Method Article

Viral Örneklerin Negatif Boyanması İçin Kapsüllerin Biyokontainment İçerisinde Kullanımı

DOI:

10.3791/56122

⸱

July 19th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 2Diagnostic Systems Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 3Microscopy Innovations LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, BSL-2, -3 veya -4 laboratuarlarında kolaylıkla kullanılabilen negatif boyama virüsü örnekleri için talimatlar sağlar. İletim elektron mikroskobu şebekesini koruyan ve biyokontainmenta giren daha çalkantılı ortamlarda kullanıcıya daha kolay taşıma olanağı sağlayan yenilikçi bir işleme kapsülü de dahildir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İletim elektron mikroskobu (TEM), virüslerin ve diğer mikrobik patojenlerinin nanometrenin çözünürlüğünü gözlemlemek için kullanılır. Çoğu biyolojik materyal, elektron saçarak görüntüyü oluşturmak için yoğun elementler içermez; Bu nedenle, yoğun ağır metal tuzlarını numune etrafına yerleştiren negatif bir leke gereklidir. Askıdaki virüsleri TEM altında görselleştirmek için sadece nanometre kalınlığında şeffaf bir yüzeye sahip küçük ızgaralara uygulanmalıdır. Küçük boyutları ve kırılganlıklarından dolayı, bu ızgaraları tutmak zordur ve hava akımlarıyla kolayca taşınırlar. İnce yüzey kolayca hasar görebilir ve numuneyi görüntü zorlaştırır ya da imkansız hale getirir. Bulaşıcı virüsler, biyogüvenlik kabininde (BSC) ele alınmalı ve bazıları biyolojik kontaminasyon laboratuar ortamına ihtiyaç duymaktadır. Biyogüvenlik düzeyleri (BSL) -3 ve -4'deki boyama virüsü, özellikle bu ortamlar daha çalkantılı olduğu ve teknisyenlere ihtiyaç duymaları nedeniyle zorlayıcıdır.• Kişisel becerileri azaltan kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin.

Bu çalışmada, biyolojik kontaminasyonda negatif boyama virüslerine yardımcı olacak yeni bir cihaz değerlendirildi. Cihaz, özel bir pipet ucu olarak çalışan bir kapsüldür. Izgaralar kapsüle yüklendikten sonra, kullanıcı virüsleri ve lekeleri kapsüllenmiş ızgaraya dağıtmak için reaktifleri kapsüle aspire eder, böylece ızgaraların kullanıcı tarafından taşınmasını ortadan kaldırır. Bu teknik BSL-3 veya -4 biyokontainment için özel olarak tasarlanmış olmasına rağmen, virüsün kolay negatif boyanmasını sağlayarak herhangi bir laboratuar ortamında numune hazırlamayı kolaylaştırabilir. Aynı yöntem, nanoparçacıkların, makromoleküllerin ve benzeri örneklerin negatif boyalı TEM numunelerini hazırlamak için de uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İletim elektron mikroskopisi (TEM), geleneksel ışık mikroskopu 1 , 2 , 3 , 4 ile görülemeyecek kadar küçük olan biyolojik örneklerin morfolojisini ve altyapısını görüntülemek için etkili bir araçtır. Elektronların ışıktan çok daha kısa bir dalga boyuna sahip olduğu için TEM'ler, elektronları çok ince bir numuneyle vurarak daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü üretir. Elektronları kirleten veya bloke eden örneklerin bölgeleri karanlık, elektron lucent olan bölgeler beyaz renktedir.

