Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

8.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

20 Ağustos 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

Bu makalede

Özet

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Özet

Fare embriyonik kök hücre (mESC) türetme tarafından hangi pluripotent Preimplantasyon embriyoların hücre hatları kurulur işlemidir. Bu satırları yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar altında ayırt etmek için korur. Bu özellikleri nedeniyle, mESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları yararlı bir araç vardır. Bu makalede mESC hatları yüksek türetme verimliliği (% 60-80) ile elde etmek için basit bir protokol blastokistlerin keyfi fare suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan tanımlanmış orta lösemi inhibitör faktörü ile takıma gelen Kültür tarafından açıklanır. Protokol Ayrıca verimli bir şekilde mESC satırları keyfi fare suşları türetmek için iki küçük molekül inhibitörleri türetme orta (2i orta) bir kokteyl basit eklenmesiyle uygulanabilir. Hazırlık ve besleyici hücreler, toplama ve fare embriyolar ve türetme kültür ve kültür mESC satırlarının kültür üzerinde ayrıntılı yordamlar sağlanmaktadır. Bu iletişim kuralı özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir laboratuvar temel memeli hücre kültür uzmanlığı ile yapılabilir.

Giriş

Embriyonik kök hücreleri (ESC) yeteneği kendini yenilemek veya belirli koşullar1altında ayırt etmek için korumak Preimplantasyon embriyo elde pluripotent hücreler vardır. Bu özelliklere dayalı, ESC rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve doku mühendisliği çalışmaları2için yararlı bir araç olmuştur.

ESC den türemiş olan ilk kez fare ESC (mESC) hatları düşük başarı3,4ile kaynaklanan Preimplantasyon fare embriyo. Yıllardır, türetme verimliliği pluripotency içinde vitromuhafaza zorluğu nedeniyle düşük kaldı. Ayrıca türetme verimliliği artırmak, besleyici hücreler5' varlığı koloni eki tanıtmak ve karyotip istikrar6, birçok değişikliği bir iyileşme pluripotency bakım iletişim kuralı müşteri adayının geliştirmek. MESC kültür orta7,8, embriyo 129S2 keyfi arka plan9 kullanımı için en önemli yanı sıra, lösemi inhibitör faktörü (LIF) vardı ve mESC ile takıma orta ile Kültür tanımlanan serum, potansiyel farklılaşma ücretsiz10faktörler. Daha yakın zamanlarda, kanıt zorlayıcı bir kokteyl mESC kültür (2i da bilinir) orta sinyal yollar iki küçük molekül modülatörler ilavesi pluripotency korumak en iyi olduğunu göstermiştir. MEK inhibitörü farklılaşma sinyalleri mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) yolu engelleyerek azaltır, PD0325901 ve GSK3β inhibitörü hücre sağkalım, düşük yoğunluklu geliştirir CHIR99021 2i kokteyl oluşur Wnt yolu11etkinleştirerek.

Bugünkü yazıda, verimli bir şekilde mESC satırları fare blastokistlerin türetmek için basit bir protokol açıklar. Standart prosedürler, keyfi suşların besleyici hücreleri üzerinde yapılan türetme orta LIF ve serum yerine12ile gelen embriyo kültürü takip ediyoruz. Bu iletişim kuralı, mESC çizgileri takip verimliliği 2i ortamda elde edilen eşdeğer ile elde edilebilir. Buna rağmen 2i sigara keyfi suşları ile çalışırken pluripotency bakım veya olası sorunlardan kaçınmak için eklenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hayvanlar kullanımı etik Komite, hayvan ve insan araştırma Universitat Autònoma de Barcelona ve Departament d tarafından onaylanıp ' tarımsal, Ramaderia, Pesco ben Alimentació Generalitat de Catalunya (iletişim kuralı #8741).

1. Besleyici hücre Inactivation ve depolama

Not: insan sünnet derisi fibroblastlar (HFF-1) daha önce dondurulmuş dondurma çözüm oluşan % 90'ı Fetal sığır Serum (FBS) ve % 10 Dimetil sülfoksit (1 mL DMSO) ve sıvı azot kadar kullanmak saklı.

