Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
DNA hasarı genom bütünlüğünün korunması için önemlidir hücredeki belirli sinyal ve onarım yanıt neden olmaktadır. Lazer microirradiation DNA hasarı yanıt (DDR) vivoaraştırmak için değerli bir deneysel araç oldu. Hücre çekirdeği submicrometer bölgede sınırlı lazer kaynaklı hasara cevaben makromoleküllerin dynamics gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü tek hücreli analiz sağlar. Ancak, çeşitli lazer koşullar indüklenen zarar türleri farklılıkları takdir olmadan kullanılmaktadır. Sonuç olarak, çoğu zaman hasar doğası değildir belirgin tutarsızlıkları işe alım veya değişiklik profillerindeki neden karakterize veya kontrollü, iyi. Biz farklı ışınlama koşulları (örneğin, farklı dalga boylarında gibi farklı giriş (irradiances) güçlerin femtosecond (fs) yakın kızılötesi (Nur) lazer) farklı DDR ve onarım protein derlemeler indüklenen gösterdi. Bu üretilen DNA hasar türünü yansıtır. Bu protokolü nasıl farklı tutarlarda indüksiyon ve kolayca Bankası ve crosslinking zararlar, fark Poli (ADP-riboz) (PAR) sinyal, algılama tarafından takip edilebilir DNA hasarı karmaşıklığı titrasyon lazer giriş güç sağlar açıklar ve yol özgü onarım faktör derlemeler hasar sitelerde. Bir kez hasar koşulları belirlenir, farklı zarar karmaşıklık ve diferansiyel hasar sinyal etkileri yanı sıra ilgi herhangi bir faktör üzerinde ters yönde factor(s) tükenmesi araştırmak mümkündür.
Giriş
Vivo DNA hasarı sinyal de anlaşılmadı mı
Vivo, DNA Histon ve diğer faktörler formu Kromatin iplikler için complexed olduğunu. Düzenleme Kromatin yapısı, DNA metabolizması için büyük önem taşımaktadır. Örneğin, Histon değişken H2AX mutasyona uğramış ataksi-Telanjiektazi (ATM) ve aşağıdaki iki iplikçikli (DSB) indüksiyon tatili ve yerleştirme bir site için diğer sağlamak olarak DSB hasar sinyal güçlendirme için önemli diğer kinazlar tarafından fosforile etkenler. Hasar sinyal ve onarım yolu seçimi yayılan görünür eleştirel yerel Kromatin yapısı hasar siteleri1tarafından etkilendiği için. Faktörler, Histon cha....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. temel hücre hazırlık
Not: Bu standart ayirt endojen protein alımı veya değişiklik algılanması ve stabil bir fluorescently tagged rekombinant protein ifade bir hücre kültürünü kullanımı için bir adımdır. Örneğin, Potorustridactylus (PtK2) keseli böbrek epitel hücreleri stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade bizim önceki kullanılmıştır (şekil 1)32çalışma. Eski durumda, 53BP1 bölgesinin şekillendirme odak (amino asit 1220-1711) içeren Oligomerizasyonda etki alanı, Tudor etki alanı ve ubiquitylation bağımlı işe alım (UDR) motifi, Gelişmiş GFP (EGFP-53BP11220....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade PtK2 hücreleri kullanarak, lazer giriş gücü titrasyon onların işe alım (şekil 1)32için en uygun koşul belirlemek için gerçekleştirilmiştir.
Yüksek giriş güç lazer hasar siteler, önemli CPD (genellikle ultraviyole (UV) hasar tarafından oluşturulan crosslinking hasar), özellikle baz hasarı tanır GFP-NTH1 DNA glycosylase yanı sıra kümeleme gözlendi. Buna ek olarak, daha yüksek XRCC1 ve .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Lazer microirradiation DDR araştırma için kullanmanın yararları şunlardır:
1. bu farklı teşvik için uygun ve DNA'ın tutarları basit kırılmalara karmaşık DNA hasar zarar ve algılamak için farklı onarım faktörler DNA, siteleri lazer ışınlama parametreleri ayarlayarak zarar. Hasar birden çok kez aynı hücre çekirdeği içinde trans etkileri ( şekil 3) olduğu gibi değerlendirmek için mümkündür.
