Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

9.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56237

⸱

23 Ekim 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

Bu makalede

Özet

Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.

Özet

Nöronlar elektrik izolasyon ve myelinating oligodendrocytes trofik desteğiyle güveniyor. Önemini oligodendrocytes rağmen şu anda nöronlar, eğitim için kullanılan gelişmiş araçlar yalnızca kısmen atılmıştır oligodendrocyte araştırmacılar tarafından. Hücre türüne özgü tarafından viral iletim boyama canlı organel dynamics eğitim için yararlı bir yaklaşımdır. Bu kağıt ile adeno ilişkili virüs (AAV) transkripsiyon kontrolü altında mitokondrial hedeflenen floresan proteinler için gen taşıyan iletim tarafından oligodendrocyte mitokondri organotypic beyin dilimleri içinde görüntülenmesi için bir iletişim kuralı açıklar miyelin temel protein organizatörü. Koronal fare beyin dilimler organotypic yapmak için iletişim kuralı içerir. Bir yordam için hızlandırılmış düşsel mitokondri, sonra arkasından gelir. Bu yöntem diğer organelleri için transfer edilebilir ve organelleri miyelin kılıf içinde çalışmak için özellikle yararlı olabilir. Son olarak, Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından yaşam dilimleri içinde günahı miyelin görselleştirme için hazır bir tekniği tarif. Çekirdek hiçbir ekstra ekipman gerektirir ve canlı görüntüleme sırasında miyelin kılıf tanımlamak yararlı olabilir.

Giriş

Beynin beyaz madde sinir hücresi aksonlar miyelin, oligodendrocytes tarafından kurulan özel bir genişletilmiş plazma zarı sarılı oluşur. Miyelin hızlı ve güvenilir aksiyon potansiyeli yayılması ve myelinated akson uzun vadeli yaşam için gereklidir ve nörolojik disfonksiyon miyelin kaybına neden olabilir. Önemine rağmen oligodendrocytes özelliklerini daha az bilinen neurons ve astrocytes ile karşılaştırılır. Sonuç olarak, daha az araçları oligodendrocytes eğitimi için geliştirilmiştir.

Mitokondri, endoplasmatic retikulum (ER) veya farklı veziküler yapıları organelleri dinamik değişiklikleri zaman içinde eğitim yararlı olabilir gibi hücre organelleri görüntüleme yaşıyor. Geleneksel olarak, oturma oligodendrocytes görüntüleme monocultures1,2' gerçekleştirdi. Ancak, Monokültür oligodendrocytes kompakt miyelin görüntülenmez ve organotypic veya akut beyin dilimleri bu nedenle, daha iyi bir seçenek Yerelleştirme ve organelleri hareketin okurken olabilir. Yerelleştirme küçük organelleri ve miyelin kılıf protein myelinated akson ve çevresindeki miyelin kılıf arasında kısa bir mesafe nedeniyle zor olabilir. Böylece, ışık mikroskopik immunostaining yordamlar yalnız organelleri miyelin kılıf içinde ve bu myelinated akson arasında ayırımcılık Uzaysal çözünürlük var mı. Bu viral iletim flüoresan proteinler organel hedef hücre türüne özgü rehberleri tarafından tahrik için genleri olan tarafından çözülebilir. Avantajları dinamiği ve organel yerelleştirme doğru değerlendirme sağlar bir hücre özgü ve seyrek ifade vardır. Transjenik hayvanlar böyle bir hücre özgü ifade organel hedefli3elde etmek için de kullanılabilir. Ancak, üretim ve bakım Transjenik hayvanlar, pahalı ve genellikle viral yöntemlerle elde edilebilir seyrek ifade sunmuyor.

Yöntem tanımlamak burada miyelin temel protein düzenleyici tarafından (MBP-mito-dsred veya MBP-mito-GFP) görselleştirmek için tahrik oligodendrocytes floresan proteinler (dsred veya yeşil flüoresan protein, GFP) mitokondriyal hedefli ile viral iletim kullanır organotypic beyin dilimleri içinde oligodendrocyte mitokondri. Buna ek olarak, ifade (mito-dsred ile birlikte kullanılan GFP veya mito-GFP ile kullanılan tdtomato) sitoplazmada başka bir floresan proteinin hücre morfolojisi, miyelin kılıf sitoplazmik bölümler de dahil olmak üzere görselleştirme etkinleştirmek için kullanılır. Protokol organotypic beyin dilimleri (De Simoni ve Yu, 20064,5tarafından açıklanan protokol değiştirilmiş bir sürümü) yapmak için yordam içerir. Biz o zaman mitokondrial hareketi eğitim için hızlandırılmış görüntüleme açıklayınız. Bu yordam, sürekli bir değişim görüntüleme orta, uyuşturucu veya diğer Orta değişiklikleri görüntüleme sırasında uygulama kolaylığı sağlar bir kurulum ile dik bir confocal mikroskop kullanır. Hızlandırılmış görüntüleme yordam confocal herhangi bir mikroskopla aşağıda açıklandığı gibi yaşam dilimleri korumak için bazı ekstra ekipman üzerinde gerçekleştirilebilir. Protokol Ayrıca görüntüleme optimize etmek ve fototoksisite azaltmak için birkaç ipucu içerir.

