Method Article

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konjenital göz ve kraniyofasiyal anomaliler nöral crest, vücut boyunca çok sayıda hücre tipleri ortaya çıkmasına göçmen kök hücreler geçici bir nüfusa aksamalar yansıtır. Biyoloji nöral Crest anlama okudu vivo içinde olabilir genetik olarak uysal modelleri ve gerçek zamanlı olarak yansıtan sınırlı olmuştur. Zebra balığı nöral crest gibi göçmen hücre popülasyonlarının çalışmak için özellikle önemli bir gelişim modelidir. Erken nöral crest farklılaşma düzenlenmesi ve işaretçileri nöral crest hücreler için büyük olasılıkla gösterir çok sayıda hayvan modellerinde gösterilmiştir sox10 ve foxd3 gibi nöral crest geçiş gelişmekte olan göz içine incelemek için lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada gelişmekte olan gözlerinin içine transgenik Zebra balığı embriyolar, yani Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP), yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı video yakalama için uygulanmıştır. Çoklu foton hızlandırılmış görüntüleme davranış ve erken göz gelişmesine katkıda bulunan iki nöral crest hücre popülasyonlarının göç desenleri ayırt için kullanıldı. Bu iletişim kuralı hızlandırılmış videoları, Zebra balığı nöral crest göç sırasında örnek olarak oluşturma hakkında bilgi sağlar ve daha fazla erken gelişme Zebra balığı ve diğer canlılar birçok yapıların görselleştirmek için uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konjenital göz hastalıkları çocukluk körlüğe neden olabilir ve kafatası nöral crest anormallikleri nedeniyle çoğu kez. Nöral crest hücreler Nöral tüp sizden ortaya çıkan ve vücut boyunca çok sayıda doku formu geçici kök hücreleri vardır. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 nöral crest hücreleri, ön ve mesencephalon,'kemik ve kıkırdak midface ve frontal bölgelerde ve Iris, kornea, Trabeküler meshwork ve gözün ön segmentte sklera neden olmaktadır. 4 , 6 , 7 , 8 nöral crest hücrelerden faringeal arches rhombencephalon formu, çene ve kardiyak çıkış yolu. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 çalışmalar nöral Crest için oküler katkıları ve Perioküler geliştirme, bu hücreler omurgalı gözü geliştirme önemini vurgulayan sermiştir. Nitekim, nöral crest hücre göç ve farklılaşma bozulma yol Fasiyal ve oküler anomaliler için Axenfeld-Rieger sendromu ve engin artı sendromu gibi. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 böylece, geçiş, yayılması ve bu nöral crest hücrelerinin farklılaşması kapsamlı bir anlayış Konjenital göz hastalıklarının altında yatan karmaşıklığı görmemizi sağlar.

Zebra balığı türleri çalışmak için oküler gelişim, Zebra balığı göz memeli meslektaşlarına benzer yapılardır ve birçok genler örümceklerle Zebra balığı ve memeliler arasında korunmuş bir güçlü model organizmadır. 18 , 19 , 20 Ayrıca, Zebra balığı embriyo şeffaf ve yumurtlayan, göz geliştirme gerçek zamanlı görselleştirme kolaylaştırmak vardır.

Daha önce yayımlanmış iş genişletilmesi,6,7,20 nöral crest hücre göç desen çok foton floresan yeşil flüoresan protein (GFP) SRY (cinsiyet belirleme bölgesi Y) transkripsiyon kontrolü altında etiketlenmiş transgenik Zebra balığı satırlarındaki Imaging hızlandırılmış kullanarak tanımlanmıştır-kutusu 10 (sox10) veya Forkhead kutusunu D3 (foxd3) gen düzenleyici bölgeler. 21 , 22 , 23 , 24. çoklu foton Floresans hızlandırılmış görüntüleme lazer mikroskobu ile fluorophores edilen örneklerin yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntüleri yakalamak için uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma ile tarama gelişmiş optik teknikleri birleştiren güçlü bir teknik olduğunu. 25 , 26 , 27 çok foton lazer kullanımı artan doku penetrasyonu ve azalan fluorophore ağartma dahil olmak üzere standart confocal mikroskobu üzerinde belirgin avantajları vardır.

