanım 35 36'dır. Benzer şekilde, klinik öncesi çalışmalarda 37<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Şanghay İlk Halk Hastanesi (HY) 'dan başlama fonu olan Şanghay Yüksek Öğrenim Enstitülerinde (HY) Özel Randevu (Doğu Edebiyatı) Profesörü, Şanghay Jiaotong'dan Gaofeng Klinik Tıp Hibe desteği için verilen programın desteğini kabul etmek istiyorlar University School of Medicine (HY) ve Crohn's ve Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET ve HY) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
THP-1-XBlue raportör hücresiInvivoGenthpx-sphücre kültürü geçişini 20'nin altında tutar
THP-1-Çift repoter hücresiInvivoGenthpd-nfis,hücre kültürü geçişini 20
RPMI-1640'ın altında tutar (L-glutamin yok)GE Health CareSH30096.0237 °C'ye kadar ısıtın; C kullanmadan önce; tam bir ortam yapmak için takviyeler ekleyin R10
Fetal sığır serumu (nitelikli)Thermo Fisher Scientific12484028Isı inaktive edilmiş; RPMI-1640 L-glutamin içinde %10
ThermoFisher ScientificSH30034.02Tam ortamda 2 mM R10
Sodyum piruvatThermo Fisher Scientific11360-070Tam ortamda 1 mM R10
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu, 1X, kalsiyumsuz, magnezyum GEHealth CareSH30028.02Hücre yıkama ve reaktif hazırlama için kullanın
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1SEAP substratı
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Luciferase substrat
ZeocinInvivoGenant-zn-1Muhabir hücreler
BlasticidinInvivoGenanti-bl-1Raportör hücreler için seçim antibiyotikleri
Moleküler biyoloji için Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigmal-AldrichD8418-100MLReaktif hazırlama için kullanın
Moleküler biyoloji için Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)Sigmal-AldrichP1585-1MGHücre farklılaşması için kullanın
E. coli K12 InvivoGen'den lipopolisakkarit (LPS)tlrl-eklpsTLR4 ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3 ligandı
S. Typhimurium'dan Flagellin (FLA-ST), ultra safInvivoGentlrl-epstflaTLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 mikroplaka okuyucuMoleküler CihazlarN/AKolorimetrik testi okuyun
Sonsuz M200 Pro enjektörlü çok modlu mikroplaka okuyucuTecanN/ALuminiscience
Microfuge 22R santrifüjBeckman CoulterN/ASıcaklık kontrollü mikro santrifüj (18.000 g'a kadar)
Allegra X-15R santrifüjBeckman CoulterN/ASıcaklık kontrollü genel amaçlı santrifüj (hücre kültürü kullanımı için)
Costar tahlil plakası, şeffaf düz tabanlı 96 oyuklu beyaz, doku kültürü ile tedavi edilmiş CorningCostar3903Lüminisans testi için kullanılır
, için seçim antibiyotikleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nanopartik l TaramaTHP 1 Reporter H creleriSEAP L siferaz AnaliziPeptit Alt n Nanopartik l HibritiNF kappaB AP1 AktivasyonuIRF L siferaz Analizimmunoblot Do rulamasnflamatuar Hastal k Tedavisi

İlgili makaleler