Yöntem makalesi

Üç boyutlu yüksek frekanslı Ultrasonografi romanı kullanımı için fare erken gebelik karakterizasyonu

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56207

⸱

24 Ekim 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Fareler yaygın olarak Gestasyonel Biyoloji incelemek için kullanılır. Ancak, gebelik sonlandırma Boylamsal araştırmalar önler ve hayvanlar çok sayıda kullanımı gerektiren bu tür çalışmaları için gereklidir. Bu nedenle, yüksek frekanslı Ultrasonografi erken teşhis için non-invaziv tekniği ve hamile fare sonrası implantasyon olayları izleme açıklar.

Özet

Yüksek frekanslı Ultrasonografi (HFUS) non-invaziv insan fetusu rahim içindegerçek zamanlı gelişimini izlemek için yaygın bir yöntemdir. Fare rutin bir vivo içinde model olarak embriyo implantasyon ve gebelik ilerleme incelemek için kullanılır. Ne yazık ki, bu tür fare çalışmaları takip fenotipik analiz etkinleştirmek için gebelik kesinti gerektirir. Bu sorunu gidermek için erken teşhis ve fare embriyo implantasyonu siteleri ve onların bireysel gelişimsel ilerleme içinde uterokarakterizasyonu için verileri görüntüleme HFUS üç boyutlu (3-b) yeniden inşası kullanılır. 3-b yeniden yapılanma ile HFUS görüntüleme ve modelleme birleştirerek, doğru bir şekilde embriyo implantasyonu site numarası ölçmek yanı sıra farelerde hamile C57BL6J/129S 5,5 günü sonrası cinsel birleşme (d.p.c.) gelen 9.5 d.p.c. için gelişimsel ilerleme izlemek başardık bir dönüştürücü kullanımı ile. Ölçümler dahil: sayı, konumu ve hacim implantasyon siteleri yanı sıra arası implantasyon sitesi aralığı; embriyo canlılığı kardiyak etkinliğini izleme tarafından değerlendirildi. Hemen implantasyon sonrası dönemde (5,5 8,5 d.p.c.), 3-b kafes ve katı yerleşimi gravid rahmine inşası gelişmekte olan gebeliklerde rahim her boynuzun içinde görsel temsilini format etkin. Kadın üreme fenotipleri uterus disfonksiyon türetilmiş karakterize etmek için kullanılmak üzere genetik fareler devam ederken, bu yöntem tespit etmek, ölçmek ve erken implantasyon olaylar vivokarakterize yeni bir yaklaşım sunar. Bu roman 3-b HFUS görüntüleme başarıyla tespit etmek, görselleştirmek ve embriyo implantasyonu siteleri erken fare gebelik sırasında bir non-invaziv şekilde karakterize yetenek kullanımı gösterilmiştir. Teknoloji gebelik brüt doku ve histopatolojik karakterizasyonu için kesinti itimat geçerli yöntemler üzerinde önemli bir gelişme sunar. Burada bir video ve metin biçimi ultrasonlardan mesh ve katı 3 boyutlu görüntüleri rahim formu yeniden inşası ile güvenilir ve tekrarlanabilir verileri oluşturmak için erken fare Gebeliğin başarılı bir şekilde gerçekleştirmek nasıl açıklamak için kullanın.

Giriş

Tekrarlayan erken gebelik kaybı anlayışı sonra en sık görülen komplikasyonlar biridir ve1,2Gebe kalmaya çalışan çiftlerin yaklaşık % 1 etkiler. Erken gebelik kaybı temel mekanizmaları çeşitlidir: içsel embriyonik anormallikler ve endometrium algılama1,3,4kusurları için anne tarafından comorbidities. Onların genetik tractability nedeniyle, fare modelleri yaygın olarak erken embriyo implantasyon ve gebelik araştırmalar için kullanılmıştır. Ayrıca, fare ve büyük ölçekli çalışmalar gerçekleştirmesini kısa gebelik zaman fare insan üreme tıbbı5önemli klinik soruları ele büyüyen yarar sağlamıştır. Yani, fare deneysel tasarımlar büyük çoğunluğu hala ölçmek ve implantasyon sitesi konumu, sayısı, boyutu ve aralığı desenleri gebelik6sırasındaanaliz etmek için ardışık gebelik günlerinde euthanized için çok sayıda barajlar gerektiren söyledi, 7,8böylece aynı hayvan üzerinde boyuna çalışmaları engellemek,.