Bu yöntemi kullanarak, nöral crest hücre göç ve göçmen yolları zamanlama konusunda farklı iki ayrı nüfus oluşturulmaması, yani foxd3 pozitif nöral crest hücrelerde Perioküler Mezenşim ve gelişmekte olan göz ve sox10 pozitif nöral crest kraniyofasiyal Mezenşim hücreleri vardı. Bu yöntemle, Zebra balığı oküler ve Fasiyal nöral crest göç göç görselleştirmek için bir yaklaşım tanıttı geliştirme sırasında gerçek zamanlı olarak düzenlenmiş nöral crest geçiş gözlemlemek kolaylaştırır.

Bu iletişim kuralı Tg (sox10:EGFP) ve bir örnek olarak Tg (foxd3:GFP) transgenik Zebra balığı erken göz gelişimi sırasında hızlandırılmış videoları oluşturma hakkında bilgi sağlar. Bu iletişim kuralı daha da erken gelişme Zebra balığı nöral crest hücrelerden türetilmiş herhangi bir oküler ve Fasiyal yapısının yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görselleştirme için uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntem diğer doku ve organların Zebra balığı ve diğer hayvan modelleri geliştirilmesi görüntüleme için daha da uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, Michigan Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi (UCUCA) tarafından belirlenen laboratuvar hayvanlarına insancıl muamele yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hızlandırılmış Görüntüleme için Embriyo Toplama

