Burada adresli damlacık microarrays (ADM'ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM'ler kapasitesini göstermek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Sık sık hücresel davranış ve hücresel yanıt nerede birçok hücre yanıtları birlikte zengin tek hücre davranış karmaşık bir nüfus içinde maskeleme ortalama bir sonucu olarak havuza nüfus düzeyinde analiz edilir. Tek hücre proteini algılama ve miktar teknolojileri son yıllarda kayda değer bir etki yapmış. Burada bir pratik ve esnek tek hücre Analizi platform adresli damlacık microarrays üzerinde tabanlı açıklayın. Bu çalışma nasıl hedef proteinler mutlak kopya sayısına tek hücre çözünürlük ile ölçülen açıklar. Tümör baskılayıcı p53 ile toplam kanser vakalarının bir sigara sağlıklı p53 ifade deseni sergileyen % 50'den fazla insan kanseri en sık mutasyona uğramış gen var. Protokolü ile tam ifade değişkenlik belirlemek için tek molekül kararlılık içinde olan tek insan kanser hücreleri izole edilmiştir ve p53 protein kopya sayısı ölçülen 10 nL damlacıkları oluşturmak için adımları açıklar. Yöntem ilgi herhangi bir hedef proteinler mutlak kopya sayısını belirlemek için birincil malzeme dahil olmak üzere herhangi bir hücre türüne uygulanabilir.
Giriş
Bu yöntemin amacı bereket bir hedef proteinin hücre popülasyondaki özneleri, tek hücre çözünürlük varyasyon tespit etmektir. Tek hücre Analizi birçok geleneksel ensemble biyokimyasal yöntemlerle kullanılamaz avantaj sağlar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 öncelikle, tek hücre düzeyinde çalışan nüfusunun geleneksel ensemble biyokimyasal teknikleri ile oluşan sayı ortalaması alınarak kaybeden bir hücre zengin heterojenite yakalayabilirsiniz. Genellikle yapmak gibi çoğu iş-at biyokimyasal Yöntemler ile toplu, gerektiren, mi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hazırlık
-
Cips ve yazdırma antikor microarrays olun
- Bir yapışkan silikon/akrilik izolatör bir antikor Mikroarray desteklemek için functionalized bir coverslip ekleyin. Bu kozu olarak adlandırılır.
Not: Çeşitli yüzey kimyaları adresli damlacıkları ile uygunluk için test edilmiştir. 5 yüzey kimyaları alternatif yakalama maddeleri için optimize edilmiş olması gerekir. ADM izolatörler ticari olarak kullanılabilir veya lazer kesim akrilik tarafından üretilen (CAD için bu çalışmada kullanılan izolatör bir yükleme olarak sağlanan dosya; Ek kod dosyasınabakın). - Microarrayer üzerinde....
- Bir yapışkan silikon/akrilik izolatör bir antikor Mikroarray desteklemek için functionalized bir coverslip ekleyin. Bu kozu olarak adlandırılır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
P53 mutlak bazal protein kopya sayısı bir insan kolon kanseri hücre kültürünü, BE hücreleri tek hücre çözünürlük ile tespit edilmiştir. Biz nasıl p53 ifade büyüklükte birkaç emir üzerinde değişir ve hücre boyutu ve protein kopya sayısı içinde dinlenme BE hücre nüfus arasında bir zayıf pozitif korelasyon göstermek göstermek.
Sulu damlacıkları antikor spot yerlerde reçete ve yağ ile şapkalı adresli damlacık Microarrays oluşur. Bur.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Adresli damlacık Microarrays kantitatif tek bir hücrede bulunan protein mutlak kopya sayısını belirlemek için hassas ve genişletilebilir bir yöntemdir.
