İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Özet

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

Özet

Kemotaksis geçiş boyunca belirli bir kimyasal degrade¹değil. Kemokinler hücresel anatomik ve temporal özgüllük²ile ticareti teşvik kemotaktik sitokinler vardır. Kemotaksis lenfositler kritik bir fonksiyonudur ve kantitatif olabilir diğer bağışıklık hücreleri içinde vitrodeğerlendirildi. Bu el yazması Kemotaksis, değerlendirilmesi izin yöntemleri açıklar vitro ve in vivo, hücre satırları ve yerel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri için. Vitro, plaka tabanlı biçimi çeşitli koşullar aynı anda içinde karşılaştırma izin verir gerçek zamanlı, 1-4 h. vitro tahlil koşullar olarak tanıtmak agonistleri ve antagonistleri, manipüle içinde tamamlandı ve su kuyusu aynı derecede kemotaksis rasgele hareket olduğu chemokinesis ayırt etmek. Vivo kaçakçılığı değerlendirmeler için bağışıklık hücreleri birden çok floresan boyalar ile etiketli ve evlat edinen transfer için kullanılan. Fark hücrelerinin etiketleme karma hücre popülasyonlarının böylece varyans azaltmak ve hayvanlar için yeterince güçlü bir deney gerekli sayısını azaltarak aynı hayvan içine sunulmasına olanak sağlar. Az 1 h olarak geçiş içine lenfoid doku oluşur ve birden fazla doku bölmeleri tatmak mümkündür. Akış Sitometresi doku hasat takip birden çok hücre tipleri göçmen kalıpları hızlı ve nicel analiz için sağlar.

Giriş

Güçlü bağışıklık uygun şekilde karşılık vermek için yaralanma, enfeksiyon ve self-tolerance oluşturmak için hücre tiplerinin sayısız karmaşık zamansal ve mekansal koordinasyon gerektirir. Birkaç düzine Kemokin reseptörleri ve onların karşılık gelen ligandlar keşfettim ve belirli hücreleri tarafından karakterize sağlayan moleküler mekanizmaları belirli bir zamanda belirli bir doku yönlendirilebilir. Böylece, kemotaksis ve geçiş eğitim İmmünoloji araştırma vazgeçilmez bir bileşendir. Nitekim, açıklanan vitro tahlil son zamanlarda T-hücrelerin kemotaksis C-C kemokinler 19. ve 21³doğru hızlandırır kemotaktik kofaktör tanımlamak için bir ta....

Protokol

tüm yordamları Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ' s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza.

1. In Vitro kemotaksisi

1. kültür THP-1 hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve 4-(2-hydroxyethyl) -1 ile ⁶ ' Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640)- piperazineethanesulfonic asit (HEPES; 25 mM) (tamamlamak medya), 0.5-1.0 x 10 ⁶ hücre/mL arasında yoğunluk bakımı.
2. İçinde bir 35 mm hücre kültürü çanağı, koşulu ile calcein acetoxymethyl (calcein-AM; 2.5 µM) veya diğer uygun floresan boya....

Sonuçlar

Calcein-AM boya kullanırken, hücre görsel muayene etiketi alımı (şekil 1) onaylayın. Otomatik floresan okuma zaman içinde ucun alt üzerine hücreleri transit olarak geçiş izler. Bu veriler, serum (şekil 2A) tarafından bir indüksiyon hücre göç MCP-1 doğru hem de bu yanıt bir büyütme açıkça gösteriyor. Göçmen uyarıcı gücüne bağlı olarak, en az 15 dk önce sinyal artışı bir gecikme yoktur. Floresan sinyal zirve ve sonra yavaş yavaş dü.......

Tartışma

Miktar bağışıklık hücre göç basit kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hızlı içinde in vitro ve in vivodeneyleri. Serum tarafından bir MCP-1 degrade ve büyütme karşısında insan monosit vitro kemotaksisi göstermektedir. Vivo, donör fare splenocytes differentially etiketli ve evlat edinen transferi alıcı hayvanlardan ele geçmiştir.

Bir plaka okuyucu kullanarak birkaç zaman Puan örnekleme avantajı vardır (her 30 olarak sık s) ve geçiş Nefelometri otomatikleştir.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Sığır Serumu	ATCC	30-2020
Hücre kültürü şişesi	Corning	353136
Calcein	Thermo Fisher Scientific	C1430	Uyarma: 485nm, Emisyon: 520nm
Hücre kültür kabı	Corning	1007
24 oyuklu plaka	Corning	353504
Floroblok Fibronektin Ekle	Corning	CB354597
15 mL konik tüp	Corning	352097
Sığır Serumu Albümin	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	9998S
İnsan Rekombinant MCP-1	Peprotech	300-04
yetişkin sığır Serumu	Sigma	B9433
HBSS; fenol kırmızısı içermez	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plaka okuyucu	Moleküler Cihazlar
Olympus IX71 ters floresan mikroskobu	Olympus
Isothesia	Henry Schein hayvan sağlığı	11695-6776-2	İzofloran anestezisi
Hücre süzgeci 40um naylon	Falcon Corning	352340
ACK parçalama tamponu	Kalite Biyolojik	118-156-101
CellTracker Turuncu CMTMR Boya	Thermo Fisher Scientific	C2927	Uyarma: 541nm, Emisyon: 565nm
CellTracker Yeşil CMFDA Boya	Thermo Fisher Scientific	C2925	Uyarma: 485nm, Emisyon: 520nm
5ml şırınga	BD Şırınga	309646
1ml TB şırınga	BD Şırınga	309625
THP-1 hücre hattı	ATCC	TIB-202
Parlak Menekşe 421 anti-fare CD3 Antikor	Biyoefsane	100228	Uyarma: 405nm, Emisyon: 421nm
Parlak Menekşe 605 anti-fare CD19 Antikor	Biolegend	115540	Uyarma: 405nm, Emisyon: 603nm
96 oyuklu yuvarlak alt plaka	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences	Akış sitometresi

Kalsiyum ve magnezyum içeren