Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

9.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56213

⸱

31 Ocak 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Özet

DNA hasarı genom bütünlüğünün korunması için önemlidir hücredeki belirli sinyal ve onarım yanıt neden olmaktadır. Lazer microirradiation DNA hasarı yanıt (DDR) vivoaraştırmak için değerli bir deneysel araç oldu. Hücre çekirdeği submicrometer bölgede sınırlı lazer kaynaklı hasara cevaben makromoleküllerin dynamics gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü tek hücreli analiz sağlar. Ancak, çeşitli lazer koşullar indüklenen zarar türleri farklılıkları takdir olmadan kullanılmaktadır. Sonuç olarak, çoğu zaman hasar doğası değildir belirgin tutarsızlıkları işe alım veya değişiklik profillerindeki neden karakterize veya kontrollü, iyi. Biz farklı ışınlama koşulları (örneğin, farklı dalga boylarında gibi farklı giriş (irradiances) güçlerin femtosecond (fs) yakın kızılötesi (Nur) lazer) farklı DDR ve onarım protein derlemeler indüklenen gösterdi. Bu üretilen DNA hasar türünü yansıtır. Bu protokolü nasıl farklı tutarlarda indüksiyon ve kolayca Bankası ve crosslinking zararlar, fark Poli (ADP-riboz) (PAR) sinyal, algılama tarafından takip edilebilir DNA hasarı karmaşıklığı titrasyon lazer giriş güç sağlar açıklar ve yol özgü onarım faktör derlemeler hasar sitelerde. Bir kez hasar koşulları belirlenir, farklı zarar karmaşıklık ve diferansiyel hasar sinyal etkileri yanı sıra ilgi herhangi bir faktör üzerinde ters yönde factor(s) tükenmesi araştırmak mümkündür.

Giriş

Vivo DNA hasarı sinyal de anlaşılmadı mı
Vivo, DNA Histon ve diğer faktörler formu Kromatin iplikler için complexed olduğunu. Düzenleme Kromatin yapısı, DNA metabolizması için büyük önem taşımaktadır. Örneğin, Histon değişken H2AX mutasyona uğramış ataksi-Telanjiektazi (ATM) ve aşağıdaki iki iplikçikli (DSB) indüksiyon tatili ve yerleştirme bir site için diğer sağlamak olarak DSB hasar sinyal güçlendirme için önemli diğer kinazlar tarafından fosforile etkenler. Hasar sinyal ve onarım yolu seçimi yayılan görünür eleştirel yerel Kromatin yapısı hasar siteleri1tarafından etkilendiği için. Faktörler, Histon chaperones ve enzimler değiştirme Histon remodeling Kromatin birkaç siteleri zarar için gerçekten işe ve DDR yönetmelikte Kromatin önemini vurgulayarak verimli DNA tamiri için önemlidir ve2 onarım , 3 , 4. Ayrıca, kümeleme veya yeniden konumlandırma hasar sitesi Maya ve drosophila5,6,7,8, gen loci relocalization anımsatan gözlenmiştir gerçekliğimizin bölme gen Yönetmeliği9,10ile ilişkili. Fare ve insan hücreleri son araştırmaları Ayrıca seferberlik hangi etkileri sadakat ve yol seçim11,12onarmak DSB sitelerin saptandı. Bu DDR/onarım da yakından nükleer mimarisi, üst düzey Kromatin organizasyon ve kromozom ile hücre çekirdeği dinamiklerini bağlantılı olabilir ki olasılığını yükseltir. Böylece, DDR çalışma ve onarma işlemlerinde canlı hücrede endojen nükleer çevre bağlamında kısa ve uzun vadeli sonuçları DNA hasarı anlamak için yüksek çözünürlüklü yöntemleri geliştirmek için önemlidir.

Ölçüde ve hasar türünü ölçme ve Protein derleme hasar sitesinde düzenleyen PAR polimeraz (PARP) kritik rolü
PARP1 hızla DNA onarım13' te kritik bir rol oynamaktadır DNA hasarının aktif bir DNA nick sensör olduğunu. PARP1 x-ışını onarmak çapraz tamamlayan baz eksizyon tamir (BER) kolaylaştırmak için 1 ile birlikte (XRCC1) çalışması için Aslında düşündüm fakat DSB onarım14dahil olmak üzere diğer DNA onarım yolları rolü son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya koyuyor. PARP1 kullandığı Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD+) ADP-ribosylate için bir substrat olarak kendisi de dahil olmak üzere birden çok hedef proteinler aktif. PARP inhibitörleri olarak umut verici tedavi ilaçlar kanser için ortaya çıktı gibi bu enzim ve diğer aile üyeleri son yıllarda çok dikkat çekmiştir. PARP inhibitörleri başlangıçta meme kanser geni (BRCA1) etkili olduğu bulundu rağmen-mutasyona meme kanseri hücreleri, şimdi kanıt etkileri ajanlar/ışınlama karşı zarar DNA ile birlikte mono - ve kombinasyonu tedaviler için bir bolluk olduğunu Kanser için BRCA115,16,17,18,19,20sınırlı değildir mutasyonlar ile geniş bir yelpazede.