  1. Öğleden sonra 3 ile 9 arasında, erkek ve dişi yetişkin Tg(sox10:EGFP) veya Tg(foxd3:GFP) transgenik zebra balığını ikili çiftleşme için bölünmüş bir üreme tankına kurun.
    NOT: Sırasıyla Thomas Schilling ve Mary Halloran'ın nazik hediyeleri olan Tg(sox10:EGFP) ve Tg(foxd3:GFP) balıkları, otomatik floresan ve pigmentasyonla etkileşimi azaltmak için Casper (roy -/-, sedef -/-) arka planına çaprazlandı.
    1. Üreme tankını (oluklu iç tank + katı dış tank) monte edin ve ters ozmoz (RO) sistemi suyu ile doldurun.
    2. En fazla 3 dişi ve 3 erkeği, bir bölücü ile ayrılmış tankın karşı taraflarına aktarın; Tek bir üreme tankında en fazla 6 balık çifte yetiştirilebilir.
    3. Ertesi sabah, vivarium'da ışıklar yandıktan kısa bir süre sonra bölücüyü çıkarın.
      NOT: Bu çalışmada, ışıklar 14 saatlik ışık (sabah 9'da açık) ve 10 saatlik karanlık (öğleden sonra 11'de kapalı) döngüsündedir.
    4. 20 dakika boyunca veya yeterli sayıda embriyo üretilene kadar rahatsız edilmeden çiftleşmeye izin verin; embriyolar üreme tankının dibinde olacaktır. Yumurtalar görüldüğünde, oluklu iç tankı balıkla birlikte kaldırın ve bunları (balık ve iç tank) hızlı bir şekilde RO suyuyla dolu temiz, katı bir dış tanka yerleştirin.
  2. 1 L RO su başına aşağıdakileri ekleyerek standart 1X embriyo ortamını hazırlayın: 0.287 g (4.9 mM) NaCl, 0.127 g (0.17 mM) KCl, 0.048 g (0.33 mM) CaCl2.2H 2O, 0.04 g (0.33 mM) MgS04 (susuz). Tuzlar tamamen eriyene kadar çözeltiyi karıştırın.
    1. Mantar ilacı olarak 100 μL %0.1 metilen mavisi ekleyin. PH'ı 7,75'e ayarlamak için 0,25 g sodyum bikarbonat ekleyin. Ortamı oda sıcaklığında saklayın.
  3. Bir yumurta toplama süzgeci kullanarak dış tanktan yumurtaları toplayın ve yumurtaları 30 mL 1X embriyo ortamı içeren Petri kaplarına (tabak başına ~ 50 embriyo) aktarın. Toplanan yumurtaları 28,5 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. Embriyo hazırlama
    1. Tg(sox10:EGFP) embriyoları.
      1. Tg (sox10: EGFP) embriyoları için, döllenmeden 12 saat sonra (hpf), ölü yumurtaları çıkarın ve embriyoların gelişim aşamasını değerlendirin. Standart 460-490 nm bant geçiren uyarma filtresine sahip diseksiyon floresan stereomikroskop kullanarak GFP pozitif embriyoları tarayın. Forseps kullanarak, GFP'yi ifade eden 3-4 embriyodan koryonları çıkarın ve bu embriyoları 30 mL taze 1X embriyo ortamı içeren ayrı bir Petri kabına aktarın.
    2. Tg(foxd3:GFP) embriyoları.
      1. Tg (foxd3: GFP) embriyoları için, 22-24 hpf'de, ölü yumurtaları çıkarın ve embriyoların gelişim aşamasını değerlendirin. Standart 460-490 nm bant geçiren uyarma filtresine sahip diseksiyon floresan stereomikroskop kullanarak pozitif embriyoları tarayın. Forseps kullanarak, GFP'yi ifade eden 3-4 embriyodan koryonları çıkarın.
      2. 0.75 g (% 3) PTU'yu 25 mL Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözerek 1000X Feniltiüre (PTU) stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini alikotlayın ve 4 ° C'de saklayın. % 0.003 PTU çözeltisi oluşturmak için 30 mL 1X embriyo ortamına 30 μL 1000X PTU (% 3) stok çözeltisi ekleyin.
      3. Pigmentasyonu inhibe etmek için taranmış ve dekoryonlu GFP pozitif embriyoları% 0.003 PTU çözeltisine yerleştirin. Erken tedavi (<20 hpf'de) nöral krest ve nöroepitel gelişimi üzerinde olumsuz etkilere neden olabileceğinden, embriyoların 20 hpf'den önce PTU ile tedavisine başlamayın. 28
    3. Hızlandırılmış deneyi gerçekleştirmeden önce, sıcaklık kayması için bir kontrol olarak yaşa uygun karşılaştırmalarda 12-24 saat aralıklarla standart bir stereomikroskop kullanarak embriyoları canlı görüntüleme yoluyla izleyin.