Elektron yoğun maddelerin olmaması, virüsleri bir TEM altında görmek zorlaştırır, çünkü elektronları dağıtamazlar. Negatif boyama, TEM ile kontrast oluşturmak ve virüsleri görüntülemek için kullanılan en yaygın yöntemdir. İlk negatif boyama prosedürü Hall (1955) ve Huxley'in (1957) gözlem yaptığı bir deney temelli 1959'da Brenner ve Horne tarafından önerildiBir elektron-yoğun bir madde 5 batırıldığında ters aksine biyolojik yapıların görünüşünü ved. Negatif boyama süreci, son yarım asır boyunca neredeyse hiç değişmedi. Negatif boyama kısaca virüsü 6 infiltre olmadan yoğun bir malzeme ile virüs çevreleyen için bir girişimde bir TEM ızgara üzerinde bir numuneye bir ağır metal tuzu çözeltisi uygulanmasını kapsar. Bu, koyu bir kenar oluşturur ve parçacığın şeklini ortaya çıkarır 5 . Bu çalışma negatif boyama için iki reaktif, uranil asetat (UA) ve potasyum fosfotungstik asit (PTA) kullanmaktadır. Bu lekelerin her ikisi de, virüsler, protein kompleksleri ve nanopartiküller 7 , 8 , 9 gibi küçük biyolojik örnekleri olumsuz şekilde lekelemek için sıklıkla kullanılır.

Geleneksel negatif boyama tekniği manuel damlacık negatif boyama teknolojisiNezaket 7 . Bu yöntem küçük miktarlarda virüs örneği, leke ve durulama uygulamak için forsepsle hassas, küçük, kırılgan TEM ızgaralarını kullanmayı gerektirir. Tipik hazırlama protokolü, bir film kaplı TEM şebekesinin yüzeyine örnek süspansiyon damlacıklarının uygulanmasını içerir ( Şekil 1A ). Numunenin film yüzeyine tutturulmasından sonra, ızgara yapışkan olmayan virüsleri gidermek için durulandı ve numunenin türüne bağlı olarak birkaç saniye ila bir dakika için UA veya PTA ile boyandı. Aşırı sıvı, ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaradan uzaklaşır.

Manuel damlacık yöntemi, her bir ızgaranın ayrı ayrı yapılması gerekliliğini belirtir. Dikkatle ele alınmazsa, kaplamalı TEM ızgaraları kolayca delinir, bükülür veya kontamine olur. Birden çok numunenin işlenmesi, ızgaraları izlemek ve her numune için tutarlı boyamayı sağlamakta zorluklara neden olabilir. Bu elle boyama prosedürü çok daha fazla dBu ortamlar için gerekli olan kişisel koruyucu ekipman (KKD) nedeniyle biyogüvenlik seviyesi (BSL) -3 ve -4 biyolojik kontaminasyon laboratuvarlarında yürüttüklerinde güçlük çekmektedir. KKD hantaldır ve biyokontainment ortamı düzenli bir laboratuara kıyasla çok daha çalkantılıdır. BSL-3 biyolojik kontaminasyon laboratuarlarında çalışan personelin 2 çift eldiven giymesi ve biyogüvenlik kabininde (BSC) çalışması gerekiyor. Bu çift kat eldiven dokunma duyarlılığını azaltır ve ince motor hareketini kısıtlar. Kullanıcıyı koruyan ve numunenin kirlenmesini önlemeye yardımcı olan BSC'nin hava akışı, örneklerin ve lekelerin çok çabuk kurumasına ve böylece leke kalitesinin bozulmasına neden olabilir. BSC'deki güçlü türbülanslı hava akışı, iyi korunmayan bir ızgarayı da çabucak uzaklaştırabilir. BSL-4 biyolojik kontaminasyon laboratuarlarında ek güvenlik gereklilikleri vardır. Personelin, fiziksel hareketi ve açıkça görme ve manipüle etme kabiliyetini kısıtlayan pozitif basınç giymeyi giymesi gerekiyorUlate ızgaraları. BSL-4'te çalışan teknisyen de en az 2 çift eldiven giyiyor; dış çift eldiven ve dokunsal duyumu büyük ölçüde azaltan kalın eldiven. Son olarak, TEM ızgaralarını tutan forsepsler keskin olduğundan, teknisyene eldivenlerini delme yetenekleri nedeniyle bir risk oluşturuyor. Izgara içeren kapsüller ile, forseps gerekli değildir, böylece biyolojik kontaminasyonda ızgaraları manipüle etmek için forsepsten muaf bir alternatif sağlar. Son olarak, kapsüller aynı zamanda işleme, osmiyum buhar dekontaminasyonu ve depolama sırasında ızgaraları depolamak için etkili bir yol sağlar; Böylece ızgaraları düzenli ve hasar görmeden muhafaza eder.