Moleküler seviyede PARP etkinleştirme yerel Kromatin yapısı hasar sitelerdeki organize kritik rol oynamak için gösterildi. Kromatin modifikasyon enzimleri alımı PAR-bağımlı DSB onarım kolaylaştırır ve baskıları yolu seçimler, PAR değişiklik hasar sitelerdeki önemli iskele rolü düşündüren onarmak. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 biz son zamanlarda gösterdi p53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) dışlanması zararlardan siteleri homolog olmayan endjoining () 53BP1 bağlı hyperactivation için alternatif bir açıklama sağlayan PAR 32tarafından NHEJ) tarafından PARP onarım inhibitörü ve DSB PARP önemini vurgulayarak yolu seçim33,34. Onarım faaliyetin birden fazla DNA'ın PARylates ve etkileri doğrudan PARP1 de14faktörler.

Lazer Microirradiation DDR/onarım Vivo içinde çalışmak için bir araç olarak kullanarak
Alt mikron değişiklikler üzerinde bireysel kromozomlar üretmek için lazer microirradiation ilk 196935 içinde açıklanan ve ayrıntılı olarak 198136gözden. Birkaç yıl sonra lazer microirradiation, hücre çekirdeği tanımlanmış submicrometer bölgede, DNA hasar ikna etmek için gösterildi ve işe alım veya DNA lezyonlar içinde vivo çeşitli faktörlerin değişiklikleri incelemek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. bu yöntem farklı ışınlama kaynaklı foci (IRIF) oluşturmaz bu faktörlerin tespiti hasar siteleri39,42, sağlar. Kromatin yapısal değişiklikler hasar siteleri hem çekirdeği geri kalanında kronolojik zamanmekansal dinamiklerini incelemek mümkündür. Biz dikkatle farklı lazer sistemleri tarafından indüklenen DDR'lar göre ve giriş yetkileri DNA hasar türünü ve microirradiation koşulları32,43,44, arasındaki ilişki değerlendirmek için 45. Anormal işe alım kalıpları 53BP1 ve telomeric bağlayıcı faktör 2 (TRF2) lazer kaynaklı hasar46 "fizyolojik olmayan" doğası için yinelenen endişe için temel sağlanan önceki lazer hasar çalışmaları, gözlendi tekrar ,47,48,49. Bu belirgin farklılıklar şimdi fark PARP tarafından açıklanabilir hangi indüklenen zarar32karmaşıklığını ve miktarını ölçer sinyal bulduk. Biz doğruladı: 1) lazer-microirradiated hücreleri (yüksek giriş güç ışınlama) sonra bile Interphase içinde bir hasar denetim noktası denetim bağlı şekilde tutuklandı ve geçerli kalır (en az en fazla 48 saat)32,50; ve 2) onarım faktör işe alım/değişiklikler sadakatle bu geleneksel DNA zararlı ajanlar ile tedavi ve DSB indüksiyon ile endonucleases32,39,42tarafından, gözlenen özetlemek 44,50,51,52. Bu sonuçlar güçlü lazer zarar indüklenen hücresel yanıt eğitimi fizyolojik alaka destek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. temel hücre hazırlık

Not: Bu standart ayirt endojen protein alımı veya değişiklik algılanması ve stabil bir fluorescently tagged rekombinant protein ifade bir hücre kültürünü kullanımı için bir adımdır. Örneğin, Potorustridactylus (PtK2) keseli böbrek epitel hücreleri stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade bizim önceki kullanılmıştır (şekil 1)32çalışma. Eski durumda, 53BP1 bölgesinin şekillendirme odak (amino asit 1220-1711) içeren Oligomerizasyonda etki alanı, Tudor etki alanı ve ubiquitylation bağımlı işe alım (UDR) motifi, Gelişmiş GFP (EGFP-53BP11220-1711) erimiş. Bu füzyon proteinin tam uzunlukta 53BP153,54,55hasar site alımı beyannamedir. HeLa hücreleri, cohesin (örneğin, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52ve GFP SA2 51) in fluorescently etiketli alt birimleri stabil tesisin içine verimli birleşme sağlamak ve özetlemek için ifade gerekir S/G2 hücre döngüsü aşama özel hasar site işe endojen cohesin51.