2. Hızlandırılmış Görüntüleme için Embriyonun Montajı

  1. Hızlandırılmış embriyo ortamının hazırlanması
    1. 100 mL RO suyuna 0.004 g tricaine ekleyerek standart% 0.4 tricaine stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini (~ 1 mL) taze 1.5 mL santrifüj tüplerine alın ve -20 ° C'de saklayın.
    2. 48 mL 1X embriyo ortamına 2 mL %0.4 trikain çözeltisi ekleyerek hızlandırılmış embriyo ortamını (50 mL 1X embriyo ortamı,% 0.016 trican) hazırlayın. Embriyolar >22 hpf kullanılıyorsa, embriyo ortamına 50 μL% 3 PTU stok çözeltisi (nihai konsantrasyon% 0.003 PTU) ekleyin.
  2. %2 düşük eriyik agarozun hazırlanması
    1. 20 mL 1X embriyo ortamına 0.4 g düşük erimiş agaroz tozu ekleyin. 1-2 dakika veya çözelti berraklaşana ve tüm parçacıklar çözülene kadar ısıtın.
      NOT: Agaroz jelin yüzdesinin arttırılması, matrisin gözenekliliğini azaltır, bu da embriyonun büyümesini ve gelişmesini fiziksel olarak engelleyebilir. Bu nedenle, bu etkileri en aza indirmek için agaroz çözeltisi %1,5'e düşürülebilir. Bununla birlikte, uyarma ışını lazer tarama mikroskobu sırasında sabit tutulduğunda, zamanla logaritmik bir ilişki içinde hızla artan daha fazla ısınma meydana gelebilir. Bu protokolde, florofor absorpsiyonu nedeniyle ısıtma, odak bölgesine yüksek oranda lokalizedir. Bu nedenle, ilgilenilen bölgede, sıcaklık, 1.5'ten daha düşük yüzdelerde yapılan agaroz çözeltilerini eritmek için yeterince yüksek bir değere (30 ° C'nin ≥) yükselebilir, böylece embriyoyu doğrudan lazere maruz bırakabilir veya embriyonun odak düzleminden yüzdüğü koşulları mümkün kılabilir. Bu nedenle %1,5'ten daha düşük agaroz solüsyonlarının kullanılması önerilmez.
    2. agaroz çözeltisini saklama için taze 1.5 mL santrifüj tüplerine alikotlayın (~ 1 mL). Fazla agaroz solüsyonunu sıvı halde bir ısı bloğunda (60-70 °C) 2-3 hafta saklayın.
  3. Embriyonun Montajı
    1. Açık banyo haznesini kurmak için, açık banyo haznesinin tabanına az miktarda yüksek vakumlu gres koyun. Tabana dairesel bir cam lamel yerleştirin ve açık banyo odasının üst kısmını sıkılaşana kadar tabana vidalayın ( Şekil 1A, B).
    2. %2 agaroz solüsyonunu (60-70 °C) (%500-700 μL) pipetleyin (~ 500-70 μL), taban ~ 3/4 oranında dolana kadar açık banyo odasına koyun ( Şekil 1C). Agaroz çözeltisi laboratuvar tezgahındaki açık banyo odasına girdikten sonra, çözeltinin sıcaklığının yaklaşık 1 °C/s düştüğünü unutmayın.
    3. Agarozun tamamen polimerize olmadan hafifçe soğumasını (~ 30-40 ° C) sağlamak için 30 saniye bekleyin ve ardından tek bir embriyoyu tabanın merkezine aktarın ( Şekil 1D, E).
    4. Floresan stereomikroskop altında, embriyoyu 1-10 μL'lik bir mikropipet ucu kullanarak konumlandırın, embriyonun agarozun dibine yakın yerleştirildiğinden emin olun, çünkü embriyo agarozun yüzeyine çok yakın yerleştirilirse embriyo ortamı ile kaplandığında yüzebilir.
      NOT: Sunulan videolarda (Video 1-3) embriyolar lateral olarak yönlendirilmiştir, ancak ilgi alanına bağlı olarak embriyolar ventral veya dorsal olarak yönlendirilebilir.
    5. Agaroz sertleşene kadar embriyoyu izleyin ve yeniden konumlandırın. Agaroz sertleştikten sonra, monte edilmiş açık odayı tamamen hızlandırılmış embriyo ortamı ile doldurmak için bir transfer pipeti kullanın ( Şekil 1F).
    6. Açık banyo haznesini, sahne adaptörüne ( Şekil 1G) uyan hızlı değişim platformuna yerleştirin. Tüm kurulumu (embriyo, açık banyo odası, hızlı değişim platformu ve sahne adaptörü) kondansatörün hemen üzerindeki mikroskop tablasına yerleştirin ( Şekil 1H).