Klinikte, ultrason insan cenin canlılığı ve non-invaziv şekilde9,10,11gelişiminde izlemek için bir güvenilir ve çok değerli bir araçtır. Daha yakın zamanlarda, yüksek frekanslı ultrason (HFUS) fetal canlılığı ve büyüme sırasında gebelik12,13,14izlemek için bir yöntem olarak fare sınırlı uygulamaları bulmak başladı. Ultrason görüntüleme son teknolojik gelişmeler üç boyutlu (3-b) veri hayvan organların görsel imar ve patolojileri15,16sonraki izleme uygulama izin, 17. Bu gelişmiş görüntüleme teknolojisi kullanımı belirgin daha küçük birim dalgalanmaları, arası hayvan değişkenliği azaltmak ve bir patoloji ilerlemesini veya bir terapötik müdahale17etkinliğini izlemek için algılamak için güç geliştirdi. Birincil yardımcı programı bu teknolojinin oncomouse modelleri15,16ilerlemesinde malignite izlemek için buradayken, 3-b HFUS görüntüleme ancak son zamanlarda quantitate ve embriyo implantasyonu aktif büyüme izlemek için kullanılmıştır ve fare rahim18fetal gelişim.

Burada, biz erken hamile fare rahim rekonstrüksiyonlar üretmek için 2-B ve 3-b veri üretmek için Imaging HFUS gerçekleştirmek nasıl göstermek. Biz gebelik sonlandırma, gerek kalmadan bu erken embriyonik implantasyon olayları algılamak için bu yeni yöntemin yarar araştırmacılar non-invaziv bir şekilde veri toplamak için izin göstermek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmalar için bakım ve kullanım laboratuvar Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Yayınlanan hayvan ve hayvan iletişim kuralları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış Rehberi uygun olarak yapılmıştır Baylor Tıp Fakültesi iletişim kuralı altında AN-4203 numara.

1. hamile fare hazırlanması için ultrason

    1. yer Barajı ile kanıtlanmış verimli erkek çiftleşme zaman aşımına fare gece başına 1700 sonra. Vajinal tak gebelik doğru uzanan emin olmak için varsa Barajı ve erkek da, ne olursa olsun 0700 saat (h), ayırmak.
      Not: çiftleşme 0.5 gün olarak kabul edilir sonra sabah coitum (d.p.c.) sonrası.
  2. Ultrason için hazırlık
    1. hamile fareyi bir mühürlü anestezi indüksiyon kapsayıcısına getirin.
    2. İle isoflurane (% 2) inhale anestezik ve oksijen (1 L/dak) kadar hayvan iyileştiren refleks (yaklaşık 1-2 dk boyutuna bağlı olarak fare) kaybeder ve spontan hareketleri değil (yanı sıra solunum) gözlenen Sedate.
    3. Yer uyuşturulan fare sırtüstü pozisyonda burun konisi isoflurane (% 2) ile inhale anestezik ve oksijen (1 L/dak). Oftalmik merhem uygulamak için hayvan ' gözleri.
    4. Pamuk bez ile tüm karın, göğüs kemiği vajina için depilatory krem uygulamak ve lateral yanları için.
    5. Krem 3 dk. maksimum kalmak izin ve krem ve saç dokusuyla kaldırın. Kalan herhangi bir saç görüntü kalitesi azalır gibi tüm saç kaldırıldığından emin olmak.

2. Ultrason sahne hazırlanması

  1. üzerinde dönüştürücü çevirmek.
  2. 3-b motor sahne motorlu sahne için dönüştürücü takmak. Arka panel 3D motor konektörüne 3D motor kablo bağlayarak
    1. 3D'liğe motorlu. Hızlı Yayın sonrası üst görüntüleme istasyonuna bağlama işlemi kullanarak montaj sistemi 3D motor sistemi iliştirin ve dönüştürücü kelepçe takmak için alt monte tutuşunu.
  3. Sonda dönüştürücü kelepçe takın.

