Vizyon tehdit eden birçok oküler hastalıklar işlevsel olmayan retina yüzdeki ile ilişkilidir. Bu nedenle, retina arteriyol yanıt ölçümü temel patofizyolojik mekanizmaları araştırmak önemlidir. Bu makalede fare retina arteriyol yalıtım ve damar çapı vazoaktif maddelerin etkilerini değerlendirmek için hazırlık için detaylı bir iletişim kuralı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare retina arteriyoller Ex Vivo reaktivite ölçümü için hazırlık adımları
Bu makalede
Özet
Özet
Vasküler yetmezlik ve normal retina perfüzyon değişiklikler için çeşitli görme tehdit oküler hastalıklar, Diyabetik retinopati, hipertansif retinopati ve muhtemelen glokom gibi patogenezinde önemli faktörler arasındadır. Bu nedenle, retina mikrovasküler hazırlıklar önemli fizyolojik ve farmakolojik araştırmalar temel patofizyolojik mekanizmaları betimlemek ve hastalıklar için tasarım terapiler için araçlardır. Oftalmik araştırma fare modellerinde geniş kullanılmasına rağmen retinal vasküler reaktivite çalışmaları bu tür azdır. Bu retina kan damarları olan küçük boyutu sayesinde zorlu yalıtım yordamlar büyük sebebi bu tutarsızlık ~ ≤ 30 µm luminal çapındadır. Fare retina vasoactivity-fizyolojik koşullar altında ex vivo çalışmalar sağlar bir yalıtım ve hazırlama tekniği kurduk bu retina yüzdeki fonksiyonel çalışmalar için doğrudan yalıtım sorunu aşmak için . Her ne kadar mevcut deneysel hazırlıklar özellikle fare retina arteriyoller sevk edecektir, bu metodoloji kolayca yüzdeki için sıçanlarından emir istihdam edilebilir.
Giriş
Retina perfüzyon bozukluğu diabetik retinopati, hipertansif retinopati ve glokom1,2,3gibi çeşitli oküler hastalıkların patogenezinde karıştığı olmuştur. Böylece, retinanın vasküler reaktivite ölçme amaçlı çalışmalar bu hastalıklar Patofizyoloji anlamak önemlidir ve yeni tedavi geliştirmek için yaklaşımlar.
Fare genom gen manipülasyon olasılığı nedeniyle, fare kardiyovasküler sistem4çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli haline gelmiştir. Ancak, retina kan damarları (≤ 30 µm) küçük boyutu nedeniyle, fare retinanın vasküler reaktivite ölçümü zordur. Örneğin, in vivo ölçüm için stereomicroscopic teknikleri onların optik çözünürlük sınırlı olduğunu ve bu nedenle tam olarak çapı veya kan akışı ile donatılmış ≤ 30 µm çapı az küçük kan değişiklikleri algılamak için yalnızca izin ver Floresan boyalar veya uyarlamalı optik tarama ışık Ophthalmoscope5,6kullanarak confocal mikroskop gibi ek sofistike aygıtlar. Ayrıca, yerel tanımlama amaçlı vivo içinde ölçümleri yorumlanması mekanizmaları retina kan damarlarında Anesteziyoloji, şaşırmış sinyal sistemik kan basıncı ve etkisi retrobulbar kan damarlarının değiştirir.
Bu nedenle, yüksek optik çözünürlük ex vivoile fare retina kan damarlarının yanıtları ölçmek için bir yöntem geliştirdi. Burada sunulan teknik retinal arteriyoller üzerinden iletilen ışık mikroskobu görselleştirme sağlar. Fareler de kullanılabilir, bu yöntem gen teknolojisi oküler vasküler araştırma hedefleme avantajları erişim sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada deneysel prosedürler hayvan bakımı Komitesi, Rheinland-Pfalz tarafından Almanya kabul edildi. Hayvan bakımı hayvan oftalmik kullanımı için vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) deyiminde araştırma ve vizyon araştırma için kurumsal yönergeleri ve dernek için standartlarla uyumlu. Hayvanlar göre Avrupa Birliği yönetmeliği uyarınca 2010/63/AB hayvan deneyleri için tedavi edildi. 3-4 ay yaşlı erkek C57BL/6J fareler (Jackson laboratuvar, Bar Harbour, bana, ABD) deneyler için kullanılmıştır. Hayvanlar (sıcaklık 23 ± 2 ° C, nem aralığı 55 ± %10 ve 12 h açık/koyu döngüleri) standart koşullar altında yer alan ve standart fare chow ve su ad libitumyetkisi vardı.
1. yalıtım fare Retina
- Diseksiyon aletleri hazırlık masaya koyun ve tüm araçları hızlı bir hazırlık etkinleştirmek için tam olup olmadığını kontrol edin.
- Fare CO2 inhalasyon tarafından kurban.
