Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Nöronlar elektrik izolasyon ve myelinating oligodendrocytes trofik desteğiyle güveniyor. Önemini oligodendrocytes rağmen şu anda nöronlar, eğitim için kullanılan gelişmiş araçlar yalnızca kısmen atılmıştır oligodendrocyte araştırmacılar tarafından. Hücre türüne özgü tarafından viral iletim boyama canlı organel dynamics eğitim için yararlı bir yaklaşımdır. Bu kağıt ile adeno ilişkili virüs (AAV) transkripsiyon kontrolü altında mitokondrial hedeflenen floresan proteinler için gen taşıyan iletim tarafından oligodendrocyte mitokondri organotypic beyin dilimleri içinde görüntülenmesi için bir iletişim kuralı açıklar miyelin temel protein organizatörü. Koronal fare beyin dilimler organotypic yapmak için iletişim kuralı içerir. Bir yordam için hızlandırılmış düşsel mitokondri, sonra arkasından gelir. Bu yöntem diğer organelleri için transfer edilebilir ve organelleri miyelin kılıf içinde çalışmak için özellikle yararlı olabilir. Son olarak, Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından yaşam dilimleri içinde günahı miyelin görselleştirme için hazır bir tekniği tarif. Çekirdek hiçbir ekstra ekipman gerektirir ve canlı görüntüleme sırasında miyelin kılıf tanımlamak yararlı olabilir.
Giriş
Beynin beyaz madde sinir hücresi aksonlar miyelin, oligodendrocytes tarafından kurulan özel bir genişletilmiş plazma zarı sarılı oluşur. Miyelin hızlı ve güvenilir aksiyon potansiyeli yayılması ve myelinated akson uzun vadeli yaşam için gereklidir ve nörolojik disfonksiyon miyelin kaybına neden olabilir. Önemine rağmen oligodendrocytes özelliklerini daha az bilinen neurons ve astrocytes ile karşılaştırılır. Sonuç olarak, daha az araçları oligodendrocytes eğitimi için geliştirilmiştir.
Mitokondri, endoplasmatic retikulum (ER) veya farklı veziküler yapıları organelleri dinamik değişiklikleri zaman içinde eğitim yararlı olabilir gibi hücre org....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
burada açıklanan yordamları Norveçli hayvan araştırma yetkilisi tarafından onaylanmıştır. Tedarikçiler ve Katalog numaraları için sarf malzemeleri ve diğer gerekli belgenin sonundaki malzemeler listede kullanılabilir bağlantı donanımıdır.
1. hazırlık Organotypic dilim
Not: Doğum sonrası gün 7-9 (p7-9), hangi altı-şey kültür tabağı üzerinde bölünmüş 24 organotypic dilimleri verim iki fare pups bu tarifi kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, tüm yordamları steril bir mahallede yapılmalı ve nitril veya lateks eldiven kullanılmalıdır. Yalnızca hücre kültür sınıf malzemeler kullanılmalıdır.
- Basınçlı kap ş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kültürlü ve yukarıda açıklandığı gibi transduced Organotypic beyin dilimleri kortikal oligodendrocytes mito_dsred ve GFP ifade seyrek bir dağılım gösterdi. Immunostaining Olig2 ve MBP karşı antikorlar ile ifade oligodendrocytes (şekil 1) belirli olduğunu doğruladı.