Son olarak, günahı miyelin Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından görselleştirmek için hızlı ve basit bir şekilde açıklanmıştır. Bu miyelin kılıf canlı görüntüleme sırasında tanımlamak yararlı olabilir. Son yıllarda, gerekli herhangi bir boyama olmadan görüntü miyelin için çeşitli teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu özel ekipman ve uzmanlık6,7,8gerektirir. Burada açıklanan yordamı kullanır miyelin kılıf yansıtıcı özellikleri ve spektral Confocal yansıma mikroskobu Basitleştirilmiş tek-uyarma dalga boyu sürümüdür (skor, içinde birkaç lazer dalga boyu miyelin görselleştirmek için birleştirilir) 9. çekirdek 488 nm lazer ve 470-500 nm bant emisyon filtre veya bir akort emisyon filtre vardır herhangi bir confocal mikroskobunun yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

burada açıklanan yordamları Norveçli hayvan araştırma yetkilisi tarafından onaylanmıştır. Tedarikçiler ve Katalog numaraları için sarf malzemeleri ve diğer gerekli belgenin sonundaki malzemeler listede kullanılabilir bağlantı donanımıdır.

1. hazırlık Organotypic dilim

Not: Doğum sonrası gün 7-9 (p7-9), hangi altı-şey kültür tabağı üzerinde bölünmüş 24 organotypic dilimleri verim iki fare pups bu tarifi kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, tüm yordamları steril bir mahallede yapılmalı ve nitril veya lateks eldiven kullanılmalıdır. Yalnızca hücre kültür sınıf malzemeler kullanılmalıdır.

