Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

6.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56239

⸱

5 Kasım 2017

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California School of Medicine, Davis

Bu makalede

Özet

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Özet

Floresan mikroskopi ve hücre biyolojisi gelişmeler yakından ilişkili mısınız, gelişmiş ile hücresel olaylar sık sık nasıl bizim anlayış ve dramatik sanattaki önde gelen görselleştirmek için yetenek hücreleri işlev. Geliştirme ve süper çözünürlük mikroskobu kullanılabilirliğini önemli ölçüde genişletmiştir optik çözünürlük sınırları ~ 250-20 nm. Biyologlar artık moleküler etkileşimleri açısından sınırlı kırınım alanı içinde colocalization açıklayan sınırlıdır, daha doğrusu artık bireysel moleküllerin dinamik etkileşimleri görselleştirmek mümkündür. Burada, görselleştirme ve proteinlerin miktar için bir protokol tarafından zemin-devlet tükenmesi mikroskobu sabit hücre görüntüleme için anahat. Biz iki farklı membran proteinlerinin, endoplazmik retikulum translocon, sec61β ve bir plazma zarı lokalize voltaj L tipi Ca2 + kanal (CaV1.2) unsuru örnekler sağlar. Tartışılan belirli mikroskop parametreleri, fiksasyon yöntemleri, fotoğraf geçiş arabellek formülasyonu ve tuzaklar ve görüntü işleme zorlukları vardır.

Giriş

Hücresel sinyal reaksiyonlar hücresel yanıt başlatmak için iç ve dış ortamlar değiştirme çevirmek. Onlar insan fizyolojisi, hormon ve nörotransmitter yayın, kalp atışı, görme, gübreleme ve bilişsel işlev için temel olarak hizmet veren tüm yönlerini düzenleyen. Bu sinyal cascades bozulma patofizyolojik koşulları kanser, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi şeklinde ciddi sonuçlar doğurabilir. On yıllardır, biyolojik ve tıbbi araştırmacılar başarıyla floresan proteinler, sonda ve birincil araç olarak Floresans mikroskobu ile birleştiğinde biyosensörler kesin zamansal ve mekansal organizasyonu bunlar hücresel anlamak için kullanmıştır sinyalleri.

Epifluorescence, confocal, veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi gibi optik teknikleri güçlü onların duyarlılık, hız ve büyük sınırlama ise canlı hücre, Imaging ile uyumluluk vardır onların kırınım-sınırlı çözünürlük, anlam yapıları veya protein kompleksleri 200-250 nm küçük çözümlenemiyor. Teorik ve pratik geliştirme deterministic süper çözünürlük ile (örneğin, uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED1), yapısal aydınlatma mikroskobu (SIM2) veya Stokastik süper çözünürlük (Örneğin , photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM3) veya zemin durumu tükenmesi (GSD4,5)), Floresans mikroskobu yanal ve eksenel çözünürlüğünde genişletmiştir kırınım bariyer için sırayla of nanometre onlarca. Böylece, müfettişler şimdi görselleştirmek ve nasıl protein dinamikleri ve organizasyon çevirir moleküler seviyede işlevine anlamak içineşsiz bir yetenek var.

Bilindiği gibi tek tek molekül dönüş takip zemin durumu tükenmesi mikroskobu (GSDIM) veya sadece GSD kırınım sınırı aynı anda fluorophores4,5yayan sayısını azaltarak kaçınmanızı sağlar. Yüksek enerjili lazer ışık fluorophore etiketli örnek, fotonlar ile elektron bombardımanı ve onlar bir 'spin-flip' geçmesi ve üçlüsü veya 'karanlık-devlet' heyecanlı devlet4girin olasılık artan heyecanlandırmak için kullanılır. Bu etkili bir şekilde yere devlet depletes, dolayısıyla adı 'devlet tükenmesi yer'. Üçlü devlet fluorophores fotonlar yayarlar değil ve örnek dimmer görünür. Ancak, bu fluorophores stochastically zemin durumuna döndürün ve birkaç foton üçlüsü durumuna geri dönmeden önce karaya heyecanlı durum geçişlerini yayan gidebilirsiniz. Daha az fluorophores herhangi bir zamanda verilirken ile bireysel fluorophores fluorophores komşu dağınık şekilde ve geçici ayrı haline gelen foton patlamaları yayılan. Fotonlar patlama hesaplanan centroid hangi lens için kullanılan ışığın dalga boyu sayısal diyafram (NA) bağlı bir yerelleştirme hassasiyetle fluorophore konumla örtüşen bir Gauss fonksiyonu ile uygun olabilir uyarma ve en önemlisi, fluorophore yayılan fotonlar sayısı. Bir GSD yalnızca bir alt kümesini fluorophores aktif olarak herhangi bir zamanda yayar beri görüntüleri binlerce bir tam yerelleştirme harita oluşturmak için birkaç dakika üzerinden toplanan gerekir, kısıtlamasıdır. Yüksek lazer güç gereksinimi ile birlikte uzun satın alma zaman GSD daha iyi yerine canlı örnekleri sabit için uygun olduğu anlamına gelir.