Canlı görüntüleme için transduced oligodendrocytes (şekil 1 ve şekil 2A) par.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan organotypic kültürler yapmak için De Simoni ve Yu (2006)5tarafından açıklanan Protokolü'nün bir anlam değiştirici yorum18 iletişim kuralıdır. En önemli değişiklikler aşağıda açıklanan olmuştur. Tris arabellek dilimleri dışında da kuluçka viral iletim sırasında yaşama ve hücre orta değiştirerek geliştirir kültür ortamına eklenir. Sterilizasyon yordam konfeti için de değiştirilir. Diğer protokoller konfeti tarafından ısıyla sterilize iken, konfeti kıvırmak iç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Teşekkürler
Biz Linda Hildegard Bergersen ve Magnar Bjørås erişim için laboratuar ve donanımları, plazmid ve virüs üretim için Janelia moleküler biyoloji paylaşılan kaynak personel ve Koen Vervaeke lazer gücü ölçümleri hakkında yardım almak için hücre için teşekkür ederim. Bu eser Norveç sağlığı Derneği, Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi ve mikroskopi ekipman Norbrain tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agaroz | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Banyo |
| Bioksit gazı | AGA | 105701 | |
| Marka pipet ampulleri | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipet ampulleri |
| Bunsen brülörü (Sıvı propan brülörü) | VWR | 89038-530 | |
| Isıtıcı kontrolörleri için kablo montajı | Warner Instruments | 64-0106 | Sıcaklık kontrolörü - termometre parçası |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 |
| Kapak camı, kare Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | Canlı görüntüleme için banyo altına takmak için. Tutkal veya petrol jölesi ile kapatın. |
| D-(+)-Glikoz | Sigma | G7021 | |
| Hassas forseps | Finescience | 11063-07 | Diseksiyon için |
| Elmas çizici kalem | Ted Pella, Inc. | 54463 | |
| Tek Kullanımlık Cam Pastör Pipetleri 230 mm | VWR | 612-1702 | Cam pipetler |
| Çift kenarlı paslanmaz çelik tıraş bıçağı | Elektron Mikroskobu Bilimleri | # 7200 | Vibratom için tıraş bıçağı |
| Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filtre kağıdı daireleri | Schleicher & Schuell | 300,220 | PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Banyodaki giriş ve çıkışların konumunu bağlamak/ayarlamak için kullanın |
| El havlusu C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, RC-41 Odası için Düz, | Warner Instruments | 64-1418 | Banyoda konfeti tutmak için arp. Organotipik dilimlerle kullanmadan önce ipleri kesin. 1,5 mm, 13 mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminer akış başlığı |
| At serumu, ısıyla etkisiz | hale getirilmiş Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membran, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Konfeti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratomlu |
| MEM-Glutamax HEPES | Termo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Mikro Kaşık Heyman Tip B Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 62411-B | Diseksiyon için keskinleştirilmiş uçlu küçük, yuvarlak spatula |
| Millex-GP filtre ünitesi | Millipore | SLGPM33RA | Şırınga filtre ünitesi |
| Millicell hücre kültürü eki, 30 mm | Kırlangıç | PICM03050 | Hücre kültürü ekleri |
| Minipuls 3 Hız Kontrol Modülü | GILSON | F155001 | Canlı görüntüleme için peristaltik pompa - Kontrol modülü parçası (iki kanel kafasına bağlayın) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta | Yüzey Termo Fischer Scientific | 140675 | Kültür plakası |
| Nystatin Süspansiyon | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objektif W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Canlı görüntüleme için kullanılan suya daldırma objektifi. (WD = 2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehit, granül | Elektron Mikroskobu Bilimleri | # 19208 | |
| PC-R perfüzyon odası | SiSkiYou | 15280000E | Canlı görüntüleme banyosu |
| Penisilin-Streptomisin, sıvı | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri kabı 140 mm | Heger | 1075 | Büyük Petri kabı |
| Petri kabı 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Orta Boy Petri kabı |
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Küçük Petri |
| kabı Fosfat tamponlu salin (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tabletleri |
| R2 İki Kanallı Başlık | GILSON | F117800 | Canlı görüntüleme için peristaltik pompa - İki kanallı kafa kısmı (kontrol modülü gerektirir) |
| Yuvarlak/Düz Spatula, Paslanmaz Çelik | VWR | 82027-528 | Diseksiyon için büyük spatula |
| Zımpara kağıdı | VWR | MMMA63119 | Opsiyonel, kırık cam pipetleri düzeltmek için |
| Makas, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Diseksiyon için büyük makas |
| Makas, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Diseksiyon için küçük, keskin makas |
| Tek kenarlı, mücevher bıçağı | Elektron Mikroskobu Bilimleri | # 71972 | Tek kenarlı tıraş bıçağı |
| Tek hat içi çözelti ısıtıcısı SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Sıcaklık kontrolörü - ısıtıcı parçası |
| Steritop-GP Filtre ünitesi, 500 ml, 45mm | Milipore | SCGPT05RE | Sterilize etmek için filtre çözümler |
| Süper tutkal hassas | Loctite | 1577386 | |
| Cerrahi neşter bıçağı no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Yuvarlak neşter bıçağı |
| Sıcaklık kontrolörü TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Canlı görüntüleme için sıcaklık kontrolörü (çözelti ısıtıcısı ve kablo montajı gerektirir) |
| Trizma tabanı | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Su ceketli inkübatör serisi II | Forma Scientific | 78653-2882 | İnkübatör |
Kaynaklar
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
