Yöntem makalesi

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

10.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56080

⸱

24 Temmuz 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Southern California, 2Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Özet

Yıllar boyunca, maya tek hibrid tahlili, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ve DNA hedefleri gibi proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlamak ve doğrulamak için önemli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Burada sunulan yöntem Y1H'nin altında yatan kavramı kullanır, ancak hedef DNA'sına bağlanan protein komplekslerini incelemek ve doğrulamak için daha da modifiye edilir. Bu nedenle modifiye edilmiş maya tek hibrid (Y1.5H) tahlili olarak geçmektedir. Bu test maliyet açısından etkili olup, düzenli bir laboratuar ortamında kolayca uygulanabilir. Her ne kadar heterolog bir sistem kullansa da , tarif edilen yöntem, herhangi bir çalışma sisteminde, özellikle bitki genomiği için işlevsel genomik için DNA hedeflerine / hücrelerine bağlanan heteromerik protein kompleksini test etmek ve doğrulamak için değerli bir araç olabilir.

Giriş

Genel olarak, protein-DNA etkileşimlerini anlamak için Y1H tahlili, laboratuar ortamında başarıyla kullanılan tercih edilen sistemdir 1 . Temel Y1H tahlili iki bileşen içerir: a) bir raportör proteini şifreleyen bir genin üst akışına başarıyla klonlanmış ilgi DNA'sı olan bir raportör yapı; Ve b) ilgili TF ile bir maya transkripsiyon aktivasyon alanı (AD) arasında bir füzyon proteini üretecek bir ifade konstrüksiyonu. Fusion protein "av" olarak bilinirken ilgi DNA, yaygın olarak 'yem' olarak anılır. Geçmiş yıllarda, Y1H tahlilinin birden fazla versiyonu, kendi avantajları ile spesifik ihtiyaçlara göre geliştirilmiştir 2 . Mevcut Y1H tahlili, DNA yemiyle bir defada bir proteinin etkileşimini tanımlamak ve doğrulamak için başarılı bir şekilde uygulanabilir ancak heterodimerik veya multimerik protein-DNA etkileşimlerini tanımlama yeteneğinden yoksundur.

"> Burada açıklanan yöntem, mevcut Y1H'nin değiştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların hedef DNA dizilimine / proteinlerine aynı anda birden çok protein bağlamalarını sağlar Bu tahlilin amacı, bir etkinleştirme domeniyle ilgilenilen proteini (pDEST22: TF) ve maya sisteminde etkileşen protein partnerinin (pDEST32ΔDBD-TF) varlığında ve / veya yokluğunda bir haberci ile birleştirilen aday DNA bölgelerinin aktivasyonunu değerlendirin.Bu tahlilde bu iki Proteinlerin, hedefin aktivasyonu için gereklidir.Bu, bir GATEWAY klonlama uyumlu sistemidir ve bu nedenle, düzenli bir laboratuar ortamında kullanılmak üzere uygundur.Bu protokol, bir maya sistemindeki farklı TF'lerin birlikte dönüştürülmesini kolaylaştıran doğrudan dönüşüme dayanır Dolayısıyla, in vitro moleküler ve fonksiyonel doğrulama için olası DNA hedeflerine bağlanan protein komplekslerini doğrulamak için avantajlı bir strateji fVeya herhangi bir sistem. Tandem afiniteli saflaştırma (TAP) yöntemleri gibi mevcut teknikler maliyetli ve emek gerektirir, ancak protein hetro-komplekslerinin büyük ölçekte saptanmasına izin verir 3 , 4 , 5 . Bu modifiye maya tek hibridi, küçük bir ölçekte ( Şekil 1 ) düzenli bir laboratuar ortamında başarıyla uygulanabilir ve aynı zamanda maliyet açısından da etkili olur. Y1.5H tahlili, heterolog bir sistem kullanarak ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein kompleksinin rolünü tanımlamaya yönelik hipotezlerini test etmek ve doğrulamak için toplumdaki araştırmacıları kolaylaştırabilir. Bulgulara dayanarak, hipotez, tercih edilen çalışma sisteminde in vivo olarak doğrulanabilir. Son zamanlarda, Arabidopsis 6'da çiçek açmayı düzenleyen bir TF'nin rolünü ve bunun hareket biçimini tanımlamak için bu yaklaşımı kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Yapılandırma ve Reporter Plazmid Hazırlama