  1. Tek hücre kimliği için izin vermek için herhangi bir yapisan hücre tipi gridded coverslip ile bir 35 mm doku kültürü yemek üzerine tohum. % 60 confluency 36-48 h belirli hücre proliferasyon oranını temel alarak elde etmek için ilk cep numarasını ayarlayın. Örneğin:
    1. PtK2 keseli böbrek epitel hücreleri (vahşi türü veya bu stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade) için: plaka 2.0 x 104 hücreleri 2 ml gelişmiş en az gerekli orta (MEM) takıma 2 mM L-glutamin, % 4 fetal sığır Serum (FBS) ve antibiyotik (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) ve % 7 CO237 ° C'de kuluçkaya.
    2. İçin HeLa hücreleri stabil fluorescently ifade ile rekombinant proteinler GFP SA2 tagged: tohum 1.0 x 105 hücreleri 2 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin, desteklenen ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Diğer HeLa hücreleri de değiştirilmemiş hücreleri veya hSMC1-GFP ifade hücreleri de dahil olmak üzere kullanılabilir.
  2. Uygun ve daha önce DNA hasarı indüksiyon (Görsel Kılavuz numarası olarak izin vermek için) % 30-60 izdiham, 36-48 h için çoğalırlar hücrelere izin. Bölüm 4'e geçin.

2. geçici Transfection

Not: Bazen iyi antikorlar endojen proteinler algılamak kullanılabilir değil. Stabil marker proteinler ifade hücre hatları kullanılabilir değilse, canlı hücre analizleri için fluorescently etiketli proteinler izlemek için geçici transfections yerine getirir.

  1. Günde 1, HeLa hücreleri için 6-8 x 104 hücreleri 0.5 mL kültür medya 24-şey plaka bir iyi tohum ve bir % 100 oksijen kuluçka 37 ° C'de ve % 5 CO2kuluçkaya. Adım 1.1 Kültür ortam koşulları için bkz.
  2. Gün 2, fluorescently etiketli bir DNA kodlama bir memeli ifade plazmid onarım kullanım faktörü (örneğin, GFP-NTH1 veya GFP-OGG1 baz hasarı için32,44,56, GFP-Ku yüksek doz DSBs57, GFP-53BP1 için 32 nispeten basit DSBs veya floresan etikete erimiş ilgi diğer proteinler) lipozom aracılı DNA transfection gerçekleştirmek için. 0.3 µg plazmid DNA 25 µL serum serbest kültür medya bir 1,5 mL tüp içine sulandırmak.
  3. Başka bir 1,5 mL tüp, 1 µL lipozom tabanlı DNA transfection reaktif 25 µL serum serbest kültür ortamının sulandırmak ve karışımı yavaşça.
  4. Seyreltilmiş DNA ve transfection Ajan karışımı yavaşça ve form DNA-lipid kompleksleri için (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  5. Durulama hücreleri 0.5 mL kültür medya ile bir kez, medyayı çıkarın ve hücrelere (aynı derecede içinde adım 1.1) 0.5 mL taze kültür ortamı ekleyin.
  6. DNA-lipid kompleksleri hücrelere ekleme. Bir kaç kez plaka rock yaparak karışımı yavaşça. Hücreleri geri adım 2.1 olduğu gibi kuluçka makinesi koymak.
  7. 4-6 h sonra hücrelerden kültür ortamını çıkarın ve 300 µL % 0.05 eklemek tripsin-EDTA. Bunu kaldırmak, 200 µL eklemek tripsin-EDTA ve 3-4 dk 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
  8. Teyit hücreler ayrılır sonra 800 µL kültür ortamı ekleyin ve hafifçe hücre kümeleri kırmaya pipetting tarafından hücreleri resuspend. Hücre süspansiyon gridded coverslip ile bir 35 mm kültür yemek takabilir ve kültür ortamı son hacmi 2 mL için ekleyin.
  9. Hücreler olduğu gibi adım 2.1 kuluçka 48 h için kuluçkaya, daha sonra bölüm 4'e geçin.
    Not: Ifade rekombinant protein toksik ise (transfected hücreleri gösterir yuvarlak veya düzensiz Morfoloji kuluçka adım 2.8 sonra), ifade süresini kısaltmak ve lazer microirradiation (Bölüm 4) 16-20 h transfection sürece olarak sonra gerçekleştirmek protein ifade doğruladı (floresan tespiti için bkz: adım 4.3). Bu durumda, transfection 35 mm tabak içinde gerçekleştirin. Tohum 3.0 x 105 HeLa hücreleri bir 35 mm tabak 30 h. Transfect DNA plazmid sonra yaklaşık % 50-70 izdiham ulaşmak ve medya 2-6 h değiştirmek için gridded bir coverslip ile transfection sonra. Lazer microirradiation 12-20 h ile devam sonraki protein ifade ise makul ve hücreler sağlıklı görünür.