  1. Basınçlı kap şişeler, diseksiyon araçları (1 büyük makas, 1 küçük makas, 1 büyük düz spatula, 1 küçük yuvarlak ve keskinleşmiş spatula ve 1 forseps, bkz: malzeme listesi Ayrıntılar için), cam Pipetler, pipet ipuçları ve dilim hazırlanırken kullanılan doku mendil.
  2. Cam Pipetler yarısı-meli var olmak kullanılmış ile büyük açılış, dar ucunu break.
    1. Puan ile bir elmas scriber pipet cam daralma başladığı puanın altına çevresinde (varsa) kalem. O zaman pipet sivri sonu nitril eldiven içine veya benzer yer. Dikkatle tezgah karşı iterek süre pipet bükme tarafından ihbar kırmak.
    2. Sonra zımpara kağıdı bir parçası üzerinde sürtünme kırık sonuna künt veya hafif bir Bunsen brülör eritebilir. Kırık Pipetler kesme beyin dilimleri Lastik ampul döndü kırık ucuyla aktarmak için kullanılır ve büyük açık çözüm/dilimleri dokunmadan son.
      Not: Bu steril bir mahallede yapılmaz ve önceden birkaç gün yapılabilir.
  3. Kültür yemekleri hazırlamak.
    Not: Bu gün Dilimleme önce veya Dilimleme önce en az 2 saat yapılabilir.
    1. Sterilize politetrafloroetilin (PTFE) membranlar (" konfeti "). İki steril forseps çevreleyen mavi plastik parçalar tek konfeti kaldırmak ve iki kez bir % 96 etanol (alkol) içeren Petri daldırma tarafından sterilize etmek için kullanın. Sonra düz bir steril büyük kuru kabında konfeti yatıyordu.
      Not: Konfeti hidrofilik PTFE membranlar kültür ekler membranlar benzer vardır. Konfeti kullanımı tek dilimleri kolayca gelen Ekle mikroskop Kur Forseps ile konfeti kaldırarak transfer edilebilir çünkü canlı görüntüleme yardımcı olur (4,8 bkz. ayrıntılı bilgi için). Alternatif olarak, beyin dilimleri (hangi doğrudan kültür Ekle membran için dilimleri eklenecektir) konfeti olmadan kültürlü. Bu durumda, membran eklemek dilim mikroskop Kaplıcalar'a aktarmak için bir neşter ile kesmek gerekir.
    2. Kültür orta 1 mL ekleyin (reaktifler tarifte ' tablo) her şey altı-şey kültür yemekleri.
    3. Yer bir kültür steril forseps kullanarak her kuyuya yerleştirin. Hava kabarcıkları ekleme ve kültür orta arasında kaçının.
      Not: para ve çevre kaydetmek için bu kültür ekler yeniden kullanmak mümkündür. Bu kapsamlı distile H 2 O (dH 2 O) durulama tarafından yapılabilir kuluçka % 70 ardından alkol yeniden kadar 24 saat en az. Bir hücre kültür plaka ultraviyole (UV) 15-30 dk. için ışık altında ekler yeni kültür için hazırlanırken, Kuru
    4. Yer iki (steril ve kuru) konfeti her kültür ekler. Konfeti en az örtüşme almak için ekler kenarlara doğru yerleştirin.
    5. Hücre kültür kuluçka %5 CO 2 37 ° C'de plakaları koymak.
  4. Kabarcık soğuk diseksiyon orta (reaktifler tarifte ' tablo) ile bioxide gaz (% 95'i O 2 /5%CO 2). Çözüm steril tutmak için tüp gaz silindir steril enjektör filtre (0,22 µm gözenek boyutu) bağlanmak.
    1. Çift öteki son-in belgili tanımlık tenkıye filtre steril tüp için steril cam pipet bağlı. Cam pipet çözüm içinde yer, parafilm ile kapak ve gaza açın. Diseksiyon orta buz üzerinde tutmak
  5. Diseksiyon/Dilimleme alan hazırlamak.
    Not: İdeal olarak, bu yordamı steril bir mahallede yapılmalıdır. Bu mümkün değilse, vibratome bir tezgah üzerinde bırakılabilir. Bu durumda, bu saç net ve yüz maskesi kullanmak için tavsiye edilir.
    1. Bir tek uçlu tıraş bıçağı kullanılarak kesme bir dikdörtgen parça özel jel (yaklaşık 2 cm x 0.5 cm) (reaktifler tarifte ' tablo) ve vibratome bıçak uzun yüzü öyle ki bu vibratome sahneye tutkallayın.
    2. Temiz tüm yüzeyler ve %70 alkol ile vibratome parçaları ve autoclaved doku mendil ile silin.
      Not: Bu alkol hücreleri zarar verebilir beri beyin dokusu ile temas halinde olacak tüm parçaları tamamen kuru olduğundan önemlidir.
    3. Steril bir jilet vibratome için iliştirin ve vibratome bu işlevi varsa titreşim denetimi yap.
    4. Yer autoclaved diseksiyon araçları ile birlikte autoclaved doku başlıklı mendil, dört küçük Petri yemekler, yuvarlak kenarlı neşter, kauçuk ampuller, iki open-end cam Pipetler (bkz: pt. 1.1) ile 2 cam Pipetler ve süper yapıştırıcı (alkol ile püskürtülür).
    5. Vibratome tekne ve dört küçük Petri yemekler içine kabarcıklanma diseksiyon orta dökün.
      Not: Şu andan itibaren orta değil bubbled veya buz üzerinde tutulur beri bu adımı yalnızca hemen önce diseksiyon yapılmalıdır