  1. 37 ° C su banyosu şişede çeker tarafından HFF-1 (1 mL) kriyojenik bir şişe çözülme.
  2. Kriyojenik şişeyi çözdürülen içeriğini eklemek için Önceden ısıtılmış Dulbecco ' s modifiye kartal ' s orta (DMEM) % 10 ile desteklenmiş bir 1:10 yapmak FBS seyreltme.
  3. Bir T75 şişesi seyreltilmiş hücreleri (10 mL) tohum ve 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de kültür.
  4. Ertesi gün DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için orta değiştirin. Orta kaldırmak ve 10 mL % 10 ile desteklenmiş Önceden ısıtılmış DMEM ekleyin FBS.
  5. HFFs kültür ve kültür Konfluent sahne ulaşıncaya kadar her 48 h orta değiştirin. Bu yaklaşık 7-10 gün sürebilir.
  6. İnactivation çözüm hazırlamak, mitomycin C DMEM % 10 ile desteklenmiş sulandırmak için 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon, FBS. 37 ° C ve % 5 CO 2 3 h için inactivation çözüm hücrelerle kuluçkaya.
  7. İnactivation çözümü kaldırmak ve 2 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (mitomycin C kalıntıları ortadan kaldırmak için HBSS) üç kez hücrelerle durulayın.
  8. Inaktif hücreleri ayırmak için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO 2 5 min için kuluçkaya.
  9. Gözlemlemek müstakil olduklarından emin olmak için ters bir mikroskop altında hücreler (0.3 sayısal diyafram veya NA ile 10 x amaç). Eğer değillerse, onları birkaç dakika 37 ° C ve % 5 CO 2 için kuluçkaya. Yine ters mikroskop altında hücreleri denetleyin.
  10. Hücre kümeleri ayırmak için bir Pasteur pipet ile çözüm pipette.
  11. %10 FBS ve resuspend ile DMEM 4 mL ekleyerek enzimatik solüsyona nötralize.
  12. Bir aliquot hücre süspansiyon take ve HBSS içinde 1: 100 seyreltme. Hücre sayısını belirlemek için bir Neubauer seyreltme 10 µL yük ' s odası. Bir büyük kareler Odası (20 x amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında yer alan hücreleri saymak.
    1. Tekrar dört büyük kareler toplamda sayma. N (N) hücrelerinin sayısı toplam hesaplamak hücreleri ortalama sayısı = toplam hacim seyreltme x 10 4 x x sayılan.
  13. 200 x g. atma, 5 min için örnek kalan süpernatant santrifüj kapasitesi ve çözüm mL başına 10 6 hücre bir konsantrasyon, dondurma ile Pelet resuspend.
  14. Aliquot 10 6 hücre (1 mL) ile kriyojenik şişeleri süspansiyon. Kriyojenik şişeleri bir dondurucu kapsayıcısına getirin ve-80 dondurma ° C.
  15. Ertesi gün, kriyojenik şişeleri sıvı azot depolamak.

2. Besleyici hücre kültür

  1. 1-4 gün türetme işlemine başlamadan önce tezcan 1 x 10 6 içeren bir kriyojenik şişe su banyosu 37 hücrelerde HFF-1 inaktive olur ° C.
  2. 1:6 seyreltme çözdürülen HFF-1'in önceden %10 FBS ve tutmak sıcaklığı 37 ile takıma DMEM sıcak yapmak ° C.
  3. Her şey bir 4-şey plaka 500 µL Önceden ısıtılmış % 0,2 jelatin domuz deri ile doldurmak ve 10 dakika süreyle 37 ° C'de plaka tutmak
  4. Jelatin 500 µL kuyulardan kaldırın ve HFFs seyreltme 500 µL ekleyin. Yavaşça HFFs kuyu dibinde bir tekdüze dağılım sağlamak için plaka rock. Dairesel hareketleri önlemek, aksi takdirde hücreleri iyi merkezinde odaklanacaktır.
  5. En az 24 saat her iyi Inaktif HFFs monolayer elde etmek için 37 ° C ve % 5 CO 2 s plaka kuluçkaya.
  6. Ertesi gün (10 X amacı ile 0.3 NA) ters bir mikroskop altında hücreler gözlemlemek ve bağlı ve homojen dağıtılmış kontrol edin. Orta DMSO kalıntıları ortadan kaldırmak için değiştirin. Orta kaldırın ve Önceden ısıtılmış DMEM % 10 ile desteklenmiş 500 µL ekleyin FBS.

