Method Article

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

DOI:

10.3791/56176

⸱

January 10th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP'nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glioblastoma (GBM) yaklaşık 14.000 ölümlerin her yıl ABD tek başına neden erişkinlerde en sık görülen ve en ölümcül birincil beyin tümörü olduğunu. Medyan sağkalım tanı takip maksimal cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve temozolomide kemoterapi ile 15 aydan daha az oldu. Daha etkili GBM tedaviler geliştirmede içsel sorunları giderek açık olmuştur ve onun inatçı invasiveness, dayanıklılığı, standart tedaviler, genetik karmaşıklığı ve moleküler uyum ve GBM altgrupları şunlardır normal kök hücre, fenotipik benzerlikleri hücrelerle glioblastoma kök hücreler (GSCs) burada anılacaktır. GSCs tümör büyüme ve ilerleme için gerekli olduğundan, farklılaşma tabanlı terapisi bu tedavi edilemez neoplazmlar için uygun tedavi yöntemi temsil eder.

Aşağıdaki iletişim kuralı çeşitli GSC astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlaması amaçlı platform eleme yüksek üretilen iş kurmak için yordamlar açıklanır. Sistemin özünde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ayrımında muhabir yapıdır. İletişim kuralı aşağıdaki genel yordamlar vardır: (1) GSC farklılaşma muhabir satırları; kurulması (2) doğrulama sınama?; / muhabir alaka GSC öz-yenileme/klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasitesi ve (3) yüksek kapasiteli Akış Sitometresi uyuşturucu tarama tabanlı.

Tarama platform GSCs farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlamak için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, kitaplıkları FDA tarafından onaylanan ilaçların kullanımı daha hızlı güvenilemez ajanların tanımlanması için bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, kanser kök hücre farklılaşması teşvik terapiler sinerjik hedef ve öncelikle daha fazla farklı kanser hücrelerinin ortadan kaldırmak için gösterilen geçerli "bakım standart" terapileri ile çalışması öngörülür.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda yapılan çalışmalarda tümör küçük bir nüfus içerir göstermiştir kanser kök hücreleri (CSCs) veya tümör başlatılıyor hücreleri, hücrelerinin tümör ilerleme, metastaz ve direnç kemoterapi ve radyo terapi 1, sorumlu olan 2. kanser kök hücreleri ve onların daha farklılaştırılmış ettiklerinizden içinde tümör varlığı intratumoral heterojenlik teşvik önemli bir faktör olarak kabul edilir ve böylece kanser3tedavisinde büyük bir engel temsil eder. Tümör hücre sıradüzeni, kanser kök hücre teorisi tarafından sağlanan kanserleri 4tedavisi için yeni strateji geliş....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Astroglial ve nöronal lentivirus muhabir sistemleri önceden, konsantre lentiviral hazırlıkları satın alındı. Akış Sitometresi tekniği temel bilgisi gereklidir. Ayrıca, bu iletişim kuralı tam kullanımı için kullanıcı Akış Sitometresi (96-şey plakaları örnek kaynağı olarak kabul eder) yüksek üretilen iş kapasitesi ile erişiminiz olmalıdır.

1. lentiviral transkripsiyon muhabir sistemi

Not: tüm akış sitometrik analizleri ebeveyn, Sigara transduced, hücreleri veya vektör transduced (floresan olmayan) hücreleri temel Floresans oluşturmak için kullanın. Tüm adımlar için mekanik toz çağrıldığı nazik ol da, unutmayın. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç bağımsız hasta kaynaklı neurospheres çizgi erimiş yeşil-floresan protein (GFP) içinde-çerçevesi için bir Zeocin direnç kaset ile kodlama lentivirus astroglial muhabir ile transduced ve insan GFAP'nin organizatörü unsuru ( tahrik Şekil 1). Sonraki bireysel klonlar 96 iyi plaka (Şekil 2) bir kuyu başına 0,7 hücre kaplama tarafından izole, bu akış sitometrik belirlenmesi GFP (şekil 3) ifade hücre yüz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Öncelikle onları define işaretleri üzerinde duruldu GSCs önceki çalışmaların en, bu çalışmada geriye doğru yaklaşım almaya karar verdik. Öncelikle GSCs (örneğin, astroglial ve nöronal işaretleri ifade hücreleri) tarafından oluşturulan farklılaştırılmış ettiklerinizden odaklanmak. Burada eleme sistemi, insan GFAP'nin organizatörü bağımlı ifade GFP ve üzerinde temel alan bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ilaç kullanımını göstermektedir. Neurosphere hasta kaynaklı glioblastoma hücre hatları kullanan tüm deneyler yapıldı........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser NIH R01CA187780 tarafından kısmen destekleniyor.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ESGRO Complete AccutaseEMD MilliporeSF006
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma AldrichD2650
HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi)Sigma AldrichH6648
İnsan GFAP Farklılaşma Raportörü (pGreenZeo, Virüs)SBI (System Biosciences)SR10015VA-1
50 ml steril tek kullanımlık reaktif rezervuarlarCorning4870
6 oyuklu plakaThermo Fisher Scientific130184
96 kuyulu plakaFalcon353072
Biolite T25 cm² Şişe BacalıThermo Fisher Scientific130189
Biolite T75 cm² Şişe BacalıThermo Fisher Scientific130190
15 ml Santrifüj tüpleriCelltreat229411
1.5ml Mikrosantrifüj tüpleriFisher Scientific05-408-129
Ovation Çok Kanallı Pipet, 12 Kanallı, 0.5 - 20uLVistaLab Technologies1060-0020
Ovation Çok Kanallı Pipet, 12 Kanallı, 5-250uLVistaLab Teknolojiler1060-0250
Çoklu 12 kanallı pipet uçları 25 μ lVistaLab Technologies4060-1002
Çoklu 12 kanallı pipet uçları 250 μ lVistaLab Technologies4060-9025
Guava easyCyte 5HT Masaüstü Akış SitometresiEMD Millipore0500-4005
NIH Klinik Koleksiyonları 1 ve 2 küçük molekül kütüphanesiEvotec
NameCompanyKatalog Numarası>Comments
> Nöral kök hücre ortamının hazırlanması için (500 mL)< / güçlü >< güçlü > Nihai konsantrasyon< / güçlü >
BSAGoldBio.comA-421-2500.20
DMEM / F12 10XCorning90-091-PB1X
Heparin sodyum tuzuSigma AldrichH31490.0002%
HEPES 1MSigma AldrichH40365.4 mM
İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS -G) (100X)Yaşam Teknolojileri41400-0451X
NaHCO3Sigma AldrichS-576114.5 mM
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) 100XGibco15140-1221X
ProgesteronSigma AldrichP878316 nM
PutresinSigma AldrichP57804.8 ve mikro; M
Basic FGF (FGF2), İnsanGoldBio1140-02-5010 ng/ml
EGF, İnsanGoldBio1150-04-10020 ng/ml
Şişe Üstü Filtre, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, IndCorning431160Sterilize ortamı filtrelemek için kullanın
%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-406....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glioblastoma Stem CellsFlow Cytometry ScreeningGFAP Reporter ConstructSmall Molecule ScreeningCellular Differentiation AssayDrug Repurposing PlatformLentivirus TransductionNeurosphere FormationGFP Positive CellsHigh Throughput Screening

Related Articles