2. önemli, hasar siteleri ve başka bir y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Biz Dr Akira Yasui Tohoku Üniversitesi, Japonya için GFP-NTH1 ifade Plazmid ve Dr Eros Lazzerini Denchi Scripps Araştırma Enstitüsü, La Jolla, Kaliforniya TRF2-YFP ve EGFP-53BP11220-1711 ifade plazmid için teşekkür ederiz. Bu eser Hava Kuvvetleri Office bilimsel araştırma (FA9550-04-1-0101) ve Beckman lazer Enstitüsü A.ş. Vakfı (için M.W.B), Ford Vakfı Bursu ve NSF MCB-1615701 ve CRCC Bilimleri (için B.A.S), ulusal Akademisi tarafından desteklenmiştir CRR-17-426665 (için K. Y.).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ti: Safir NIR darbeli femtosaniye lazer Mira-900 | Tutarlı Inc. | Mira 900 | |
| Ters mikroskop | Carl Zeiss | Axiovert 200M 63X | |
| /1.4 NA objektif | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Kompakt Rotasyon Aşaması | Newport Corp | PR50PP | |
| Sıcaklık Kontrol Cihazı | Warner | TC-344B | |
| Isıtma Sistemi | Ibidi | 10918 | |
| Gaz İnkübasyon Sistemi | Ibidi | 11920 | |
| Lazer Güç ve Enerji Ölçer (RoHS) | Uyumlu | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Dijital CCD Kamera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Lazer Tarama Mikroskopları | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Izgaralı Tabaklar | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 böbrek epitel hücreleri | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa hücreleri | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Yaşam Teknolojileri | 11885-092 | |
| CO2 Bağımsız Ortam | Yaşam Teknolojileri | 18045-088 | |
| İleri MEM | Yaşam Teknolojileri | 12492-013 | L-Glutamin,% 4 FBS |
| penisilin / streptomisin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamin | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Timidin ve nbsp; | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Azaltılmış Serum Besiyeri) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pirimidin dimer (CPD) (fare) | Kamiya Biyomedikal Şirketi | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (fare) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (tavşan) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (tavşan) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polimerler (fare) | Enzo Yaşam Bilimleri | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (tavşan) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (fare) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (fare) | Kamiya Biyomedikal | ||
| Anti-Rad21 (Tavşan) (kohezin tespiti için) | Yokomori (KY) laboratuvarında | ||
| Anti-Rad51 (Tavşan) | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (fare) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oksiguanin | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Tavşan) | KY laboratuvarında | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Tavşan) (kondensin tespiti için) | KY laboratuvarında | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure, Eşek Anti-Tavşan IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Eşek Anti-Fare Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfeksiyon Reaktifi | Qiagen | 301705 | |
| Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 kararlı hücre hattı | KY laboratuvarında | ref 49 | |
| KY laboratuvarında üretilen | GFP-NEIL2 kararlı hücre hattı | ref 54 | |
| üretilen | GFP-NTH1 kararlı hücre hattı | ref 32 | |
| KY laboratuvarında | GFP-SMC1 plazmidi | ||
| KY laboratuvarında | GFP-Ku plazmidi | ||
| Anti-MDC1 (tavşan) | Novus Biyolojikler | NB100 ve ndash; 395 | |
| Anti-gH2AX (tavşan) | Kırlangıç | 07– 164 | |
| EGFP-53BP1 (1220-1711) Berns laboratuvarında üretilen PtK2 kararlı hücre hattı | ref 32 | Berns laboratuvarında | |
| üretilen | PtK2 kararlı hücre hattı | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitörü | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA– PKcs inhibitörü ve nbsp; NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitörü KU55933 | ve nbsp; Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Teknolojisi | A4154 | |
| Paraformaldehit | ELEKTRON MİKROSKOPİSİ SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Miktar Bir 1-D Analiz Yazılımı Sürümü 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | Görüntü Analiz Programı |
| Excel | microsoft | elektronik tablo programı | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | deterjan |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) 10X kalsiyum ve magnezyum içermez | Fisher Scientific | 14200166 | 1X 'ye seyreltin; |
Kaynaklar
- Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 4....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