3. Embriyo toplama ve kültür

  1. dört gün öncesine embriyo koleksiyonu, yönetmek hamile kısrak 5 IU ' s serum gonadotropin 6-12 hafta yaşlı kadın farelere mayi enjeksiyonla.
    Not: diğer fare suşları kadın-ebilmek var olmak kullanılmış olsa biz 129S2 veya B6CFAF1 suşları, kadın kullandık. Yine de, ne zaman sigara keyfi suşları (örneğin CBA), kadın ile orta çalışma takıma 2i ile adım 4.2 belirtildiği gibi.
  2. Sonra 48 h, insan Korionik gonadotropin 5 IU mayi enjeksiyonu ile yönetmek ve kadın erkek, en az 8 haftalık bir 1:1 oranında, dostum. Dişiler erkeklerin ertesi gün ayırın.
  3. Embriyo koleksiyonu, önceki gün 35-mm hücre kültürü Petri kabına KSOMaag orta sığır Serum Albumin (BSA) 4 mg/mL ile desteklenmiş çeşitli 40 µL damlaları ile hazırlamak ve plaka tamamen damla kapsayacak şekilde mineral yağ ile doldurun. Orta equilibrate için 37 ° C ve % 5 CO 2 çanak kuluçkaya.
  4. Embriyo manipülasyon Pipetler, hazırlamak için ısı uzun uçlu cam Pasteur pipet Bunsen burner kullanarak ince parçası. Yumuşak bir kez alev geri çekilin ve iki ucu ayır. İstenilen uzunlukta kesin. İç çapı uç-meli var olmak 100-150 µm.
  5. Servikal çıkığı 45-48 h mesaj coitum tarafından (PC) kadın fareler ötenazi.
  6. Eğri pürüzsüz keskin makas ile cilt ve karın zarını düz keskin makas ile kesme ile karın boşluğu ortaya çıkarmak için fareler incelemek. Bir rahim Forseps ile kapmak, düz keskin makas kullanarak ovidukt keser ve CZB Hepes tampon orta (HCZB) 13 37 yerleştirir ° C. diğer ovidukt kaldırmak için yineleme işleminin.
  7. Oviducts 1 mL şırınga ile yüklenen HCZB ile flush 2 hücreli embriyo toplamak için saatçi forseps tarafından yerinde düzenlenen.
    Not: 30 G Hipodermik İğne reçeteye göre sarf iğne almak hazırlamak için sonunda kesti ve zemin bir Zımpara taşı künt bir ipucu için.
  8. Embriyo çekme ağzını pipet aparatı kullanıyorsanız, içinde HCZB yıkama onları ve onları önceden hazırlanmış embriyo kültür tabağına 37 ° C ve % 5 CO 2 blastosist aşaması kadar kültür. En fazla 50 embriyolar her 40 µL düşüş kültürlü olabilir. İzlemek embriyo gelişimi her 24 saat bir stereomicroscope altında.
    Not: Alternatif olarak, embriyoların blastosist aşamada vitro embriyo kültürü kısaltmak için toplanabilir. Bu durumda, dişiler gün 3.5-4.5 p.c. ötenazi, rahim incelemek. ve HCZB ile flush.

4. Kök hücre elde edilmesini

  1. hazırlık türetme plakaların
    1. embriyo tohum, gün hazırlamak türetme orta DMEM orta 100 µM 2-β mercaptoethanol, 1 ile ilave tarafından x sigara-esansiyel Amino asitler , serum değiştirme ve 10 %20 3 U/mL LIF.
    2. İsterseniz, ayrıca MEK inhibitörü PD0325901 1 µM ve 3 öneki GSK3 inhibitörü CHIR99021 2i orta elde etmek için µM.
    3. 4-şey plaka Inaktif HFFs (Adım 2.6) monolayer ile al kuluçka makinesi. Orta kaldırın ve her şey için Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL ekleyin. Plaka da kuluçka için iade.
  2. Zona pelusida kaldırma ve tohum embriyo
    1. bir 35 mm hücre kültürü Petri kabına asit Tyrode üç 30 µL damla ile hazırlamak ' s çözüm 14 ve türetme orta üç 30 µL damla. Damla mineral yağ ile kapak ve 37, çanak tutmak ° C.
    2. Embriyo kültürü bulaşık kuluçka makinesi alın. Birer birer, bir asit Tyrode kültür damla blastokistlerin transfer ' s çözüm açılan bir embriyo manipülasyon pipet kullanarak. Mümkünse, yalnızca genişletilmiş blastokistlerin türetme işlemini başlatmak için seçin.
    3. Monitör zona pelusida sindirim stereomicroscope altında. En kısa zamanda zona pelusida kaybolur, blastosist asit Tyrode yıkamak için bir türetme orta damla transfer ' s çözüm.
    4. Kuluçka ve tohum bir zona ücretsiz blastosist Besleyici üzerinde 4-şey türetme plaka hücreleri her kuyuya atın.
    5. Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür 37 ° C ve % 5 CO 2 4-şey türetme plaka dönmek.
  3. İzleme kök hücre büyüme ve orta değiştirmek
    1. kültürler her 24 h (20 X amacı ile 0,45 NA) ters bir mikroskop altında izlemek. Kök hücre farklılaşması, akıbet çevreleyen veya bile besleyici hücreler bir kenara iterek şişmiş refraktif hücreleri gibi belirtileri olup olmadığını unutmamak gerekir.
    2. Her gün, kültür ortamı değiştirin. 4-şey plaka kuluçka, orta her kuyudan çıkarmak alıp LIF ve 2i, Önceden ısıtılmış türetme orta 800 µL kullandıysanız ekleyin. Outgrowths (6-8 gün) gözlenir kadar kültürü korumak.