3. Hızlandırılmış Görüntüleme için Mikroskop Kurulumu

  1. Lazer ayarlarının belirlenmesi
    1. Kullanılacak lazer dalga boyunun belirlenmesi. İlgilenilen floroforun uyarma dalga boyunun iki katı olan bir dalga boyu kullanın (örneğin, GFP için 880 ile 940 nm arasındaki dalga boyu).
      NOT: Bu çalışmada, GFP için dalga boyu ayarı 880 ile 940 nm arasındaydı. Dalga boyu ne kadar yüksek olursa, lazerin çıkış gücü o kadar düşük olur.
    2. Lazer iletimini belirleyin. Lazer iletiminin yüksek bir yüzdesi embriyoyu öldürür, en düşük iletim seviyesini kullanır (önerilir). Burada sunulduğu gibi 24 ila 48 saatlik hızlandırılmış çalışmalar için iletimi %5'in altında tutun.
    3. Mikroskop algılama sistemlerini belirleyin ve florofor için doğru filtrelerin yerinde olduğundan emin olun.
      NOT: Çoklu foton mikroskopları için, yayılan floresan için çeşitli hassasiyetlere sahip çoklu algılama sistemleri vardır. Genel olarak, bir dahili algılama sistemi, harici bir algılama sisteminden daha az hassasiyete sahiptir. Yüksek düzeyde GFP ekspresyonuna sahip transgenik hatlar için dahili algılama sistemi yeterlidir. Düşük GFP ekspresyonu seviyelerine sahip transgenik hatlar veya diğer floroforlar (örneğin, kırmızı floresan proteini) için, lazer iletiminin yüzdesini makul bir seviyede tutmak için harici bir algılama sistemi gerekebilir. Kullanılan algılama sistemi ne olursa olsun, florofor için doğru filtreler yerinde olmalıdır.
  2. Çoklu foton mikroskobunda yazılım ayarlarının yapılması
    1. 5X objektifini kullanarak embriyoyu bulun. Sahneyi manuel olarak en yüksek konuma kaldırın ve embriyoyu mikroskop aralığının ortasına yerleştirmek için ince odağı kullanın.
    2. Sahneyi manuel olarak indirin ve 5X hedefini 25X suya daldırma hedefine değiştirin (sayısal açıklık NA, 0,95). Embriyoyu tekrar odak noktasına getirmek için sahneyi dikkatlice yükseltin.
    3. Yazılımda, "z" derinliğinde xy düzleminde zaman aralıklarında (t) birden fazla görüntü elde etmek için "xyzt" moduna tıklayın. Z yığınını sınırlayacak olan ilgilenilen alandaki odak derinliğini bulmak için epifloresan veya parlak alan görünümünü kullanın.
      1. Yazılımda, "başlat" düğmesine tıklayın; Bu deneyler için, gözün yan kenarı Z yığınının başlangıcıydı. "Bitir" düğmesine tıklayın; embriyonun orta hattı Z-yığınının sonuydu.
        NOT: Adım boyutu 0.3-0.6 μm idi ve 200 ila 60 μm'lik bir z-yığını boyutu için toplam ~120 adım vardı).
    4. Çekim süresini ve görüntüleme frekansını ayarlamak için menüye tıklayın. Mevcut sistem için, ~200 adım, her z-stack alımı için yaklaşık 5 dakika gerektirir. Floroforun yeterli şekilde geri kazanılması ve embriyonun hayatta kalması için, z-yığını alımı (lazer gücü açık) ve iyileşme süresi (lazer gücü kapalı) arasında en az 1: 3'lük bir orana izin verin.
      NOT: Örneğin, z-yığınları, 5 dakikalık z-yığını alımı ve 15 dakikalık kurtarma ile her 20 dakikada bir alınır. Bu protokol için, daha büyük z-yığınları elde edilebilir, ancak z-yığını alımları arasındaki süreyi uygun şekilde artıracak ve hızlandırılmış rota boyunca daha az görüntü ile sonuçlanacaktır.
      1. Embriyo iyileşmesi için uygun zaman ile, belirlenen pencerede z-yığınları arasındaki süreyi ayarlayın. Uygun pencerede deneme için toplam süreyi ayarlayın.
    5. Son yazılım, lazer ve embriyo ayarlamaları.
      1. Lazer ayarlarında son ayarlamaları yapmak için canlı görüntü ayarını açın. Floresan görüntüyü optimize etmek için yazılım içinde lazer iletimini (bkz. 3.1.2), kazancı ve ofset kaydırma çubuklarını ayarlayın. Ayrıca, deneyin uzunluğuna, embriyonun beklenen büyümesine vb. bağlı olarak embriyonun yönünü gerektiği gibi ayarlayın. İlgi alanının, deney süresi boyunca çerçeve içinde kaldığından emin olun.
      2. Hızlandırılmış çekim sırasında artık gerekli olmadığı için epifloresan ışık kaynağını kapatın. Sahneyi lazer güvenlik kutusuyla kapatın ( Şekil 1I). Dahili algılama sistemini kullanırken, lazer güvenlik kutusu arka plan ışığına karşı koruma için yeterlidir. "Başlat"a basın.
        NOT: Bununla birlikte, daha hassas harici algılama sistemlerinde, lazer güvenlik kutusu yeterli arka plan ışığını engellemez ve görüntü alımının bozulmasını önlemek için ek kapaklar gerekir.