3. hamile fare Imaging Begin

  1. yer fare izleme platformu üzerinde sırtüstü. Fare sürekli isoflurane (arasında % 1.5-2.5) anestezik alır ve oksijen (1 L/dak) burun konisi üzerinden. Yavaşça tüm pençeleri kalp atışına yastıkları platformunda izleme bant.
    1. Karnına 1-2 mL ultrason iletim jel uygulayın.
  2. El ile motor sahne kullanarak alt karin ultrason sondası yerleştirin.
    1. Bir sıvı dolu karanlık daireye sadece cephalad vajinal açılış olarak görünmesi gereken mesane bulun.
    2. Bir kez mesane bulunur hareket sonda çok yavaş cephalad gebelik sitelerdeki yuvarlak alanları ile silindir şeklinde olarak görünmesi gereken hamile rahim görselleştirmek için. Bu bir zincir inci gibi seyir olarak tarif edilebilir.
    3. Bir kez hamile rahim tespit edilmiştir, 2B görüntüleme başlar.

4. 2-B ultrason görüntüleme (Şekil 1)

  1. hamile rahim saptanmıştır sonra gebelik sitesinde mesane için en yakın başlar ve yavaş yavaş ve sırayla cephalad sayı ve gebelik siteleri konumunu belirlemek taşımak.
  2. Böbrek, dalak ya da karaciğer görselleştirildiği, sonda yeniden konumlandırmak (kullanıcı çok çok cephalad gitti gibi daha yakın Kaudal yakın mesane).
  3. Aynı şekilde kontralateral rahim boynuz görüntü.
  4. Ultrason çerçeve daha sonra analiz ve ölçüm için kaydetmek için implantasyon/gebelik sitesi ortasına olduğunda görüntü dondurma.
    Not: Dondurulmuş ve daha sonraki analizler için kaydedilen görüntü için bir saniyeden az sürer.
  5. Ölçü implantasyon mesafe hyperechoic decidualization reaksiyon el ile tıklatarak bir işareti olarak kullanarak " ölçü birimi " ilk aracı tıklattıktan sonra bir implantasyon site konumunda. Daha sonra imleci sonraki implantasyon site ve tıkırtı bilgisayar otomatik olarak uzaklığı bildirir bir çizgi çizmek için sürükleyin. Yazılım daha sonra el ile ölçüm nedir bildirir. Bu adım değil bilgisayarlı, ancak program bir ölçüm şey için sağlayacaktır decidualized siteler arasında bir çizgi çizerek decidualized siteler arasındaki mesafe işaretlemek için kullanıcı dayanan
  6. Ölçmek implantasyon boyutu, gebelik kesesi boyutu ve fetal direk boyu.

5. Fetal kalp hızı

Not: 9,5 d.p.c. fetal kalp atışı açıkça görüntülenmeyecektir.

  1. Süre sonda hareketsiz tutmak, nabız dalga Doppler açmak ve bu görünür kalp atışı üzerinde konumlandırın.
  2. Kayıt kalp kalp atışını pulsasyonu.
    Not: kalp dışında bu yordamı pulsasyonu göbek kordonu içinde-ebilmek da yazmak.

6. 3 boyutlu ultrason Alım

    hamile rahim 2B görüntüleme üzerinde görüntülenir sonra
  1. istediğiniz 3-b görüntü yaklaşık orta noktasında bir alanda sondayı getirin. Bir 3-b bir elma Imaging, örneğin, sonda başlangıçta nerede elma çekirdeği olmak (yani nesnenin ortasını) yer alan tahmin edilmektedir yer almalıdır.
  2. İle probe istenen görüntü ortasında bir konumda, 3-b bir kazanım elde edilir. 3-b motor sahne bu Mesafe rahim adımlar veya kareleri bir dizi genelinde seyahat edecek, bütünüyle esir alma niyeti ile arzuları ne araştırmacı.
  3. Onayla amaçlanan yapıları tamamen 3 boyutlu gerçek zamanlı ultrason bölümüne tamamlamadan önce taramaya yakalanır. 3-b Bu bilgi daha sonra Post-işleme için kaydedin. Yaklaşık 10-20 dakika Toplam 2-B ve 3-b ultrason Alım zamanı deneyimli bir kullanıcı tarafından gerçekleştirilen zaman.