3. Hücre döngüsü eşitleme

Not: onarmak için homolog rekombinasyon (HR) proteinler, işe alım hücre döngüsü, hangi HR onarım yer51alır S/G2 aşamasında daha belirgin Rad51 ve cohesin gibi. Böylece, bu protein alımı izlemek için hücre eşitleme S/G2 faz için gereklidir.

  1. S/G2 aşama eşitlemesi
    1. Hücre eşitleme için S/G2 faz50,51Kişilik timidin blok protokolünü kullanır. Bir 35 mm gridded coverslip yemek hücrelerde tohum sonra (bkz. Adım 1.1), kuluçkaya hücreleri (için son bir konsantrasyon 2.5 mm) timidin kültür medya (aynı derecede içinde adım 1.1) 17 h 37 ° C'de ve % 5 CO2.
    2. 1 mL (aynı derecede içinde adım 1.1) kültür medya timidin içermeyen hücrelerle iki kez durulama ve 2 mL timidin ücretsiz kültür medya adım 1.1 olduğu gibi 9 h için hücrelerde kuluçkaya.
    3. 27,5 mM timidin hisse senedi çözüm (kültür ortamda çözünmüş) 200 µL kültür medya ile hücre içine 2.5 mM timidin son bir konsantrasyon için ekleyin. Hücreler olduğu gibi başka bir 15 h. durulama için adım 3.1.1 kuluçkaya ve 4-6 h için kültür medya timidin ücretsiz hücrelerde kuluçkaya ve DNA hasar (Bölüm 4) neden.
    4. Hücre döngüsü işaretçileri kullanarak eşitleme verimliliği onaylamak (siklin A2 ve B1 S/G2 ve G2, sırasıyla), S/G2 faz özgü DNA hasarı tamir faktörler (örneğin, Rad51 veya cohesin), veya IdU/EdU birleşme (için S faz hücreleri)51.
  2. G1 aşama eşitlemesi
    1. Tohum 6-8 x 104 HeLa hücreleri gridded coverslip (Adım 2.1) ile bir 35 mm kültür yemek.
    2. 2 gün sonra hafifçe kaldırdı ve yuvarlak şekilli, 10 X objektif ve 10 X oküler lens kullanarak ters bir mikroskop altında metafaz hücrelerini tanımlamak. Metafaz hücreleri üzerinde gridded coverslip konumunu kaydetmek için görüntüleri elde etmek.
    3. 3-4 h sonra hücre bölünmesi iki kızı hücrelere (G1 aşamasında) onaylamak ve DNA hasar (Bölüm 4) teşvik.

4. titrasyon lazer güç girişi

Not: Bu protokol için biz bir 780 kullanarak DNA hasar neden nm Geniş puls confocal mikroskop veya 800 bağlı fs NIR lazer sistemi nm Geniş puls fs NIR lazer bir ters epi-Floresans mikroskobu birleştiğinde. Giriş gücü (numune lazer odak noktasında gerçek olma) karşılaştırılabilir DDR ikna etmek için gerekli bu sistemlerinde farklı olsa da, her iki, veya herhangi bir, NIR sistemleri-32,57 giriş gücü titrasyon temel prensibi geçerlidir . Lazer nabız ve en yüksek olma iki lazer sistemleri için odak noktada başına in situ enerji vardı 5,33 × 10-2-4 × 10-1 aralığında nJ ve 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, sırasıyla32.