5. Kök hücre kültür ve bakım

  1. hazırla Kolle benzeri kolları ve kök hücre manipülasyon Pipetler. Takip adım kök hücre manipülasyon Pipetler ucundaki 250-300 µm. bir iç çapı ile hazırlamak için 3,4 Kolle benzeri tanıtıcı hazırlamak için çekti Pasteur pipet diğer parçası kullanın. Isı ve bir kanca almak kadar şekil.
  2. 4-şey kültür plaka kuluçka makinesi dışarı almak ve bir stereomicroscope altında çıkıntı bulun. Farklılaşmış hücreler ve akıbet çevreleyen besleyiciler uzaklaştırmak için tutamacını kullanın.
    Not: nihai sonucu farklılaşma önlemek için akıbet kenarından farklılaştırılmış hücrelerin tümünü kaldırmak öenmlidir.
  3. Yapılan bir kök hücre manipülasyon pipet ile Aspire edin ve yeni bir tabak içinde 50 µL tripsin-EDTA damla yerleştirebilirsiniz.
  4. Mekanik ve enzimatik disaggregate için çeşitli yerlerinde yapılan kesmek için bir neşter kullanın.
  5. Hemen, akıbet parçaları türetme orta tripsin eylem nötralize etmek için taze bir damla transfer.
  6. Çıkıntı parçaları besleyiciler monolayer ile yeni bir 4-şey plaka aktarın. İyi başına en çok 10 parça aktarmak ve onları türetme orta 37 ° C ve % 5 CO 2 ile kültür.
  7. Kurulan mESC satırı düşünmeden önce en az altı hafta için kök hücre benzeri kültürleri korumak. Her gün ve alt kültür orta değiştirmek onları haftada bir kez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı üzerinde kültür (şekil 1A) ilk hafta sonra sonucu oluşumu % 95'i elde edilmelidir. Altı pasajlar sonra mESC satırlarının kurulması arasında deneysel çoğaltır, % 60-80 ortalama bir başarı ile değişkendir. 2i eklenmesi önemli ölçüde sonuçları 129S2 arka plan olanlar gibi keyfi fare suşları ile çalışırken yükseltmek değil ama sigara keyfi suşları ile çalışırken gereklidir.

Fare ESC k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MESC satır türetme rutin olarak birçok laboratuvarlarda kullanılan iyi bilinen bir işlem olmakla birlikte, verimlilik her zaman pluripotency bakım rahatsız edemez Multipl faktörler nedeniyle beklendiği gibi yüksek değil. Mevcut makalede biz, adım adım, basit ve güvenilir bir iletişim kuralı kullanılarak yüksek verimliliği ile mESC satırları oluşturmak nasıl gösterir. Bu verimliliği literatürde bildirilen benzer.