7. 3-b sulandırma Post-processing (Şekil 2)

  1. 3 boyutlu görüntü işleme için istenen veri yüklenemedi.
  2. Seç " paralel ve dönme yöntemleri ", hangi bir 3 boyutlu 3D görüntü kareleri yük olacak " kutusunu " kullanıcı sonra istenen nesnesinde, çerçevelemek-yanında-çerçevelemek iz olur. Adım seçin 0,08 mL boyutu. Başlamak resim sokağın bir ucunda ve alanı içinde yakalanan görüntüleri ile daha yakından tanımak için kaydırmak.
    1. Bir son-in belgili tanımlık imge ve el ile izleme, nesnenin anahatlarına başında.
    2. Sonraki 2-D Görüntü dilimi gidin veya " çerçeve " ve el ile iz, nesnenin anahatlarına.
    3. Tüm çerçeveleri el ile açıklamalı/kullanıcı tarafından takip edilmiştir kadar bu işleme devam edin.
    4. 'I tıklatın " bitirmek " Toplam hacim hesaplamaları ve 3 boyutlu görüntü elde etmek için.
  3. Mesh ve sol üst köşesinde bir ok katı kaplama arasında seçin.
  4. Korumak veya netlik için çevredeki ultrason görüntü bilgilerini kaldırmak için seçin. 3-b her yeniden yapılanma 10 ve 20 dk. arası sürebilir

8. Sonrası yordam bakım

  1. ultrason tamamlandığında, anestezi gazı fare platformdan çıkartın ve hafifçe silin ve herhangi bir ultrason jeli hayvan silsin.
  2. Fare geri yüzükoyun yastıklı bir alanda kafese koyun. Hayvan kendiliğinden uyanık ve hareketli kadar izlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1' de gösterildiği gibi yüksek frekans ultrason implantasyon site geliştirme 5.5 d.p.c zaman noktası olarak erken başlangıç algılayabilir. Hafif hyperechoic kullanarak, implantasyon sitelerin 6.5 d.p.c bir işaret olarak decidualized endometrium implantasyon site ve aralığı sayısal için bu sitelerin sayısını verir. Gebelik ilerledikçe 7.5 d.p.c., bir daha koyu hypoechoic gebelik kesesi ve fetal pole da kolayca tanınır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu roman 3-b HFUS görüntüleme başarıyla tespit etmek, görselleştirmek ve embriyo implantasyonu siteleri erken fare gebelik sırasında bir non-invaziv şekilde karakterize yetenek kullanımı gösterilmiştir. Teknoloji gebelik brüt doku ve histopatolojik karakterizasyonu için kesinti itimat geçerli yöntemler üzerinde önemli bir gelişme sunar. Ancak histolojik yöntemleri hala ne zaman bir daha büyütülmüş ve daha hücresel düzeyde karakterizasyonu isteniyorsa veya gen ve protein analizi gerekli olduğunda daha iyi kabul eden unutu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Çok yardım Rong Zhao, Jie Li ve Yan Ying için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VisualSonics Vevo 2100 Ultrason Görüntüleme Platformu/MakinesiVisualSonics, inc.VS-11945
Vevo Görüntüleme İstasyonuVisualSonics, inc.SA-11982
Aquasonic 100 Ultrason İletim JeliParker#SKU PLI 01-08
İzofluran (IsoThesia) 100mL şişeHenry Shein# 29404
PuraLubenAnimal Oftalmik MerhemDechra# 12920060

Kaynaklar

  1. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  2. Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
  3. Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
  4. Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
  5. Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
  6. Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897(2015).
  7. Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364(2012).
  8. Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
  9. Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
  10. Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
  11. Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
  12. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205(2013).
  13. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38(2014).
  14. Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
  15. Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97(2015).
  16. Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
  17. Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
  18. Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312(2017).
  19. Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
  20. Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500(2012).
  21. Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171(2016).
  22. Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
  23. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
  24. Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
  25. Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
  26. Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
  27. Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Boyutlu Rekonstr ksiyonFare Gebeli iEmbriyo mplantasyonuIn Vivo G r nt lemeGestasyonel Kese l mKardiyak Aktivite zlemeA rt s KatmanTransduser Prob Konumland rmaUltrason letim Jeli

İlgili makaleler