Bu raporda, mPrep / g kapsüller, ızgara kullanım ve 10, 11, 12 lekelenmesi için bir kapsül bazlı cihaz kullanan biyolojik sınırlama laboratuarlarında negatif boyama TEM ızgaraların için yeni bir yöntem sunar. Kapsül kayitlariİki TEM ızgarasını değiştirir, direkt kullanımını en aza indirir ve ızgara hasarı olasılığını azaltır. Kapsül, içinde bulunan ızgaralara çeşitli sıvıların uygulanmasına izin verecek şekilde, bir pipet ucu gibi doğrudan tek veya çok kanallı bir pipete bağlanır. Bu, çoğaltılmış ızgaralarla birden çok numunenin aynı anda hazırlanmasını sağlar ( Şekil 1B ). Kapsüllü negatif lekeye virüs örneği kapsül içine aspire edilir ve virüslerin ızgaralı yüzeylere adsorbe olmasını sağlamak için 10 dakika bekletilir. Adsorbe edilen virüslü ızgaralar daha sonra deiyonize (dI) su ile yıkanır ve birkaç saniye ila 1 dakika boyunca UA veya PTA ile boyanır. Bu işlem, manuel damlacık yöntemi ile aynı protokol adımlarını ve reaktifleri kullanır; Fark, tüm işlerin ızgaraların fiziksel olarak ele alınması olmadan kapsül içinde gerçekleşmesidir. ( Şekil 1C , 1D ).

Bu çalışmanın amacı, kapsüllerinBiyokontainment ortamlarında virüs örneklerinin negatif boyanması için yeni bir yöntem. Bu çalışma ayrıca, iki farklı virüs inaktivasyon prosedüründen üretilen TEM görüntülerinin kalitesini inceledi: 1)% 1 osmiyum tetroksit buharı ile hızlı inaktivasyon ve 2)% 2 glutaraldehitle 24 saat inaktivasyon. Her ikisi de kapsülleri kullanarak gerçekleştirildi. Son olarak, yaygın olarak kullanılan negatif lekeleri, UA ve PTA'yi kapsülde kullanmak için değerlendirdik. 13

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Virüs Örnekleri ile Çalışma Yapmadan Önce Bir BSL-2 Ortamında Deney Hazırlama

  1. Formvar ve karbon kaplı TEM bakır ızgaraları hazırlayın veya satın alın, genellikle 200-400 mesh'dir.
  2. Kaplanmış TEM ızgaralarını kapsüllere yerleştirin.
    1. Bu işlemi gerçekleştirmek kolaylaştırmak için büyütülmüş bir mercek kullanın. Her bir kapsüle bir veya iki ızgaralar takılabilir. İstenirse, bu adımı ortadan kaldırmak için önceden yüklenmiş kapsüller satın alınabilir.
  3. Eklenmiş TEM kaplamalı ızgaralı kapsülleri, diğer malzemeler ve reaktiflerle birlikte, virüslerin olumsuz olarak lekelenebileceği biyolojik kaplara aktarın.

2. Sulu Glutaraldehit ve% 1 Osmiyum Tetroksit Buharı İnaktivasyonu Kullanan Biyokontainment Sırasındaki Negatif Boyama İçin Kapsül Yöntemi