  1. NIR lazer açmak ve lazer sistemi ısınma için kullanmadan önce 1 h için izin verir.
  2. Bir tabak hücre ısıtmalı (37 ° C) Sahne Alanı'nda CO2 (% 5) ve nem oranı (% 100) kontrol sağlar bir odaya yerleştirin.
    Not: bir CO2 Oda yoksa, CO2kullanın-bağımsız kültür medya en fazla 5-6 saat için. Bir Isıtma sahne kullanılabilir değilse, hücreler < 20 dk için mikroskop altında tutmak ve doku kültürü kuluçka uygun sıcaklık, CO2ve nem kontrolü ile içine yerini alması. Bu kültür koşullar türetme (örneğin, amfibiler karşı memeliler) organizmanın yanı sıra kullanılan belirli hücre türüne bağlı olarak değişebilir.
  3. Canlı hücre analizi için fluorescently tagged proteinlerin, GFP filtre (450-490 nm uyarma, 515-586 nm emisyon) veya Cy3 filtre (540-552 nm uyarma, > 590 nm emisyon) GFP veya protein mCherry erimiş, sırasıyla, bir 100 X veya 63 X yağı daldırma kullanarak seçin Amaç.
  4. Karşılaştırılabilir floresan sinyallerini, protein ifade karşılaştırılabilir düzeyde yansıtan içeren hücreleri için arama. Floresans ölçümlerde hücre hücre değişkenliği azaltmak için çok zayıf veya çok güçlü ifade içeren hücreleri kaçının.
  5. Lazer giriş gücü titre.
    1. 780 nm NIR lazer confocal mikroskop için bağlı
      1. Hücre çekirdeği yağı amaç aracılığıyla tek lazer taramaları (Çözünürlük 512 x 512 piksel, ağartılmış zum X1, bölge 50 x 4 piksel, 12.8 µs piksel bekleme süresi, yineleme x1) maruz kalma doğrusal parça hedeflemek için yazılım çamaşır suyu işlevini kullanın (100 X / 1.3 NA).
      2. (Üretici tarafından lazer mikroskop sisteminde bulunan yazılım/donanım kullanarak) lazer iletim yüzde %5 için diğer ayarları değiştirmeden ayarla.
      3. Bir hücre alanın ortasına yerleştirin. Faiz (ROI) aracı, bölgeyi tıklatın ve fareyi kullanarak çekirdeğinde bir çizgi veya kutusu (yaklaşık 50 x 4 piksel) çizme ve DNA hasar ikna etmek için "Çamaşır suyu" düğmesini tıklatın.
        Not: sonraki ışınlama adımda "beyazlatma" % %40 5 artışlarla artırılmalıdır veya en fazla %100 gerekirse.
      4. 800 nm NIR lazer epi-floresan mikroskop için bağlı
      5. Giriş gücü sayesinde kontrol bir (63 X / 1.4 NA) faz kontrast yağı daldırma amaç motorlu döndürme polarizasyon filtresi tarafından ışın yolundaki tanıttı ve bir bilgisayar kontrollü motorlu dönme sahne32,39 nolu monte , 58.
      6. Bir lazer güç ölçeri kullanmayı mikroskop girerek giriş gücü (mW) ölçmek ve polarize açısı (°) ayarlayın. 5-10 mW artışla, 20 mW-155 mW arasında değişen giriş güçler sağlamak polarize açıları belirler.
      7. Karşılık gelen polarize açısı 20 mW giriş gücü için ayarlayın.
        Not: polarize açı 40 °, bizim lazer sistemi için giriş gücü 65 ise mW. Giriş gücü 5-10 mW artışlarla artırmak.
  6. Canlı hücre analizi için 6.1 ve 6,3 adımlara geçin. Endojen proteinler veya modifikasyon ayirt tespiti için Bölüm 5'e geçin. Analizden sonra daha fazla titrasyon lazer güç 4.7 adıma gidin. Ters yönde faktör gereksinimi çözümlemek için Bölüm 7'ye gidin.
    Not: Hızlı (içinde birkaç dakika) ve geçici istihdamı BER ve NHEJ faktörlerin değil (< ~ 30 dk - 1 h faktörü ve < ~ 4 h sonrası bağlı olarak zarar indüksiyon, sırasıyla). Buna ek olarak, insan kaynakları faktörler Rad51 ve cohesin alımı ~ 30 dk - 1 h olarak algılanabilir ve onlar daha 8 h Düzeltilmemiş DNA lezyonlar44,50,51kalıcı eğilimindedir. Böylece, bu noktaları farklı onarım faktörleri için Işınlama sonrası farklı zaman incelemek gereklidir.
  7. Adım 4.4 olduğu gibi istenen artışlarla (Yani, 780 NIR lazer % 5'i ve 5-10 mW 800 NIR için) giriş gücü artırmak ve hücre eşik (hasarlı hücreleri gösteri istihdam % 50) ve en yüksek (% 100 hücreleri gösterinin belirlemek için yeni bir takım 4,5-4,7 adımları yineleyin İşe Alım) her protein için.

5. ayirt boyama

Not: PAR (karmaşık hasar işareti) ve H2AX fosforilasyon (γH2AX) gibi kovalent protein değişiklik algılanması için (DSB işaretleyici) yanı sıra cyclobutane pirimidin dimer (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) ve 8-oxoguanine (8-oxoG) (çapraz ve temel hasar işaretleri, sırasıyla), hücreleri sabit ve belirli antikorlar ile lekeli. Buna ek olarak, antikor algılama rekombinant füzyon protein overexpression tarafından indüklenen eserler ayırt etmek için endojen proteinlerin tarafından fluorescently tagged rekombinant proteinler ile elde edilen sonuçları onaylamak en iyisidir.