Maksimum verimliliği sağlamak için hücreleri her gün kontrol etmek önemli ya da he...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Jonatan Lucas besleyici hücre kültürü, Servei Estabulari de la UAB hayvan bakımı için ve Domènec video kayıt için Martín ile onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser "gayri resmi" de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R ve Generalitat de tarafından desteklenen Catalunya 2014 SGR-524. MVC PIF-UAB bursu yararlanıcı olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırıngaBD 
2-β-merkaptoetanolYaşam Teknolojileri31350-010
4 kuyulu plakaThermo Scientific Nunc176740
Asidik Tiroz çözeltisi Ev yapımıNagy ve ark., 2003'te tarifine bakın. Kısa süreli depolama için (1 aya kadar) 4 ° C'de tutun. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için -20 ° C'de tutun. Çözeltinin etkinliği azalırsa, küçük bir damla HCl 1M ilavesiyle asitleştirilmelidir.
BSASigmaA3311
Tavuk anti-Fare IgG, Alexa Fluor 488Moleküler Problar - InvitrogenA-212001:500 seyreltme. Oct4, Tuj1, αSMA ve AFP fare antikorları için ikincil antikor. 
CHIR990212Akson Medchem 13861 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için her mg toz için 2.15 ml DMSO ile sulandırın. İstenilen hacimde alikotlayın ve -20 ° C'de saklayın. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının.
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Kullanmadan önce 56 ° C'de 30 dakika ısıtarak etkisiz hale getirin ve -20 ° C'de saklayın; C
Yıkama iğnesiBD 304000İğnenin ucunu kesin ve aşındırıcı bir taş üzerinde künt bir uca kadar öğütün
Domuz derisinden elde edilen jelatinFluka48724Somuklu suda %0,2 oranında seyreltin ve otoklavlayın. Her seyreltme bir ay boyunca kullanılabilir.
Keçi anti-Tavşan IgG, Alexa Fluor 594Moleküler Problar - InvitrogenA-110371:500 seyreltme. Sox2 tavşan antikoru için ikincil antikor.
HBSSBioWestL0611
Hepes tamponlu CZB Ev yapımıChatot ve ark., 1989'daki bileşime bakın
İnsan koryonik gonadotropinDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UI50 IU / ml'de% 0.9 NaCl içinde seyreltin. 1 ml'de aliquot ve -20º'de saklayın; İki aya kadar C. Çözüldükten sonra tekrar donmayın.
İnsan sünnet derisi fibroblastlarıATCCATCCSCRC-1041Uzun süreli depolama için sıvı azot içinde saklanması tavsiye edilir.
KnockOut Serum Replasman ÖmrüTeknolojileri  10828-028Işığa duyarlı. 10 ml gibi küçük hacimlerde alikot edilmesi ve -20 ° C'de saklanması tavsiye edilir; C (son kullanma tarihini kontrol edin). Donma ve çözülme döngülerinden kaçının.    
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Takviye Edici Gıda, 4 mg/ml BSA. 37º'de dengeleyin; Kullanmadan önce C ve günde %5 CO2.
Lösemi İnhibitör FaktörMerk MilliporeESG1106
Fareler Charles River/HarlanmESC türevi açısından izin verilen bir suştan (129S2 veya C57BL gibi) farelerin kullanılması önerilir. Bununla birlikte, akrabalı yetiştirme suşları, embriyo üreten daha az verimlidir. Bu nedenle, hibrit güçten yararlanmak için 129S2 x C57BL veya B6CBAF1 gibi hibrit bir suş kullanılması önerilir.
Mineral yağSigmaM8410Embriyo test edilmiştir. Işığa duyarlı. 
Mitomisin CServa2980501Tozu MilliQ su ile 0.5 mg / ml'de sulandırın. 4 >m'de saklayın; C ışıktan korunmuştur. Dikkat, zararlıdır ve kansere neden olduğundan şüphelenilir.
Fare anti-tubulin ve beta; III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 seyreltme
Fare monoklonal anti-&alfa;SMASigmaA52281:200 seyreltme
Fare monoklonal anti-AFPR& D SistemleriMAB13681:50 seyreltme
Fare monoklonal anti Oct3 / 4 Santa cruzSc-52791:50 seyreltme
Esansiyel Olmayan Amino AsitlerYaşam Teknolojileri11140-035
PD0325901Axon Medchem 14081 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için her mg toz için 2.08 ml DMSO ile sulandırın. İstenilen hacimde alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının.
Petri kabı (35mm)Thermo Scientific Nunc153066
Petri kabı (60mm)Thermo Scientific Nunc150288
Gebe kısrak serumu gonadotropinFoligonFoligon-1000 UI50 IU / ml'de% 0.9 NaCl içinde seyreltin. 1 ml'de aliquot'layın ve -20 ° C'de saklayın; İki aya kadar C. Çözüldükten sonra tekrar donmayın.
Tavşan poliklonal anti-Sox2Merck MilliporeAB56031:200 seyreltme
T75 şahinThermo Scientific130190
Tripsin-EDTA 10xBioWestX09301x çözelti elde etmek için HBSS'de 1:10 oranında seyreltin
309628

Kaynaklar

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Embriyonik Kök HücreleriEmbriyo KültürüBesleyici Hücre HazırlamaBlastokist TüretmeLösemi İnhibitör Faktörü2i OrtamıZona Pellucida UzaklaştırmaKök Hücre SubkültürüPluripotens BelirteçleriGerm Tabakası Diferansiyasyonu
Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.