  6. Teşrih ve mount beyin.
    Not: sağlıklı dilimleri elde etmek için bu adımı ve hassas yapılması gerekir. Biraz pratik gereklidir.
    1. Neckor yerel esaslarına göre çıkığı tarafından hayvan #1 ötenazi ve büyük makasla başını kesmek.
    2. Kullanma küçük, keskin makas yeniden, hızlı bir şekilde cilt burun boyun sagittal bir kesi yaparak çıkarın ve bir kenara çek kafatası ortaya çıkarmak için.
      1. Tarafından yanal insizyon frontal kemik ve lamboid dikiş (cerebrum ve beyincik arasında sınır) iç parçası üzerinde takip sagittal dikiş boyunca kesin.
      2. Forseps açık eğmek için kafatasının her iki tarafta kullanın. Kranial sinirler beyinden beyin ventral yan altında yuvarlak, keskin bir spatula ekleme ve yavaşça spatula yanal hareket kesiliyordu.
    3. İçin beyincik rostral kesilmiş bir koronal yapmak için bir tek uçlu jilet kullanın.
      Not: Bu kesik hangi dilimler kesin açısını belirler. Bu nedenle, bir düz açıyla yapılması gereken.
    4. Beyin kafatası ve diseksiyon orta içeren bir küçük Petri flip.
    5. Yinele adımları 1.6.1.-1.6.4. hayvan #2 ve yer için ikinci bir Petri bu beyinde çanağı.
      Not: Hayvanlar steril değildir. Diseksiyon başlık bir tarafında gerçekleştirmek ve beyni kafatasından kaldırılmış bir kez daha sonra diğer, temiz kayar mı.
    6. Değiştirmek eldiven.
    7. Ekle beyin vibratome aşamasına: süper yapıştırıcı ince bir tabaka takılı özel jel önünde sahne alanı ekleyin. Beyin #1 büyük düz spatula ile taze kesilmiş (Kaudal) ile yan tutun spatula ve ventral yan bakan dokunmadan (ve mümkün olduğunca yakın) özel jel.
      1. Sonra yavaşça beyin tutkal üzerine spatula ile bir dizi forseps kapalı iterek yerleştirin. Beyin #2 için yeterli alan bıraktığınızdan emin olun.
        Not: Bu kesim engel olarak beyin de sahne ama aşırı tutkal, bağlı olduğu önemlidir.
    8. Sonra hemen montaj beyin #1 büyük spatula diseksiyon orta beyin üzerine birkaç damla eklemek için kullanın. Bu beyin nemli tutmak tutkal sertleşmesine ve beyin taraf için yapışmasını önlemek.
    9. Tekrar adım 1.6.7 ve 1.6.8. beyin #2 için.
    10. Vibratome tekne sahneye takın.
  7. 230 µm kalınlığında koronal dilim bir genlik ile 1-1.5 mm, 85 Hz frekans ve 0.2 mm bir hız kesme/s. toplamak dilimleri arasında yaklaşık 1.4 mm rostral ve 2.1 mm Bregma için Kaudal. Her dilimin open-end cam Pipetler (pt. 1.1) kullanarak kestikten sonra
    1. toplamak dilimleri. Dilimleri diseksiyon orta içeren bir Petri kabına aktarın. İki hemisferlerin bölen iki parçaya dilimleri kesmek için yuvarlak bir neşter kullanın.
  8. Tüm dilimler kestiğinizde, kültür yemekleri dilimleri yerleştirin.
    1. Kültür çanak (bir zaman) dışında da kuluçka alın.
    2. Open-end cam Pipetler kullanarak dikkatli bir şekilde transfer bir dilim her konfeti.
      Not: Dilimleri düz ortasında konfeti ara vermeliyiz. Bu biraz beceri gerektirir. Bazı dilimleri mükemmel değildir, ancak, tüm dilimler kuluçka makinesi mümkün olduğunca çabuk almak önemli olduğu gibi onları taşımak zaman harcamak daha onları bırakmak daha iyi olur.
    3. Yavaşça dilimi dokunmadan aşırı orta kaldırmak için bir cam pipet (sivri uç) kullanın.
      Not: Dilimleri sıvı kuluçka sırasında dalmış değil. Böylece, dilimleri (orta ince bir film hala dilimleri kapsayacak) havaya maruz öyle ki aşırı orta emişli gerekir. Sıvı içinde dalmış kalır dilimleri genellikle sağlıksız veya ölmek (4 ve gözlemlerimiz).
    4. Tüm konfeti bir kez tek bir dilim bulaşık kuluçka makinesi içeri taşıyın.
    5. Tekrar adımları 1.7.8.-1.8.4. yemek #2 için.
  9. Kültür orta değiştirin.
    Not: Bu gün (gün 1 in vitro DIV1) Dilimleme sonra yapılmalıdır ve sonra 2-3 günde.
    1. Onceden kültür orta bir su banyosu veya kuluçka makinesi.
    2. Steril bir başlık, vakum emme veya düzenli bir pipet steril ucu ile her şey kültür ortamından Aspire için kullanın. Bu yavaşça çanak (yaklaşık 30 derece) devrilme ve pipet ucu kültür Ekle kenarında yerleştirerek yapılır.
    3. (Orta kaplı Ekle alt tutmak için yeterli orta bırakarak) her şey yaklaşık 800 µL kaldırın. O zaman, temiz bir pipet kullanarak, Önceden ısıtılmış orta 800 µL her şey için ekleyin. Bulaşıkları geri hücre kültür kuluçka makinesine görüntülenmemesini.