  1. Hücreleri farklı zaman noktalarda faktörlere bağlı olarak hasar indüksiyon (Adım 4.5) sonra 10 dk RT. az için % 4 paraformaldehyde/1 X PBS 1,5 mL (bkz. Adım 1.1) kültür medya değiştirerek düzeltmek
    Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir ve tüm iş havalandırılmış duman mahallede yapılmalıdır.
  2. %4 paraformaldehyde/PBS kaldırmak ve RT. % 0.5 deterjan/PBS için 10 dk 1 mL ekleyin
  3. % 0.5 deterjan/PBS ve durulama PBS 2 mL 5 min için hücrelerle iki kez kaldırmak ve çözüm engelleme 2 mL hücrelerde kuluçkaya (% 10 buzağı serum, % 1 BSA/PBS) RT. 1 h için
  4. Engelleme çözümü kaldırmak ve PBS 2 mL hücrelere ekleme ve PBS % 3 ile 250 µL birincil antikor çözüm yerine BSA/PBS bir gecede 4 ° C veya 1 h RT. kullanım olarak bir 1: 200-1:500 seyreltme (tipik konsantrasyon yaklaşık 1 µg/ampirik olarak belirlenen mL,) karşı antikorlar Özel farklı DNA hasarı işaretleri (örneğin, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (crosslinking hasar); 8-oxoG/DNA glycosylases (örneğin, NTH1) (baz hasar); PAR (yüksek doz karmaşık hasar)).
  5. Antikor çözümü kaldırmak ve durulama ile PBS 2 mL 5 min için iki kez, Kaldır PBS ve 250 µL % 0,1 ikincil antikor %3 ile kuluçkaya BSA/PBS RT., karanlıkta 1 h için
  6. İkincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS 2 mL 5 min için iki kere ekleyin ve görüntüleme adım 6.1 ve 6.2 için 1.5-2 ml PBS 4 ° C'de hücreler tutmak.

6. kantitatif floresan analiz Immunostained ve canlı hücreler

  1. Esir alma imge lekeli veya canlı hücre (n > 10) ışınlama için kullanılan mikroskop kullanarak. Epi-floresan mikroskop sistem 1344 x 1024 piksel çözünürlükte kullanın ve görüntüleri TIFF 16-bit dosyaları olarak kaydedin. Confocal mikroskop için 1 X büyütme kullanın; Argon lazerin GFP/FITC, Helene 594 lazer için Cy3/mCherry; 512 x 512 ya da 1024 x 1024 piksel görüntü çözünürlüğü için; hız 5, numarasını inceden inceye gözden geçirmek: hızlı tarama veya sinyal gürültü oranı artırmak için Çoklu tarama üzerinde ortalama için 2 + 1.
  2. Piksel yoğunluğu ölçmek için program tasarlanmış bir görüntü analizi kullanın.
    1. Birim dikdörtgen aracı hasar site tek hücre görüntünün çevresinde bir yatırım Getirisi çizmek için kullanın. Aynı boyutta ROI arka plan Floresans sinyal nucleoplasm bitişik, ama hasar siteleri ile örtüşen değil ölçmek için kullanın. Bu photobleaching confocal mikroskop sistemi ile ilgili normalleştirme için önemlidir.
    2. Görüntü analiz programı kullanarak Floresans sinyalleri ölçmek için "Birim Çözümleme Araç kutusunda bulunan raporu"'ı tıklatın. Yeni pencere-ecek gözükmek. "Veri için görüntü" bölümünün altında sadece "Ad" ve "Yoğunluk" kutuları işaretleyin. O zaman tıkırtı "ölçüleri görselleştirmek için bitmiş".
    3. Değerleri birim rapor penceresi ve "select sekmeleri (excel formatında)" altındaki alan ayırıcıları ve "Dosya" için verme hedef için bulunan tablo simgesini tıklatarak bir elektronik tablo programına vermek.
    4. Göreli sinyalleri almak için kontrol nucleoplasm (sütun 2) bölgede arka plan ve normalleştirme için 1 tarafından çıkarma tarafından hasar sitesinde (sütun 1) floresan yoğunluğu bölmek için elektronik tablo programı kullanın.
  3. Confocal mikroskop kullanarak gerçek zamanlı kantitatif floresan zaman ders analizi
    1. Adım 4,3 olduğu gibi mikroskop kullanarak fluorescently tagged protein-pozitif hücreleri tanımlamak.
    2. Hızlandırılmış Floresans görüntüleme önce hasar ve farklı zaman noktalarında hasar indüksiyon sonra bölüm 4'te gerçekleştirin. İlk çamaşır suyu ROI (hasar indüksiyon için) çizmek, o zaman seçme "edinme > saat serisi" 20 ve "döngüsü gecikme" alt menüsü, ayarla "Sayı" 30 s, "bir kez ilk taramadan sonra çamaşır suyu" seçin ve "B Başlat"'ı tıklatarak. Bu durumda, ilk görüntü hemen hasar indüksiyon 19 görüntü tarafından satın alınan şirketler bir 30 s aralıklarla takip önce kazanılır. Aralıkları ("döngüsü gecikme") çalışma amaç bağlı olarak değiştirilebilir.
    3. Resim alma işlemi tamamlandıktan sonra "Demek"'ı tıklatın ve yatırım Getirisi hasar bölgesi çizin. Yoğunluk içinde seçili ROIs listelendiği bir tablo almak için "tabloyu göster" seçeneğini tıklatın. Verileri farklı zaman Puan hasar sitesinde floresan yoğunluğu aynı bölgede daha önce hasar yoğunluğu tarafından bölerek normalize ve 1 tarafından çıkarın.