  1. Biyokontainment BSC içinde, pipetle takılı kapsüle 40 μL virüs süspansiyonu aspire edin.
    Not: pipet bağlı kalırE kapsülü tamamlanana kadar. Virüs hazırlığı bir önceki yayımıza 14 göre yapılır.
  2. Yatay olarak yönlendirilmiş ızgaralar ile pipeti 10 dakika yan yatırın. Bu, virüs parçacıklarının kaplamalı ızgaralara eşit dağılımını sağlamaktır.
  3. Biyokontainment BSC içindeki kapsül içindeki virüsü etkisiz hale getirin.
    1. Virüs solüsyonunu bir atık kabına boşaltmak için pipeti alıp pistona basınız.
    2. Kapsüllere 40 μL% 2 glutaraldehit sabitleyici aspire edin.
      Dikkat: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun bir koruma gerektirir. Glutaraldehit, normal bir BSC'de kısa süreli olarak kullanılabilir, ancak uzatılmış açık reaktif, kanallı bir BSC veya kimyasal duman davlumbazında çalışmayı gerektirir.
    3. Pipeti 20 dakika boyunca yan yatırın. Bu, örneklerin iyi sabitlenmesini sağlamaktır.
    4. Fiksatifi dışarı atın ve 40 μL dI suyun kapsüllere asılması için suyunu boşaltın.Katılan fiksatif maddeyi. Bu yıkama adımını toplam 3 durulama çevrimi için tekrarlayın.
  4. % 1 uranil asetat (UA) veya% 1 potasyum fosfotungstik asit (PTA) 40 uL'yi kapsüllere aspire edin ve 30 saniye boyunca bekletin.
    NOT: Boyama zamanı, virüs numunesine göre 10 saniyeden 1 dakikaya kadar değişebilir.
    Dikkat: UA, bir alfa yayıcı ve birikimli toksindir. Uygun koruma ile tutun.
  5. Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaralar kapsülde kalırken ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaraları kurutun.
  6. Osmium Tetroksid Buhar inaktivasyon prosedürü.
    1. Kapsülü, kapak açıkken,% 1 osmiyum tetroksit solüsyonuna batırılmış filtre kağıdı içeren 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
      Dikkat: Osmiyum tetroksit, düşük buhar basıncı ile son derece toksiktir. Kanallı BSC veya kimyasal duman davlumbazında kullanılmalıdır. Uygun koruma ile tutun. Mesaj uyarısıÇalışma alanında bilgi.
    2. Osmiyum tetroksit buharı tamamen nüfuz edebilmek için 50 ml'lik santrifüj tüpünü 1 saat boyunca mühürle. Ardından, biyokontainmentten tüpü dezenfekte edin ve BSL-2 EM tesisine aktarın.
  7. EM ızgaraları kapsülden çıkarın.
    1. BSL-2 EM tesisinde, kapsülü santrifüj borusundan çıkarın ve pipet üzerine yerleştirin.
    2. Kap içine 40 uL dI su emdirin ve suyu üç kez bir atık kabına boşaltın.
    3. Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaraların kenarına dokunmak için ızgaraları filtre kağıdı ile kurutun.
    4. Hava ile kurutulduktan sonra, ızgaraları sonraki TEM görüntüleme için saklayın.

3. Bir BSL-2 Laboratuvarında Negatif Boyanmayı takiben% 2 Glutaraldehit ile Biyokontainment'ta İnaktivasyon Kapsül Yöntemi