2. Viral iletim

  1. satın almak ya da yapmak AAVs ile ilgi, 10 , 11 daha önce açıklandığı gibi bir plazmid.
    Not: Bu protokolü açıklar AAV serotip 2/8 (AAV 2/8) mitokondrial taşıyan dsred veya GFP miyelin temel protein organizatörü 12 transkripsiyon kontrolü altında bir muhabir gen olarak hedef (AAV2/8 MBP_mito_dsred veya AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) oligodendrocyte mitokondri görselleştirmek için. AAV 2/8 GFP ya da tdtomato olarak genel CAG düzenleyici tarafından tahrik muhabir gen taşıyan (AAV 2/8 CAG_GFP veya AAV 2/8 CAG_tdtomato) oligodendrocyte sitoplazma görselleştirmek için kullanılır. Böylece, AAV2/8 MBP_mito_dsred AAV 2/8 CAG_GFP ile kombinasyonu verir kırmızı mitokondri ve yeşil sitoplazma oligodendrocytes, AAV2/8 MBP_mito_GFP ve AAV 2/8 birleştiren ise yeşil mitokondri ve kırmızı sitoplazma CAG_tdtomato verir. Yapıları içinde açıklanan daha ayrıntılı başka bir yerde 13.
  2. Gün 7 tüp bebek (DIV7), AAVs ile oligodendrocytes transduce.
    Uyarı: AAVs ile çalışmak için güvenlik kuralları izleyin. Uygun eğitim ve biyogüvenlik düzeyi onay gerekli olduğundan emin olun. Aşağıdaki noktaları eldiven ve önlük kullanarak bir sınıf II Biyogüvenlik dolapta yapılmalıdır. AAV uygulama korteks alanı dilimler için bu en iyi kurtarma göründüğü alana kadar burada anlatılan.
    1. Dilute AAV Önceden ısıtılmış (37 ° C) olarak kültür orta. Dilutions 2 × 10 9 genom kopya/mL (GC/mL) etrafında dilimi içindeki tek hücreleri görüntüleme sağlayan bir seyrek iletim, oligodendrocytes almak için tavsiye edilir. Ancak, farklı titreleri kullanarak bir pilot belirli deneyler için uygundur transduced oligodendrocytes yoğunluğunu sağlamak için yapılmalıdır. İki farklı AAVs kullandıysanız, onlar aynı çözüm içinde karışık olmalı ve aynı anda dilimi eklendi.
    2. Ekle yaklaşık 1.3 µL seyreltilmiş AAV her dilim için: pipet ucu dışarıda kuru olduğundan emin olun. 1.3 µL pipet AAV seyreltilmiş ve korteks, yukarıda pipet pipet ucu (yaklaşık 1 mm uzakta) ile dilim dokunmadan mümkün olduğunca yakın tutun.
    3. Daha sonra yavaş yavaş çözüm pipet dışarı itin. Çözüm dilimi dokunduğunda, pipet ucu çözüm tüm korteks alana yayılmış korteks üzerinde hareket ettirin.
      Not: Bu yordam dilimlerini dışarı mahalle için gerekli daha uzun tutmak önlemek için mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Bunu bir tabak üzerinde zaman ve ilk tabak çanak #2 başlamadan önce geri da kuluçka makinesine koy. Doku zarar bazı uygulama ve sabit bir el gerektirir olmadan AAV tatmin edici bir dağıtım almak için.
  3. Hücre laboratuarda bir dik Floresans mikroskobu varsa, protein ifade süre kültür içinde mikroskop altında yemek vermek suretiyle kontrol edilebilir.
    Not: Bulaşık kuluçka makinesi dışında 2-5 dakikadan fazla tutulmalıdır değil.