7. küçük Interfering RNA (siRNA) Transfection

Not: Hedef protein tükenmesi gözlenen protein işe alım siteleri (Bölüm 4) zarar ters yönde faktörü gereksinimini betimlemek için etkili bir yoldur. Ayrıca, strateji ayirt algılama için kullanılan bir antikor özgüllük gidermek için en iyi yoldur (bkz Bölüm 5).

  1. 1. gün: 6-8 x 104 HeLa hücreleri 0.5 mL kültür medyada her şey, bir denetim siRNA transfection ve bir PARP1 siRNA için tohum tarafından HeLa hücreleri bir 24-şey plaka 2 kuyu hazırlamak (5'-MOLDOVA'da AGA AAT CTC TTA SKK CAA-3').
  2. 2. gün: hücreleri yaklaşık % 40-50 birleşmesi olduğunu onaylayın. SiRNA transfection ilk turunda gerçekleştirmek: 5 seyreltik pmol siRNA 25 µL serum serbest kültür ortamının içine 3 µL lipidler dayanarak transfection reaktif tüpün içine ekleyin, karışımı yavaşça ve 5-10dk RT. adlı için kuluçkaya
  3. Bir kez 0.5 mL taze kültür medya hücrelerle durulama ve hücreleri (bkz. Adım 1.1) 0.5 mL taze kültür medyada tutmak.
  4. RNA-lipid kompleksleri hücrelere ekleyin ve karışımı yavaşça ileri geri çanak eğerek. Hücreleri geri adım 2.1 olduğu gibi kuluçka makinesi koymak.
  5. Transfection mix Aspire edin ve 0.5 mL taze kültür ortamı (Adım 1.1) 6 h sonra ekleyin.
  6. 3. gün: (bkz. adım 7.2) siRNA transfections ikinci tur gerçekleştirmek. O zaman, hücreleri 60-%100 2.3 adımda anlatıldığı gibi bir 35 mm gridded coverslip tabak içine tohum.
  7. 5. gün: Bölüm 4 tarafından belirlenen faiz, en büyük faktör alımı için en uygun lazer güç formu kullanarak lazer microirradiation devam etmek. Tipik olarak, verimli tükenmesi HeLa hücreleri yaklaşık % 60-90 görülebilmektedir.
    Not: Alternatif olarak ve tamamlayıcı yaklaşım, inhibitörleri, varsa, faktör faiz32,44fonksiyonun inhibe için kullanılabilir. DDR sinyal inhibe etkisini analiz etmek için 20 µM PARP inhibitörü, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) inhibitörü veya 10 µM DNA-bağımlısı protein kinaz katalitik alt birim (DNA-PKcs) inhibitörü ve 10 µM ATM inhibitörü Dimetil sülfoksit (DMSO) eklemek 1 h önce hasar indüksiyon yemekleri. DMSO sadece kontrol hücreleri ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade PtK2 hücreleri kullanarak, lazer giriş gücü titrasyon onların işe alım (şekil 1)32için en uygun koşul belirlemek için gerçekleştirilmiştir.

Yüksek giriş güç lazer hasar siteler, önemli CPD (genellikle ultraviyole (UV) hasar tarafından oluşturulan crosslinking hasar), özellikle baz hasarı tanır GFP-NTH1 DNA glycosylase yanı sıra kümeleme gözlendi. Buna ek olarak, daha yüksek XRCC1 ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Lazer microirradiation DDR araştırma için kullanmanın yararları şunlardır:

1. bu farklı teşvik için uygun ve DNA'ın tutarları basit kırılmalara karmaşık DNA hasar zarar ve algılamak için farklı onarım faktörler DNA, siteleri lazer ışınlama parametreleri ayarlayarak zarar. Hasar birden çok kez aynı hücre çekirdeği içinde trans etkileri ( şekil 3) olduğu gibi değerlendirmek için mümkündür.