4. Zaman Atlamalı Alım Sırasında

  1. Lazer güvenlik kutusundaki kayar kapılardan hızlandırılmış çekim sırasında açık banyo odasını her 8-12 saatte bir (günde en az 2 kez) hızlandırılmış embriyo ortamı ile doldurun ( Şekil 1I).
  2. Lazer güvenlik kutusunun kapılarını açmadan önce, mikroskobun aktif olarak bir görüntü almadığından emin olun.
    NOT: 24 ila 48 saat süren hızlandırılmış görüntüleme deneyleri için ısıtıcıların ve sirkülasyonlu ortam sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Gerçekten de, hem kademeli hem de sıralı ısıtıcıların sıcaklıklarını kontrol etmek zordur ve görüntü elde etme sırasında embriyo, 25-28 ° C arasındaki bir sıcaklık aralığında yeterli bir gelişme hızı sergiler. Ayrıca, dolaşımdaki medya sistemleri taşma ve ekipmana potansiyel olarak zarar verme eğilimindedir. Bu nedenle, tüm embriyolar edinim sonrası rutin olarak evrelendirilir.

5. Satın alma sonrası işleme

  1. Yazılımda, "dosya" menüsüne tıklayın ve "kaydet" i seçin.
  2. Dosyayı görüntü işleme yazılımında açın (Malzeme Tablosuna bakın). Doğru görüntü serisini vurgulayın. Yazılımda, "İşlem" menüsünü seçin. 3D Deconvolution'a tıklayın ve her z-stack.
    deconvolveve için "Uygula"ya tıklayın NOT: Dosya büyüktür; Bu nedenle, bu adım birkaç saat sürebilir.
  3. Yazılımda, "İşlem" menüsü altında, "maksimum projeksiyon"a tıklayın. Z-yığını başına 1 görüntü oluşturmak üzere maksimum projeksiyonu başlatmak için "Uygula"ya tıklayın. Yansıtılan her maksimum dosyayı (z-yığını başına 1 görüntü) tiff olarak dışa aktarın.
  4. Tek tek tiff dosyalarını video işleme yazılımına aktarın. Tüm tiff dosyalarını seçin ve video düzenleyiciye sürükleyin. Videodaki her görüntünün uzunluğunu 0.1 saniye olarak ayarlayın. Videoyu mov veya mp4 dosyası olarak dışa aktarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu foton Floresans hızlandırılmış görüntüleme kraniyofasiyal yapıları ve Tg (sox10:EGFP) ve (foxd3:GFP) Tg gözlerime ön segment Zebra balığı hatları ortaya çıkmasına kafatası nöral crest hücre geçiş desenler ortaya videoları bir dizi oluşturulur. Örnek olarak, sox10 -pozitif nöral crest hücreler arasında 12 ve 30 hpf Nöral tüp kenarından kraniyofasiyal bölgeye (Video 1, Resim 2) geçirin. Dorsal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu foton hızlandırılmış görüntüleme geçici ve göçmen hücre popülasyonlarının vivo izlenmesini sağlar. Bu güçlü teknik embriyonik süreçleri gerçek zamanlı eğitim için kullanılabilir ve bu da çalışmanın, bu yöntemi sonuçları nöral crest hücre göç ve kalkınma geçerli bilgisine gelişmiş. Önceki zaman hata görüntüleme çalışmaları genellikle mikroskobu tarama confocal lazer kullanmaktadır. 29 , 30 , 31 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser mali Ulusal göz Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri (K08EY022912-01) ve vizyon araştırma çekirdek (P30 EY007003) gelen hibe yoluyla destek verdi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Thomas Schilling nazikçe Tg (sox10:eGFP) Balık ve Mary Halloran nazikçe Tg(foxd3:GFP) balık hediye hediye için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bölücülü Yetiştirme TanklarıAquaneeringZHCT100Geçiş Tank Seti (1.0 litre) Kapaklı ve Ek Parçalı Şeffaf Polikarbonat
M205 FA Combi-ScopeLeica Microsystems CMS GmbHStereofloresan Mikroskobu - FusionOptics ve TripleBeam
Sodyum KlorürMillipore (EMD)7760-5KGÇift PE çuval. CAS No. 7647-14-5, EC Numarası 231-598-3