  1. Virüs inaktivasyon prosedürü.
    1. Biyokontainment BSC'nin içinde,% 2 glutaraldehid'in nihai konsantrasyonunu sağlamak için virüs süspansiyonunu aynı hacimde% 4 glutaraldehit ile iyice karıştırın.
      Dikkat: Glutaraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun bir koruma gerektirir. Glutaraldehit, normal bir BSC'de kısa süreli olarak kullanılabilir, ancak uzatılmış açık reaktif, kanallı bir BSC veya kimyasal duman davlumbazında çalışmayı gerektirir.
    2. Virüsleri, paketlemeden önce en az 24 saat fiksatif ile etkisiz hale getirin, dekontaminasyon ve BSL-2 EM tesisine aktarın.
  2. BSL-2 EM tesisinde, virüs ve sabitleyici karışımı bir pipetle bağlı iki TEM ızgarasını içeren kapsüle aspire edin.
  3. Izgaralar yatay yönlendirilmiş olarak pipeti yatay olarak 10 dakika yerleştirin.
    NOT: Bu, TEM ızgaralarına virüs partiküllerinin eşit dağılımını sağlamak içindir.
  4. Virüsü atık kabına atmak için pipeti alıp pistona bastırın. 40 uL dI aspiratSuyunu kapsüller içine boşaltın ve 3 durulama döngüsü için atık kabına atın.
  5. 30 μs boyunca kapsüllere% 1 UA veya% 1 PTA'dan 40 μL aspire edin.
    NOT: Boyama süresi, virüs numunesine göre 10 saniyeden 1 dakikaya kadar değişir.
    Dikkat: UA, bir alfa yayıcı ve birikimli toksindir. Uygun koruma ile tutun.
  6. Kapsül pipetten çıkarın ve ızgaranın kenarına bir filtre kağıdına dokunarak ızgaraları kurutun. Izgaraları havayla kurutun ve sonraki TEM görüntüleme için saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsül yöntemi, TEM görüntüleme için kaliteli negatif boyama üretir:

Birincisi, manuel damlacık yöntemi ve negatif Zeire ebolavirüs lekelenmesi için kapsül yöntemleri kullanılarak üretilen görüntülerin kalitesini değerlendirdik. Ebolavirüsler Marburg virüsü ile birlikte Filoviridae ailesinin üyeleridir. Ebolavirüs genellikle çapı 80 ila 100 nm arasında olup 1000 nm'nin üzerinde olabilir. Ebolavirüs BSL-4 biyolojik kontam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negatif boyama, virüsleri, protein komplekslerini ve nanoparçacıkları değerlendiren ve boyutlandıran değerli bir TEM tekniğidir. Bu örneklerin reaktiften negatif lekelere manuel olarak hareket ettirilmesiyle damlacık hazırlanması, yarım yüzyıla kıyasla klasik bir protokoldür. Bu basit bir süreçtir, ancak başarıyla tamamlanması için eğitim yoluyla edindiği uzmanlığı gerektirir. Mükemmel negatif boyama hala pek çok TEM laboratuarında son teknoloji beceri seti olarak düşünülmektedir. Kapsül yöntemi, özellikle biyokonsolida...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makalede belirtilen görüş, yorum, sonuç ve tavsiyeler yazarların görüşleri olup, ABD Ordusu ya da Savunma Bakanlığı tarafından onaylanmayabilir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

John Carra ve Rowena Schokman'a saflaştırılmış Ebola nano-VLP'lerini sağladıkları için teşekkür ediyoruz, Dr. Rajini Mudhasani, Chikungunya virüsünü sağlıyor ve Dr. Charles (Jason) Shoemaker, Ebolavirüs glikoproteinlerini ifade eden Murin Lösemi VLP'lerini sağlamaya teşekkür ediyoruz. Yaz Staj Programını (SIP) ve Bilim ve Mühendislik Çıraklık Programını (SEAP) ve Dr Catherine Wilhelmsen'i laboratuvar güvenliği eğitimi için kolaylaştırdıkları için MAJ Carl Soffler'a teşekkür etmek isteriz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Formvar/karbon kaplı TEM ızgaralarıSPI3420C-MB200 gözlü Cu Pk/100
mPrep/g kapsüllerEMS85010-01kutu
mPrep/f kuplörlerEMS85010-11standart 16/Pk
glutaraldehdydeEMS16320%50 çözelti, EM sınıfı
Osmiyum TetroksitEMS19190%4 sulu çözelti
Uranil AsetatEMS22400toz
Potasyum fosfotungstik asitEMS19500toz
filtre kağıdıWhatman1450-090boyut 50
Elektron MikroskobuJEOLJEM-1011TEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721(2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228(2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419(2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Negative StainingTEM GridsBiocontainmentVirus TEMCapsule MethodElectron MicroscopyGlutaraldehyde FixativeUranyl AcetatePhosphotungstic AcidOsmium Tetroxide

Related Articles