  1. PCR, E. coli (TOP10) kullanılarak giriş vektörüne klonlama için analiz edilecek hedef DNA'nın "fragmanları" (tercihen ~ 250-500 bp) promoter bölgelerini çoğaltır.
  2. Sekans teyitinin ardından, 8 , 9 , 10 , 11'de tarif edildiği gibi pozitif klonun uyumlu bir pGLacZi ekspresyon vektörü 7'de alt klonlanması.
  3. Daha önce 12 , 13'te tarif edildiği gibi maya muhabiri suşu oluşturmak üzere pGLacZi'nin homolog rekombinasyonu ile maya suşunu promoter entegrasyonu (YM4271) için transforme edin. DNA bölgesinin bulunduğu maya suşunun transformasyon ve teyit basamakları, medyanın tarifi ile birlikte burada açıklanmamıştır çünkü basamaklar klasik Y1H protokolüne benzerAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Daha önce 8 açıklandığı gibi β-galaktosidaz aktivitesi quantifiying ise PExP-AD502 kontrol plazmidi Normalizasyon için kullanılabilir.
  4. İlgilenilen TF'yi veya proteini klonlayın ve daha sonra etkileşen protein partneri pDEST22 ve pDEST32ΔDBD'ye (pDEST32 eksi DNA Bağlama Etki Alanı) ekspresyon vektörlerine klonlayın. Dönüştürülmüş maya destekçi fragmanları ve TF klonları daha sonra protokolde daha fazla kullanılır.