Non-spesifik bağlama düzeyini sınırlama (NSB) bir sınır tespiti mümkün olduğunca düşük olarak ulaşmak için iletişim kuralına önemlidir. Protein ve diğer biyokimyasal türler özellikle sigara bağlamak için arabirimler damlacıkları içinde mevcut bir dizi — coverslip yüzey, antikor nokta ve yağ/su arabirimi. Proteinler arabirimi veya petrol kendisi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
ASR deneyleri, protokolleri tasarlanıp geliştirildi veri analiz. SC ve PS hücre boyutu deneyleri yürüttü. ASR ve OC el yazması yazdı. Yazarlar minnetle Prof. David R. Klug destek ekipman erişim sağlamak için kabul etmek istiyorum. Yazarlar Imperial College gelişmiş Hackspace imalat ve prototip oluşturma özellikleri erişim için teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre kültürü | |||
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum (PBS) | DMEM | ||
| Teknolojileri Sigma | D6429 | ||
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| hücre kültürü şişeleri | Corning | SIAL0639 | |
| Tripsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Katalog Numarası | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, İngiltere | OmniGrid Mikro | |
| Mikrokontak pin | ArrayIt, ABD | 946MP2 | |
| Lameller (Nexterion) | Schott, Avrupa | 1098523 | Boyut (mm): 65.0 x 25.0; Kalınlık (mm) 0.17 |
| p53 yakalama antikoru | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 tespit antikoru, Alexa Fluor 488 etiketli | Santa Cruz | sc-126 | stok konsantrasyonu 200μ g / mL |
| Tuzlu su-sodyum sitrat tamponu | Gibco | 15557-044 | |
| Betain | Sigma | 61962 | |
| Sodyum dodesil sülfat | Sigma | L3771 | |
| 384 kuyu plakası (düşük hacimli) | Sigma | CLS4511 | |
| Azot gazı silindiri | BOC | Endüstriyel sınıf, oksijensiz | |
| < güçlü > Adı< / güçlü> | Company | Katalog Numarası | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipülator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manuel Mikroenjektör | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Origio, Danimarka | MBB-FP-L-0 | ||
| Şırınga pompaları | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μ L şırınga | Hamilton | 81020 | Gaz geçirmez, PTFE Luer kilidi |
| 1 mL şırınga | Hamilton | 81327 | Gaz geçirmez, PTFE Luer kilidi |
| Silikon izolatör | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | Yapışkanlı 6x4 kuyulu silikon izolatör |
| Lazer kesici | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Lazer 3W | Özel izolatörlerin lazer kesimi için |
| 1 mm kalınlığında akrilik levha | Özel izolatörlerin lazer kesimi için | Clarex Hassas Levha 001 | |
| izolatörleri mikrodizili lamellere yapıştırmak için kullanılan | yapışkan levha | 3M | |
| Süper yapıştırıcı | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 & mu; m Kimliği/360 ve mu; m OD erimiş silika boru | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID / 1/16 " OD PFA boru | IDEX | 1503 | |
| 0.014 " Kimlik/0.062" OD PTFE boru | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID / 2.0 mm OD FEP boru | IDEX | 1673 | |
| Sığır Serumu Albümin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral yağ | Sigma | M5904 | |
| Ultra saf su | Millipore, Almanya | MilliQ | |
| Name | Şirket | Katalog Numarası | Comments |
| Mikroskopi & Kodlanmış XY aşamalı optik | |||
| TIRF mikroskobu | Nikon, Japonya | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Teknolojileri, İrlanda | IXON DU-897E | |
| Lazer uyarma kaynağı | Vortran, ABD | Stradus 488-50 | |
| Optik lizis lazer kaynağı | Continuum, ABD | Sürelit SLI-10 | |
| Mikroskop TIRF | Chroma, ABD | z488bp | |
| Optik Lizis | Lazer 2000 | LPD01-532R-25 | |
| < güçlü > Adı< / strong> < | strong>Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Comments< / strong> |
| Software< / strong> | |||
| Fiji | Açık Kaynak | Görüntü analiz yazılımı | |
| Matlab | Mathworks | sürüm 7.14 veya üstü | Görüntü analiz yazılımı |
Kaynaklar
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