3. Hızlandırılmış görüntüleme

Not: görüntüleme her floresan işaretleri ifade düzeyde yeterli ve dilimleri sağlıklısın gerçekleştirilebilir (genellikle DIV11-14).

  1. Kabarcıklanma yansıma çözümü ısıtılır ve böylece girin ve banyo çıkmak mikroskop, perfüzyon ve Isıtma doğru ayarlandığından emin olun.
    Not: Banyo Odalar için çeşitli çözümler mevcut. Basit bir versiyonu burada sunulmaktadır.
    1. Olun içinde - ve çıkışları banyo taraf için blu-çakmak/eğlenceli çakmak tarafından eklenen körelmenin şırınga iğneleri ~ 45 ° (bent) tarafından Bath.
    2. Boru Peristaltik pompa Isıtma boru ve sonra giriş şırınga iğne banyo Kalorifer Ünitesi ile üzerinden sürekli kabarcıklanma yansıma çözümü bir şişe gider.
    3. Başka bir tüp şırınga iğne prizine takýn. Bu tüp sonra Peristaltik pompa yoluyla ve geri çözüm görüntüleme (veya atık şişe) şişe gider.
  2. Çözüm Imaging kabarcık (reaktifler tarifte ' tablo) ile bioxide gaz.
    Not: Bu sta olmalıdırrted en az 15 dakika önce görüntüleme ve deney boyunca devam.
  3. Dönüş Peristaltik pompa ve ısıtıcı ve çalışma solution'ı en iyi banyo sıcaklığı (37 ± 0,5 ° C) elde etmek için banyo. Sıcaklık birimine bağlı termometre sensörü banyo çözümde batık olun.
  4. Mikroskop, floresan lamba ve uygun lazerler açın.
  5. Kümesi kadar uygun bir ışık yolunu örnek.
    Not: Bu mikroskop kurulum ve yoklama bağlı olarak değişir. Confocal mikroskop kullanmak hakkında genel bilgi gereklidir ve burada ele değil.
  6. Uygun büyütme ve sayısal diyafram (n.a.) ile bir su daldırma hedefi kullanın. 40 x su daldırma planı-apochromat amaç (n.a. 1.0) kullandığımız.
  7. Açık iğne deliği yaklaşık 2-2.5 µm hızlandırılmış video için optik bir bölümünü elde etmek için. Bu odak dışında sırasında hızlandırılmış taşıma mitokondri azaltır.
  8. Transfer organotypic dilim banyo için:
    1. görüntüleme çözümü veya kültür orta bir damla küçük bir plastik Petri kabına ekleyin.
    2. Steril bir başlık, bir organotypic dilim membran aktarmak için kullanmak steril forseps eklemek için açılan. Forseps sadece konfeti ve dilim dokunmamalı.
    3. Kapak Petri kabına koyun.
    4. Hemen dilimler kuluçka makinesi olarak geri kalanını içeren kültür yemek koymak.
    5. Mikroskop dilime içeren getirmek Petri kabına.
    6. Dilim mikroskop Kaplıcalar'a transfer ederken Peristaltik pompa kapatmak açmak. Öncelikle, forseps Petri kabına dilimden (konfeti yüzer olacak) banyo üst konfeti kaldırmak için kullanın. O zaman dilimi dokunmadan konfeti dokundukları her iki tarafta konfeti forseps iki uçları yerleştirin ve konfeti çözümü üzerinden banyo altına itin. Banyo ortasında konfeti Merkezi.
    7. Dilim dokunmadan üzerine konfeti hold-down çapa (ARP) yerleştirmek için kullanım forseps.
      Not: Bir harp yüzen veya banyoda sürüklenen dilim önlemek için kullanılan bir at nalı şeklinde Platin noktadır. Akut dilimler için ince dizeleri ARP bir kenarından diğer (bir müzik harp benzeyen) çalıştırın. Organotypic dilimler için ARP stringless olmalı ve böyle bir şekilde bu dilimi dokunmadan üzerine konfeti düzenleyebilirsiniz konfeti boyutuna uygun.
    8. Peristaltik pompa yeniden açın.
  9. Amaç örnek aşağı düşürmek.
  10. Hücre ve görüntü bölgesine seçin.
    Not: Bu hücre toksisite neden olabilir gibi ışık lazer hücrelerinin aşırı maruz önlemek (ipuçları noktaları aşağıda bakınız).
    1. Doğru ifade ile sağlıklı görünümlü oligodendrocyte bulmak için göz mercekleri ve floresan lamba kullanır. Genellikle, floresan protein güçlü bir overexpression var oligodendrocytes sağlıksız görüntülenir. Sağlıksız oligodendrocytes süreçleri boğum bir görünüme sahip olacak ve mitokondri parçalanmış görünecektir. Sağlıklı oligodendrocytes içinde soma ve işlemler düzgün görünür ve mitokondri var çeşitli uzunluklarda (her ne kadar genellikle çok daha kısa, sinir hücreleri ve astrocytes 13 ,- 14 , 15).
    2. görüş alanı ortasında ilgi yerleştirin.
    3. Kullanım " canlı " işlev (Leica ve Zeiss mikroskoplar için) yazılım hücrenin üstünde belgili tanımlık perde belirlemek ve ilgi, Örneğin, bir alan bir parçası birkaç birincil işlemler veya miyelin kılıf veya tek bir işlem içeren hücreyi seçin veya miyelin kılıf.
      Not: işlemler/kaplamalar kadar mümkün olduğunca görüntü edebilmek için nispeten yatıyordu işlemleri içeren alanları düz x-y yönde seçin.
    4. İlgilendiğiniz alanı yakınlaştırmak (genellikle 0,14 - piksel boyutu ile bir görüntü üreten 0.30 µm).
    5. Kullanma " bölgeler " aracı, alanın çevresinde bir dikdörtgen çizin ve yalnızca seçili bölge inceden inceye gözden geçirmek için seçeneği seçin. Zaman ve böylece lazer pozlama, tarama yalnızca seçili bölge tarayarak düşürülür.