- Fare ile çelik makas başını kesmek, kafatası sagitally makas aynı çifti kullanarak iki yarısı kesilmiş ve çıkarmak belgili tanımlık deri ve göz makas (şekil 1) kullanarak beyin.
- Sadece orbital kemik göz makası kullanarak terk etmek kafatası kemik kesti.
- Yörünge buz gibi Krebs-Henseleit arabellek içeren bir diseksiyon kabına aktarın.
- Buzda diseksiyon çanak tutmak veya arabellek her 10 min değiştirin.
- Göz makas kullanarak orbital kemik kesme ve yavaşça göz küre ile birlikte orbital doku tipi 4 hassas cımbız ve öğrenci kenasen bahar makas (Şekil 2) kullanarak çıkarın.
- Yavaşça Harderian bezi, bağ dokusu ve Ekstraoküler kaslar türü 5 hassas cımbız ve oftalmik arter Ana dalı zarar vermemeye dikkat çekici kenasen capsulotomy makas kullanarak çıkarın.
- Yörünge oftalmik arter dalları ve sonunda 10-0 naylon dikiş (şekil 3) kullanarak oftalmik arter Ana dalı proksimal sonuna ligate.
- Göz dünyanın 10 s kullanarak türü için 4 hassas cımbız % 70 etanol içeren bir Petri kabına aktarın. Göz dünyanın geri diseksiyon çanak yerleştirin ve arabellek taze Krebs çözüm ile değiştirin. Kornea etanol maruz kaldıktan sonra beyazımsı görünür.
- Periferik kornea ile 30 gauge iğne ponksiyon ve kenasen capsulotomy makas kullanarak kornea incelemek. Yavaşça Iris doku kesmek, bir sivri kenasen capsulotomy makas koroid ve retina arasında yerleştirin ve kestim koroid ve sklera. Optik siniri (şekil 4) etrafında scleral bazı doku bırakın.
2. montaj perfüzyon odası retinada
Not: Retina arteriyol deneyler için kullanılan perfüzyon dolu bir ev yapımı yer. Şeffaf bir rezervuar bir giriş ve çıkış tüp (şekil 5) ile oluşur. Bir silikon tüp bir ucunu histoacryl yapıştırıcı ve üç yollu stopcock bağlı diğer ucunu ile odası altına yapıştırılmış olan. Üçlü stopcock taze Krebs arabelleğe içeren bir şırınga bağlanmak ve tüp arabellek ile doldurun.
- İğne bağı ile bir cam micropipette al ve tüp perfüzyon odası alt sonu içine itin. Sonra micropipette ucu 100 µm çapı bir ipucu elde etmek için tip 4 makasla bölün.
- Micropipette ucunda odak ve şırınga tüp bağlı yolu ile yıkayın. Kılcal enkaz tarafından tıkandı değil iyi bak. Durumunda tıkanıklığı, kaldırmak, tüp Temizleme ve başka bir micropipette ekleyin.
- Perfüzyon odası soğuk Krebs arabellek ile doldurun ve stereo mikroskopla odası koymak.
- Şeffaf plastik platformu perfüzyon odasına koyun. Bu platform için optik sinir ve oftalmik arter 1.8 mm genişlikte bir girinti vardır ve 1.6 mm çapı iki çelik teller üzerinde yer alıyor. Sonra bir paslanmaz çelik yüzük 2.8 mm iç çap ve 4.0 mm dış çap platformu üzerine yerleştirin.
- Optik sinir ve ekli oftalmik arter ile retina diseksiyon odasından perfüzyon odanın içine bir kaşık kullanarak aşırı dikkatli aktarın. Bu adım potansiyel önlemek önemlidir bu deney için zararlı olabilir gibi dokuların germe.
- Oftalmik arter proksimal sonu dikilmiş kısmı kapalı kesmek, iki ön şekillendirilmesi döngüler 10-0 naylon sütür micropipette üzerine yerleştirin ve oftalmik arter micropipette ile cannulate. Arter micropipette (şekil 6) ile kravat ve retina fine-nokta-cımbız kullanarak şeffaf platform üzerine yerleştirin.
- Yavaşça ön lens capsula iki ince nokta cımbız ile açık gözyaşı, lens çekin ve microscissors kullanarak tüm objektif capsula kesti.
- Daha sonra dört Radyal insizyon retina pars plana-Optik siniri yarım uzaklık yapmak ve paslanmaz çelik yüzük altına düzeltmek için retina üzerine yerleştirin. Retina şimdi deneme (Şekil 7) için hazırdır.
3. deney için retina arteriyoller hazırlanması
- Perfüzyon odası ışık mikroskop altında yerleştirin. 100 X su-daldırma objektif lens hedefidir.
- İki makaronlar için içinde - ve çıkış - flow pericyclic pompa için bağlanmak ve % 95'i O2 ile oksijenli ve 37 ° C'de % 5 CO2 gazlı Krebs arabelleği ile odası dolaşımda Bir akış hızı 100 ile 120 mL/dk arasında kullanın.