Potasyum KlorürMillipore (EMD)1049380500Potasyum klorür 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC numarası 231-211-8.
Kalsiyum Klorür DihidratFisher ScientificC79-500Poli şişe; 500 g. CAS No. 10035-04-8
Magnezyum Sülfat (Susuz)Millipore (EMD)MX0075-1Poli şişe; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Numarası 231-298-2
Metilen MavisiKırlangıç (EMD)284-12Cam şişe; 25 g. Toz, Sertifikalı Biyolojik Leke
Sodyum BikarbonatMillipore (EMD)SX0320-1Poli şişe; 500 g. Toz, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Numarası 205-633-8
N-FeniltiyoüreSigmaP7629-25G>98%. CAS Numarası 103-85-5, EC Numarası 203-151-2
DimetilsülfoksitSigmaD8418-500MLMoleküler Biyoloji sınıfı. CAS Numarası 67-68-5, EC Numarası 200-664-3
Trikain MetansülfonatWestern Chemical Inc.MS222Trikain-S
Düşük Eriyik AgarozISC BioexpressE-3112-25GeneMate Elek GQA Düşük Eriyik Agaroz, 25 g
Açık Banyo OdasıWarner InstrumentsRC-40HPYüksek Profilli
Cam LamellerFisher Scientific12-545-102Daire kapaklı cam. 25 mm çaplı
Yüksek Vakumlu GresFisher Scientific14-635-5C2.0 lb. tüp. DOW CORNING CORPORATION
1658832
Hızlı Değişim PlatformuWarner InstrumentsQE-135 mm
Stage AdaptörüWarner InstrumentsSA-20LZ-AL16,5 x 10 cm
TC SP5 MP çoklu foton mikroskobuLeica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Safir LazerSpectraPhysics
Lazer Güvenlik KutusuLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  YazılımLeica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 Sürüm 13.0 x64 YazılımAdobe
iMovie Sürüm 10.1.4 YazılımApple

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
  3. Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
  4. Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
  5. Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
  6. Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
  7. Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
  8. Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
  9. Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
  10. Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
  11. Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984(2010).
  12. Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
  13. Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
  14. Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
  15. Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
  16. Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
  17. Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
  18. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  19. Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
  20. Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
  21. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
  22. Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
  23. Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
  24. Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
  25. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  27. Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  28. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991(2011).
  29. Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525(2013).
  30. Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
  31. McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  32. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Photon ImagingTime Lapse MicroscopyNeural Crest CellsZebrafish EmbryosSox10 EGFPFoxd3 GFPLaser Scanning MicroscopyFluorescence ImagingEmbryo MountingZ Stack Acquisition

Related Articles