2. Değiştirilmiş Y1.5H Protokolü

  1. 1. günde (öğleden sonra), bir Petri kabı veya gliserol stokundan SD-Ura'da 5 mL kültür ile başlayın ve gece boyunca 30 ° C'lik bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    NOT: Bu kültür, yeni çizilmiş bir plakadan veya doğrudan mayanın% 25 veya% 30 gliserol stoğundan başlatılabilirDNA parçası ile klonlayın.
  2. 2. günde (öğleden sonra), 10 mL YPDA medyumunu gece kültüründen 500 uL'ye aşılayın ve gece boyunca 30 ° C'lik bir çalkalayıcıda inkübe edin.
  3. 3. Gün (sabahın erken saatlerinde ve öğleden sonra): Yetkili hücreleri hazırlayın (sabahın erken saatlerinde).
    1. 100 mL YPDA medyumunu gece kültürü 2 mL'si ile inoküle edin ve 30 ° C'lik çalkalayıcıda inkübe edin. OD 600 0.4-0.8'e (3-5 saat) ulaşıncaya kadar bu taze kültürü büyütün.
      Not: gece boyunca kültüre göre OD 600 kontrol ve bu aşama için bir başlangıç noktası OD600 0.1 olduğundan emin olmak - 0.2. Aşırı veya yetersiz kültür kullanımı, deneyin uzamasına neden olabilir.
    2. 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    3. Peletleri 10 mL steril suda bir vorteks veya pipetleme kullanarak yukarı ve aşağı rekonstitüe edin.
    4. 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    5. Reconstitu(Tris-Etilendiamintetraasetik asit (TE) / Lityum asetat (LiAc) 2 mL içinde bir vorteks veya pipetleme kullanarak yukarı ve aşağı peletleyin.
      NOT: Lütfen TE / LiAc için Tablo 1'deki reçete bakın.
    6. 5 dakika boyunca 1000 xg ve 21 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    7. Pelet 4 mL TE / LiAc + 400 μL somon sperm DNA'sında (10 mg / mL) pipetle yukarı ve aşağı tekrar asılarak bir sonraki adıma geçin.
  4. Eş dönüşüm: Hücrelere ısı şoku (öğleden sonra geç saatlerde)
    1. 96 oyuklu bir karıştırma plakasına (U-dip) oyuk başına 20 uL hücre dağıtın.
    2. PDEST22: TF plazmiti, pDEST32ΔDBD: TF plasmidinin her birine 150 ng (~ 1.5 uL) ve oyuklara pEXP-AD502 artı pDEST32ΔDBD: TF (normalizasyon kontrolü) ekleyin.
      NOT: Başarılı bir ko-dönüşüm için ~ 150 ng'lik pDEST22: TF ve pDEST32ΔDBD: TF plazmiti ile optimum sonuçlar beklenir. Böylece yapı ve plasmid ifadelerine göre değişebilir.Her deneyle optimize edilmelidir. Başka bir kontrol pDEST22-TF artı pDEST32deltaDBD de kullanıcının takdirine dahil edilebilir.
    3. Kuyu başına 100 uL TE / LiAc / polietilen glikol (PEG) ilave edin ( üç kez karıştırın ).
      NOT: Lütfen Tablo 1'deki TE / LiAc / PEG reçetesine bakın.
    4. Plakayı nefes alabilen bir conta ile örtün ve 30 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin (daha uzun sürebilir) (karıştırma gerekmez).
    5. Isı şoku 20 dakika süreyle ( tam olarak ) 42 ° C'de.
  5. Hücreleri plakalayın.
    1. 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı alın. 110 uL TE ekleyin ve karıştırın.
    2. 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanın 100 uL'ini çıkarın. Pelteyi delici ile tekrar süspanse edin.
    3. SD-Trp-Leu agar plakalarına hücreleri aktarın. Levhaları kuluçkalayın30 ° C'de bir sonraki aşamaya kadar.
  6. 5. Gün (öğleden sonra): Puncher / mikroplak çoğaltılayıcı kullanarak hücreleri yeni plakalara aktarın.
    1. Bir çok kanallı pipet kullanarak 50 uL TE ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-alt) doldurun. TE'deki zımbayı önceden ıslatın.
      NOT: Delgeç veya mikroplak çoğaltıcısı bu adımdan önce ve daha sonra protokolde sterilize edilmelidir. Deliciyi sterilize etmek (% 100, moleküler biyoloji sınıfına değil) etanol içine daldırmak ve ardından alevle yakmak gibi ortak yöntem uygulanabilir. Delici iğnelerini soğutmak için 1 dakika bekleyin.
      Dikkat: Tezgah üstünde sterilizasyon yapılıyorsa; Tezgahın etanol ile önceden temizlendiğinden ve yanıcı herhangi bir malzemeden arındırılmış olduğundan emin olun. Uygun kişisel koruyucu ekipmanı (PPE) giyin.
    2. Kolonileri yumruklayın ve TE dolu tabağa tekrar süspanse edin.
      NOT: Tabla üzerinde pürüzsüz bir büyüme varsa, kolonilere doğrudan delinebilirTE dolgulu plakaya veya alternatif olarak, tek koloni (birden fazla koloni olması durumunda), TE doldurulmuş plakaya sterilize edilmiş bir kürdan kullanarak seçilmeli ve daha sonra, bir sonraki aşamada delgeç kullanılmalıdır.
    3. Optimum yüzey alanı için onları yeni SD-Trp-Leu agar plakalarına aktarın. Bir sonraki aşamaya kadar plakaları 30 ° C'de inkübe edin.
  7. 7. Gün (öğleden sonra): β-galaktosidaz aktivitesini ölçmek için kültür başlatın.
    1. Çok kanallı bir pipet kullanarak 50 μL SD-Trp-Leu ortamı ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-altı) doldurun.
    2. Çok kanallı bir pipet kullanarak 180 uL SD-Trp-Leu ortamı ile steril 96-derin kuyu bloğu doldurun.
    3. Deliciyi medyada önceden ıslatın ve plakalardan 50 mcL medyaya koloniler aktarın.
    4. 20 μL mayayı, 180 μL SD-Trp-Leu ortamına aktarın ve bloğu nefes alabilen bir conta ile kapatın. tasarlamak30 ° C'de çalkalayıcıda 36 saat boyunca.
  8. 9. Gün (sabah): Enzimatik ölçüm için kültürü başlatın.
    1. 100 uL kültürü, sterilize edilmiş 96 derin kuyu bloğunda 500 uL YPDA medyasına aktarın.
    2. Sterilize edilmiş derin kuyu plakasını nefes alabilen bir conta ile örtün ve 200 rpm'de çalkalayarak 30 ° C'de 3 ila 5 saat inkübe edin (OD 600 0.3-0.6'ya kadar).