- Bir rezervuar silikon hortum aracılığıyla için üç yollu stopcock için micropipette bağlı, silikon tüp takın. O zaman, 50 mm Hg için karşılık gelen bir yükseklik Krebs arabelleğe ile rezervuar doldurun ama üçlü stopcock henüz açmayın.
- Mikroskop ve odak retina yüzeyinde amaçlarını bakın. Kan damarları veya kırmızı kan hücreleri için arama. Bu kan damarları tamamen, bazen sadece bazı kırmızı kan hücreleri görülebilir daraltıldığını mümkündür.
- Bir kan damarı bulduğumuzda, üzerinde durulması ve üç yollu stopcock açın. Gemi çapını hemen yükseltmeniz gerekir ve kırmızı kan hücreleri de sentirifüjlü, bir arteriyol ise veya centripetally bir venule durumunda taşıyın. Arteriyoller çapı aynı sırada venüller için karşılaştırıldığında küçüktür.
- İyi görünür bir duvar ile bir kan damarı bulunduktan sonra bir denge döneminden sonra bir 30 dk (şekil 8) deneyler için istihdam edilebilir. Denge döneminde arteriyoller luminal çap küçültme az % 10 kaynaklanan sadece zayıf iç sesi geliştirmek.
4. deneme gerçekleştirme
- Gemi thromboxane mimetic 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U46619) ile canlılık banyo çözüm ekleyerek test. Bu Ajan yaklaşık % 50 oranında çapı ≥ 10 konsantrasyonları dinlenme--dan fare retina arteriyoller bitiminde-6 M.
- Gemi uygun onaylandıktan sonra pompa dolaşan by agonist banyo dışarı yıkama ve banyo içine taze Krebs arabellek kaynağı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
U-46619 retina arteriyoller konsantrasyon bağımlı vasoconstrictor yanıtlarında vahşi tipi fareler C57Bl/6J arka plan üzerinden üretti. 10-6 M konsantrasyon istirahat çapı ≈50% luminal çapı azalma oldu. Þekil 9A bir retina arteriyol bir temsilcisi konsantrasyon-yanıt eğrisini gösterir. U46619 ile preconstricted arteriyoller içinde asetilkolin toplu yönetim luminal çapı artışlar konsantrasyon bağımlı ≈25% preconstricted çapı 10-5 M, bir bo...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Vasküler fare retina yanıt-e doğru ölçü retina damarları küçük boyutu nedeniyle meydan okuyor. Sunulan tekniği ile retina arteriyoller tarafından iletilen ışık mikroskobu görüntülenir. İzole retina yarı saydam olduğundan bu mümkündür. Teknik yüksek optik çözünürlük avantajdır. Hesaplanan Uzaysal çözünürlük 11 px/µm var. Ancak, beyaz ışık kullanır bu optik sistemi için gerçek çözünürlüğünü Abbe kırınım sınırına göre açıkladı 200 ve 300 nm arasındadır. Fare retina arteriyoller ilk Şubesi 20-30 µm bir iç çapı olduğundan, ça...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.
Teşekkürler
Bu eser hibe Ernst und Berta Grimmke Stiftung ve Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (köpek) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Çelik Makas | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Göz Makası | Geuder | G-19390 | 1x düz, 10,5 cm |
| Hassas cımbız, ince uçlu düz | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x tip 4 |
| Hassas cımbız, ekstra ince uçlu düz | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x tip 5 |
| Vannas kapsülotomi makası | Geuder | 19760 | 1x düz, 77 mm |
| Öğrenci Vannas Yaylı Makas | Güzel Bilim Araçları | 91501-09 | 1x kavisli, |
| Barraquer İğne Tutucu | Geuder | G-17500 | 1x kavisli, 120 mm |
| İğne | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Cam Kılcal Damarlar (mikropipet üretimi için) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1,2 x 0,8 mm; dış/iç çap) |
| Naylon Sütür | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon hücre kültürü kabı | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm çaplı |
| Nunclon hücre kültürü kabı | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm çap |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoakril yapıştırıcı | B. Braun Cerrahi, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | strong> | Comments |
| Equipment | |||
| Perisiklik pompa (SIKLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Dikey Pipet Çektirme Modeli 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Mikroskop (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Suya daldırma objektifi LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Dijital kamera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfüzyon odası | kendi kendine yapılır | 1 katı | |
| Name | Company | Katalog Numarası | Comments |
| İlaçlar ve Solüsyonlar | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalsiyum klorür (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnezyum sülfat (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| &alfa;-(D)-(+)- Glikoz monohidrat | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoksi-9&alfa;,11&alfa;-metanoepoksi prostaglandin F2&alfa; (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Asetilkolin klorür | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Kaynaklar
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