      Not: Yatay dikdörtgen bölgeler daha kısa gerekli taranan satır sayısı nedeniyle dikey bölgeleri daha hızlı taranacaktır. Eğer dikey dikdörtgen bölge inceden inceye gözden geçirmek, scanning zaman tarama alanı (Döndürme aracı kullanarak), 90 derece döndürerek azaltılabilir.
  11. Ayarlama lazer güç ve kazanç mitokondri iyi bir görünüm elde etmek için.
    Not: gerekli en az lazer güç kullanın. Mümkünse, artan lazer güç yerine kazanç açın. Hücre toksisite neden ek olarak, çok yüksek lazer gücü görüntülü nesneleri zaman içinde böylece bir artış daha lazer güç gerektiren çamaşır suyu veya tarama sırasında kazanmak. Gerekli lazer güç ve kazanç ifade düzey ve mikroskop bağlı olacaktır. Bir LSM700 confocal mikroskobu ile 555 nm lazer gücü 20-40 µW görüntü dsred için kullandığımız veya tdtomato ve 488 nm lazer 20-30 µW at GFP (lazer güç amaç arka diyafram açıklığında ölçülen) görüntü için kullanılır. Genellikle kazanç 700-800 GFP ve 850-980 dsred ve tdtomato için skalasında canlı görüntüleme için yüksek ayarlanır. Yüksek kazanç (uzaklık değerleri genellikle 0 ve 15 arasında yatıyordu) dijital ofset artırarak kaldırılır biraz daha fazla arka plan gürültü neden olabilir. Deneyim, MBP_mito_GFP kullanarak bir daha iyi sinyal-gürültü MBP_mito_dsred daha verir.
  12. Select inceden inceye gözden geçirmek hız.
    Not: tarama süresini hızlı bir tarama hızlı ve küçük bir tarama bölgenin çizim en aza indirmek (bkz: 4.10.5 aşağıdaki üzerine gelin). Bir çift yönlü tarama gerçekleştirerek zaman tarama kaydetmek mümkündür. Ancak, bu yoksul görüntü kalitesi nedeniyle önerilmez.
  13. Kümesi sıklığı ve hızlandırılmış kayıt, örneğin yakalama yansımaları her 2 saniyede oligodendrocytes mitokondri görüntüleme için 20 dakika olmak üzere toplam süresi.
    Not: Sıklığı ve süresi nesneleri ilgi hareketliliğini göre ayarlamanız gerekir. Yüksek sıklığı daha ışık lazer numune neden olur, ancak daha hızlı hareketli nesneler de hızlandırılmış videoları (örneğin mitokondri daha sık ve mitokondri içinde daha çok daha yüksek bir hızda hareket nöronlar içinde kısa bir toplam süresi gerektirir 2 Toplam 16 dakika için oligodendrocytes, genellikle her saniye görüntüsü).
  14. Hızlandırılmış kayıt başlatmak.
    Not: Mitokondri odak dışında hareket ve/veya kayıt sırasında görüntülü bölge dışına kayması. Titreşim ve hareketi en aza indirmek için içinde - ayarlayın ve çıkışları Bath ve gerekirse pompa hızını düşürür. Odak genellikle hala küçük değişiklikler gerçekleşir. Böylece, sürekli ekranda görüntüleme sırasında izlenmesi, odak ufak değişiklikler kayıt sırasında ile gereklidir.
  15. z yığını bütün hücre hücre gelecekteki tanımlanması için esir alma ve işlem görüntüsü.
    Not: daha iyi çözünürlük için iğne deliği ve sondaj 1 havadar birimine z-yığınının sıfırlanması.
  16. İsteğe bağlı: günahı miyelin görselleştirmek.
    Not: (sitoplazmik) GFP ile transduced oligodendrocytes içinde miyelin kılıfı genellikle düz çizgiler sitoplazma (sitoplazmik sırtlar), bir birincil işlemi için (bkz: 2 şekil A ve B) bağlı olarak tanımlanabilir. Ancak, GFP ifade çok zayıfsa veya sitoplazmik işaret kullanılmaz, miyelin kılıf confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından burada açıklandığı şekilde görselleştirmek mümkündür.
    1. Yazılım ile lazer uyarma 488 adlı yeni bir ışık yolu ayarlayın nm ve yakalama yayılan ışık aynı dalga boyu, örneğin 470-500 nm.
    2. Ayarlama lazer güç ve miyelin görünene kadar kazanç (örneğe bakın < güçlü sınıfı = "XFig "> şekil 3). Bir LSM 510 Meta mikroskop kullanarak, genellikle (amaç arka diyafram açıklığında ölçülür) 7-12 µW lazer gücünü kullanın.
  17. İsteğe bağlı: dilimleri hazırlanması immunostaining.
      Görüntülü cep immunostaining sonra tanımlanması gerekir Eğer
    1. hücre düşük büyütme resim (10 x) yakalama ve bir ok çizerek yerini görüntü göstermek veya benzer. Algılama hücrenin yardımcı olmak için bu aynı zamanda el ile hücrenin konumunu gösteren tüm dilim çizin önerilir.
    2. Saptamak için 1 saat içinde oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde (PFA) üzerinde shaker içinde dilim.
      Dikkat: PFA zararlıdır. Koruyucu giyim ve sadece havalandırılmış bir mahallede kullanır.
    3. 1:10 PBS sabitleştirici sulandırmak ve başka bir yerde 17 açıklandığı gibi immünhistokimya başlangıç kadar 4 ° C'de bırakın.
      Not: dilimleri seyreltilmiş sabitleştirici birkaç hafta sol rağmen Floresans yavaş yavaş. İmmünhistokimya fiksasyon 10 gün içinde performans önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kültürlü ve yukarıda açıklandığı gibi transduced Organotypic beyin dilimleri kortikal oligodendrocytes mito_dsred ve GFP ifade seyrek bir dağılım gösterdi. Immunostaining Olig2 ve MBP karşı antikorlar ile ifade oligodendrocytes (şekil 1) belirli olduğunu doğruladı.