    3. Kültürü yeniden askıya alın ve bir spektrofotometre plakasında çok kanallı bir pipet kullanarak 125 μL aktarın (OD 600 ölçün).
      NOT: Dikkat: Kabarcıkları önlemek için son damlasını boşaltmayın, eğer OD 600 0,3-0,6'nın altındaysa kalan hücreleri okumaya bağlı olarak 1-2 saat daha inkübe edin. Bu aşamada kullanılan 125 uL kültürü atılabilir veya kullanıcının takdirine bağlı olarak orijinal derin kuyu bloğuna geri aktarılabilir.
    4. Kalan hücreleri, 3000 xg ve 21 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı kaldırT ters çevirerek.
    5. 200 μL Z-tamponu ekleyin ve girdap ekleyin.
      NOT: Lütfen Tablo 1'deki Z-tamponunun reçetesine bakın.
    6. 3000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın.
    7. 20 uL Z-tamponu ekleyin ve vorteks ekleyin.
    8. Donma çözülme döngülerine karşı koyabilen sızdırmazlık folyosu ile plakayı kapatın. Duman kabininde sıvı azot kullanarak 4 kez dondurma / çözülme yapın ve daha sonra su banyosunda 42 ºC (her biri 2 dakika) kullanın.
    9. 200 μL Z-tampon / beta-merkaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-β-galaktoz (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8.4 mg sırasıyla 20 mL solüsyon verecek, her zaman taze hazırlayınız ) ilave edin.
      NOT: ONPG düzgün bir şekilde çözülmesi biraz zaman alır, bu adımı atmadan bir saat önce çözümü hazırlayın. ONPG β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümü için substrat görevi görür.
    10. 30 ° C'de 17 - 24 saat inkübe edin (eğer renk daha erken gelişiyorsa araya bakın.Bir sonraki adıma geçmek).
  9. 10. Gün (sabah): Tepkiyi durdurun ve ölçün.
    1. Reaksiyonu durdurmak ve zamanı kaydetmek için 110 uL 1M Na 2 CO 3 ilave edin.
    2. 3000 xg ve 21 ° C'de 10 dakika vorteksleyin ve santrifüjleyin.
    3. Birden çok kanal kullanarak 125 ul süpernatant alın ve OD 420 ölçün.
      NOT: Dikkat, kabarcıkları önlemek için son damlasını dağıtmayın.
    4. Β-gal etkinliğini hesaplayın: bir elektronik tabloda 1000 x OD 420 / (zaman (dak) x hacim (mL) x OD 600 ).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İlgilenen protein ile maya hücrelerindeki DNA bölgelerinin birlikte dönüştürülmesi için genel plaka hazırlama prosedürü ( Şekil 2 ). Plaka düzeneği, deneye ve test edilen DNA bölgeleri / fragmanlarının sayısına göre değiştirilebilir. Protokolün 5. gününden sonra, iyi yetiştirilmiş ve pozitif bir plaka Şekil 3'deki gibi görünmelidir. Çalışmamızda, transkripsiyon başlangıç ​​alanının başlangıcından itibaren 2600 bp yukarıdaki ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut Y1H standart prosedürü, DNA yemine bağlanan tek bir protein yırtıcıyı tanımlamak için uygundur. Çeşitli teknik değişikliklerle, mevcut sistem transkripsiyonel düzenleyici ağları tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, TF'lerin, iki veya daha fazla TF veya protein içeren komplekslerin bir parçası olarak işlev gördüğü ve bunların sadece bir kısmının DNA'ya bağlanabildiği bilinmektedir. Sadece protein bağlama alanlarına sahip olan ve DNA'ya bağlanma yeteneğine sahip olmayan proteinler veya TF&#...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazının eleştirel okunması için SS Wang, M. Amar ve A. Galla'ya teşekkür ediyoruz. Bu yayında bildirilen araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından RO1GM067837 ve RO1GM056006 (SAK'a) ödül numaraları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pDEST22 vektörInvitrogenPQ1000101Pro-Quest İki hibrit sistem kiti
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest Two hibrit sistem kiti; Bu vecor modifiye edilmiştir. pDEST32 eksi DNA bağlanma Etki Alanı
pENTR/D-TOPO Klonlama KitiInvitrogenK240020
YM4271 SuşClontechK1603-1MATCHMAKER Tek Hibrit Sistem
pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest İki hibrit sistem kiti
GATEWAY LR Klonaz II enzim karışımıİnvitrojen11791020
YPDA ortamıClontech630410
SD-AgarClontech630412
SD minimal medyaClontech630411
Urasil DO TakviyesiClontech630416
Triptofan TakviyesiClontech630413
Tris BaseFisher ScientificBP152-1
EDTAFisher ScientificS311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
Saplmon Sperm (10mg / ml)Invitrogen15632011
96 kuyulu yuvarlak alt PlakaGreiner bio-one650101
PEG3350Sigma-Aldrich1546547
96 derin kuyu bloğuUSA Scientific1896-2000
Sızdırmaz FolyoABD Bilimsel2923-0110
ArasealExcel BilimselB-100
2-merkaptoetanolFisher Scientific034461-100
ONPGSigma-Aldrich73660
Na2< / sub>CO3< / sub>Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4 Sigma-AldrichS3264
NaH2PO4 Sigma-AldrichS3139
KCLFisher ScientificBP366-500
MgSO4 Sigma-Aldrich83266
HCLFisher ScientificSA54-4
Kuru BanyoTermo Fischer
VoretxTermo Fischer
SantrifüjEppendorfSantrifüj 5810R
Plaka OkuyucuMoleküler CihazSPECTRAMAX PLUS Mikroplaka Spektrofotometresi
KuluçkaMakinesi Thermo FisherModel No. 5250- 37 Derece, 6250-30 derece
Çalkalayıcı KuluçkaMakinesi New Brunswick
Su BanyosuThermo FisherIsoTemp 205
Zımba
50 ml FalocnBD Falcon
BeherNalgene
ŞişesiNalgene
Petriplates (150mm)Greiner bio-one

Kaynaklar

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Transkripsiyon Fakt r Ba lanmasMaya TransformasyonuBeta Galaktosidaz AnaliziSD Se ici BesiyeriKo transformasyon ProtokolDondurma zme D ng leriFonksiyonel Genomik

İlgili makaleler