2. önemli, hasar siteleri ve başka bir y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Dr Akira Yasui Tohoku Üniversitesi, Japonya için GFP-NTH1 ifade Plazmid ve Dr Eros Lazzerini Denchi Scripps Araştırma Enstitüsü, La Jolla, Kaliforniya TRF2-YFP ve EGFP-53BP11220-1711 ifade plazmid için teşekkür ederiz. Bu eser Hava Kuvvetleri Office bilimsel araştırma (FA9550-04-1-0101) ve Beckman lazer Enstitüsü A.ş. Vakfı (için M.W.B), Ford Vakfı Bursu ve NSF MCB-1615701 ve CRCC Bilimleri (için B.A.S), ulusal Akademisi tarafından desteklenmiştir CRR-17-426665 (için K. Y.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ti: Safir NIR darbeli femtosaniye lazer Mira-900Tutarlı Inc.Mira 900
Ters mikroskop Carl ZeissAxiovert 200M 63X
/1.4 NA objektifZeissAPOCHROMAT Ph3 
Kompakt Rotasyon Aşaması Newport CorpPR50PP
Sıcaklık Kontrol CihazıWarnerTC-344B
Isıtma SistemiIbidi 10918
Gaz İnkübasyon SistemiIbidi 11920
Lazer Güç ve Enerji Ölçer (RoHS)UyumluFieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Dijital CCD KameraHamamatsuC10600
LSM 510 META Lazer Tarama MikroskoplarıCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Izgaralı Tabaklar MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 böbrek epitel hücreleriATCCCCL 56 
HeLa hücreleriATCCCCL-2
DMEMYaşam Teknolojileri11885-092
CO2 Bağımsız Ortam Yaşam Teknolojileri18045-088
İleri MEM Yaşam Teknolojileri12492-013L-Glutamin,% 4 FBS
penisilin / streptomisinFisher Scientific15140122
L-GlutaminFisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Timidin ve nbsp;  SIGMAT9250
serum free media        (Opti-MEM I Azaltılmış Serum Besiyeri)Fisher Scientific11058021
Anti-Cycolbutance pirimidin dimer (CPD) (fare)Kamiya Biyomedikal ŞirketiMC-062
Anti-XRCC1 (fare)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (tavşan)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (tavşan)Abcamab70163
Anti-PAR polimerler (fare)Enzo Yaşam BilimleriBML-SA216-0100
Anti-PAR (tavşan)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (fare)Novus Biological NB100-56506
Anti 6-4PP (fare)Kamiya Biyomedikal
Anti-Rad21 (Tavşan)                                        (kohezin tespiti için)Yokomori (KY) laboratuvarında
Anti-Rad51 (Tavşan)Santa Cruz BiyoteknolojiSC-8349
Anti-Ku70 (fare)  Novus BiologicalsNB100-102
8-oksiguanin Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Tavşan)                                       KY laboratuvarındaref 43
  Anti-hCAPG (Tavşan)                                      (kondensin tespiti için)KY laboratuvarındaref 42
Cy3 AffiniPure, Eşek Anti-Tavşan IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Eşek Anti-Fare Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA Transfeksiyon ReaktifiQiagen301705
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 kararlı hücre hattı       KY laboratuvarındaref 49 
KY laboratuvarında üretilenGFP-NEIL2 kararlı hücre hattıref 54
üretilenGFP-NTH1 kararlı hücre hattıref 32
KY laboratuvarındaGFP-SMC1 plazmidi
KY laboratuvarındaGFP-Ku plazmidi
Anti-MDC1 (tavşan)  Novus BiyolojiklerNB100 ve ndash; 395
Anti-gH2AX (tavşan)  Kırlangıç07– 164
EGFP-53BP1 (1220-1711) Berns laboratuvarında üretilen PtK2 kararlı hücre hattıref 32Berns laboratuvarında
üretilenPtK2 kararlı hücre hattıref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
PARG inhibitörüTrevigen4680-096-03
DNA– PKcs inhibitörü ve nbsp; NU7026 SigmaN1537
ATM inhibitörü KU55933ve nbsp; Calbiochem118500
Olaparib Apexbio TeknolojisiA4154
Paraformaldehit ELEKTRON MİKROSKOPİSİ SCIENC MS100503-916 (EA)
Miktar Bir 1-D Analiz Yazılımı Sürümü 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC Görüntü Analiz Programı
Excelmicrosoftelektronik tablo programı
Triton X100Fisher ScientificBP151-500deterjan
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) 10X kalsiyum ve magnezyum içermezFisher Scientific142001661X 'ye seyreltin;
ile desteklenmiş üretilen oluşturuldu üretilen, oluşturuldu KY laboratuvarında üretilenüretilenTRF2-YFP

Kaynaklar

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27(2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68(2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548(2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219(2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460(2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DNA Hasar Yan tift Zincir K r lmasBaz HasarPoli ADP RibozilasyonKonfokal MikroskopiFloresan Protein EtiketlemeH cre D ng s SenkronizasyonuPARP nhibisyonuCanl H cre G r nt leme
Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.