Canlı görüntüleme için transduced oligodendrocytes (şekil 1 ve şekil 2A) par...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan organotypic kültürler yapmak için De Simoni ve Yu (2006)5tarafından açıklanan Protokolü'nün bir anlam değiştirici yorum18 iletişim kuralıdır. En önemli değişiklikler aşağıda açıklanan olmuştur. Tris arabellek dilimleri dışında da kuluçka viral iletim sırasında yaşama ve hücre orta değiştirerek geliştirir kültür ortamına eklenir. Sterilizasyon yordam konfeti için de değiştirilir. Diğer protokoller konfeti tarafından ısıyla sterilize iken, konfeti kıvırmak iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Biz Linda Hildegard Bergersen ve Magnar Bjørås erişim için laboratuar ve donanımları, plazmid ve virüs üretim için Janelia moleküler biyoloji paylaşılan kaynak personel ve Koen Vervaeke lazer gücü ölçümleri hakkında yardım almak için hücre için teşekkür ederim. Bu eser Norveç sağlığı Derneği, Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi ve mikroskopi ekipman Norbrain tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agaroz Sigma A9539
BD Microlance 19GBD301500Banyo
Bioksit gazıAGA105701
Marka pipet ampulleriSigma-AldrichZ615927Pipet ampulleri
Bunsen brülörü (Sıvı propan brülörü)VWR89038-530
Isıtıcı kontrolörleri için kablo montajıWarner Instruments64-0106 Sıcaklık kontrolörü - termometre parçası
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2
Kapak camı, kare CorningThermo  Fischer Scientific13206778Canlı görüntüleme için banyo altına takmak için. Tutkal veya petrol jölesi ile kapatın.
D-(+)-GlikozSigmaG7021
Hassas forsepsFinescience11063-07Diseksiyon için
Elmas çizici kalemTed Pella, Inc.54463
Tek Kullanımlık Cam Pastör Pipetleri 230 mmVWR612-1702Cam pipetler
Çift kenarlı paslanmaz çelik tıraş bıçağıElektron Mikroskobu Bilimleri# 7200Vibratom için tıraş bıçağı
Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Filtre kağıdı daireleriSchleicher & Schuell300,220PFA
Fun tackLoctite1270884Banyodaki giriş ve çıkışların konumunu bağlamak/ayarlamak için kullanın
El havlusu C-Fold 2Katrin344388
Harp, RC-41 Odası için Düz,Warner Instruments  64-1418Banyoda konfeti tutmak için arp. Organotipik dilimlerle kullanmadan önce ipleri kesin. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, Model 1.2Heto-Holten96004000MLaminer akış başlığı
At serumu, ısıyla etkisizhale getirilmiş Gibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCR Membran, PTFE, MilliporeFHLC0130Konfeti 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratomlu
MEM-Glutamax HEPESTermo  Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Mikro Kaşık Heyman Tip B ElektronMikroskobu Bilimleri62411-BDiseksiyon için keskinleştirilmiş uçlu küçük, yuvarlak spatula
Millex-GP filtre ünitesiMilliporeSLGPM33RAŞırınga filtre ünitesi
Millicell hücre kültürü eki, 30 mmKırlangıçPICM03050Hücre kültürü ekleri
Minipuls 3 Hız Kontrol ModülüGILSONF155001Canlı görüntüleme için peristaltik pompa - Kontrol modülü parçası (iki kanel kafasına bağlayın)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon DeltaYüzey Termo  Fischer Scientific140675Kültür plakası
Nystatin SüspansiyonSigma-AldrichN1638
Objektif W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC Zeiss441452-9900-000 Canlı görüntüleme için kullanılan suya daldırma objektifi. (WD = 2.5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldehit, granülElektron Mikroskobu Bilimleri# 19208
PC-R perfüzyon odasıSiSkiYou  15280000ECanlı görüntüleme banyosu
Penisilin-Streptomisin, sıvıInvitrogen15070-063
Petri kabı 140 mm Heger1075Büyük Petri kabı 
Petri kabı 92x16 mm Sarstedt 82.1473Orta Boy Petri kabı 
Petridish 55x14,2 mmVWR391-0868Küçük Petri
kabı Fosfat tamponlu salin (PBS)SigmaP4417PBS tabletleri
R2 İki Kanallı Başlık GILSONF117800Canlı görüntüleme için peristaltik pompa - İki kanallı kafa kısmı (kontrol modülü gerektirir)
Yuvarlak/Düz Spatula, Paslanmaz ÇelikVWR82027-528Diseksiyon için büyük spatula
Zımpara kağıdıVWRMMMA63119Opsiyonel, kırık cam pipetleri düzeltmek için
Makas,  17,5 cmFinescience14130-17Diseksiyon için büyük makas
Makas, 8,5 Finescience14084-08Diseksiyon için küçük, keskin makas
Tek kenarlı, mücevher bıçağıElektron Mikroskobu Bilimleri# 71972Tek kenarlı tıraş bıçağı
Tek hat içi çözelti ısıtıcısı SH-27BWarner Instruments64-0102Sıcaklık kontrolörü - ısıtıcı parçası
Steritop-GP Filtre ünitesi, 500 ml, 45mmMiliporeSCGPT05RESterilize etmek için filtre çözümler
Süper tutkal hassasLoctite1577386
Cerrahi neşter bıçağı no. 22Swann Morton Ltd.209Yuvarlak neşter bıçağı
Sıcaklık kontrolörü TC324BWarner Instruments64-0100Canlı görüntüleme için sıcaklık kontrolörü (çözelti ısıtıcısı ve kablo montajı gerektirir)
Trizma tabanıSigma T1503
Trizma HClSigmaT3253
Su ceketli inkübatör serisi IIForma Scientific78653-2882İnkübatör
Kuluçka makinesi için filtrasyonu için kullanılan filtre kağıdı

Kaynaklar

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Oligodendrosit MitokondrileriAAV Transd ksiyonuMitokondriyal G r nt lemeMiyelin Temel ProteiniZaman At ml Kay tKonfokal ReflektansViral Vekt r letimiFloresan Protein Ekspresyonu
Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.