Bu makalede açıklar süper kararlılık mikroskobu düşsel membran ve endoplazmik retikulum (ER) sabit örnekleri hazırlanması-ikamet proteinler (için gerekli sarf malzemeleri ve reaktifler bkz: Malzemeler tablolistesi). Nasıl bu protokolü kolayca boyutu ve L-tipi voltaj Ca2 + kanal (Cav1.2) kardiyak miyositler sarcolemma içinde kümeleme derecesi ölçmek için uyarlanmış veya acil servis hücresel dağılımını görselleştirmenizi kullanılan örnekler, içinde gösterilen. Bu hücresel bileşenleri organizasyonu ve dağıtımı anlama başlatılması, çeviri ve sonuçta birçok Ca2 +işlevini anlama önem-bağımlı sinyal cascades. Örneğin, Cav1.2 kanalları temelde uyarma-kasılma kaplin, belki de en her yerde sinyal cascade memeli hücrelerinde olmakla birlikte reseptör aracılı Ca2 + serbest bırakmak--dan acil servis için önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. yıkama cam Coverslips

  1. örnek işleme, önceki gün temiz #1.5 cam coverslips KOH 1 M çözümü 1 h için sonicating tarafından. Bu coverslips üzerinde mevcut olabilir herhangi bir floresan kirletici kaldırır.
    1. KOH üzerinden coverslips de-iyonize su ile iyice durulayın.
    2. Bir zamanlar KOH içinde temizlenir, coverslips % 70 etanol içinde kullanıma hazır kadar mağaza.

2. Kaplama cam Coverslips

Not: Bu bölümdeki adımlarda, kontaminasyonu önlemek için bir hücre kültür mahallede gerçekleştirilen.

  1. Ve hızla aşırı kaldırmak için alev forseps bireysel bir coverslip % 70 etanol çözümden kaldırmak için kullanın. Coverslips 6-şey plaka yerleştirin. Bir kültür mahallede yanan bir seçenek değil, ısıyla coverslips de-iyonize su ve/veya sterilizasyon UV ışık en az 30 dakika süreyle kültür Hood altında durulama sonra düşünün
  2. Hücre adezyon yardımcı olmak için kat ile steril % 0,01 Poli-L-lizin, oda sıcaklığında 1 h için coverslips.
  3. Poli-L-lizin Aspire edin ve coverslips steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile durulayın. Kuru hava ve yer buzdolabında gece.
  4. Ertesi sabah, coverslips buzdolabından çıkarın ve laminin, 300 µL konsantrasyonu 50 µg/mL, oda sıcaklığında en az 30 dakika için ekleyin. Laminin dikkatle doğrudan coverslip yerleştirilir emin olmak.
    Not: Bu laminin adım COS-7 hücreleri veya HEK293 hücreler için gerekli değildir ancak izole Ventriküler miyositler için gereklidir. Vasküler düz kas hücreleri veya nöronlar uygun gibi diğer Primer hücre daha iyi kollajen veya fibronektin coverslips kaplı.

3. Hücreleri hazırlanması

10 ml Dulbecco 10 cm kültür çanak
  1. kültürlü hücreleri
    1. büyümek COS-7 hücreleri (veya tercih edilen hücre satırında) ' s modifiye kartal orta (DMEM) kültür % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 ile desteklenmiş orta penisilin/streptomisin (PS) çözüm. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO 2 hücrelerin büyümesine.
      2. DMEM medya aspirating ve 5 mL % 0.05 tripsin-EGTA çözeltisi eklenerek 10 cm çanak onları hasat hücreleri % 90 confluency, ulaştığında
    2. . Hücreleri yuvarlak yukarıya ve ayırmak başladığınızda, hemen tripsin ile desteklenmiştir DMEM etkisiz hale getirin.
      1. Kullanım 5 mL serolojik pipet hücreleri yemek kaldırmak için. Kalan hücreleri kaldırmak için birkaç kez orta çanağı üssüne pipette yapışık ve homojen hücreler kültür orta boyunca dağıtmak için.
    3. Plaka hücreleri % 70 confluency transfection için elde etmek için 35 mm kültür yemekleri üzerine. Orta hacmi içinde yemek yapmak taze DMEM/FBS/PS çözüm ile ilâ 2 mL.
    4. Transfect COS-7 hücreleri ile istenen plazmid DNA yapıları (örneğin, sec61β-mCherry plazmid), uygun transfection reaktif kullanarak ve üreticiye göre ' s yönergeleri.
      Not: Protein, hızlı Plazmid ve/veya kullanılan transfection reaktif bağlı olarak 24-48 h sürebilir.
  2. Yetişkin fare ventrikül miyositler
    1. izole yetişkin fare ventrikül miyositler köklü Langendorff perfüzyon yöntem 6 kullanarak. Miyositler elde edilen Pelet orta PS. %2.5 FBS ve % 1 ile desteklenmiş 199 (M199) yeniden askıya alma

4. Hücreleri kaplama

  1. Transfected COS-7 hücreleri
    1. 2 mL 35 mm çanak çözümden DMEM/FBS/PS Aspire edin ve 1 mL Ca 2 + ekleyin-PBS ücretsiz. Bulaşık kuluçka makinesi 2 dakika süreyle hasat hücreleri yemek ilk Ca 2 + tarafından aspirating dönmek-ücretsiz PBS ve 1 mL % 0.05 tripsin-EGTA çözeltisi ekleme.
        Hücreleri başladıktan sonra kadar yuvarlak ve ayırmak, hemen tripsin ile 1 mL ilave DMEM etkisiz hale getirmek
      1. . Yavaşça yukarı ve aşağı transfected hücreler eşit olarak dağıtılmış 2 mL tripsin-EGTA-DMEM süspansiyon emin olmak için birkaç kez pipet.
    2. Plaka transfected COS-7 hücreler uygun bir yoğunluk, Poli-L-lizin kaplı coverslips üzerine tek hücreleri görüntülenmeyecektir ve çanak birim doldurun böylece 2 mL DMEM/FBS/PS ile (örneğin, 90 µL hücre süspansiyon için coverslip Ekle 1.910 µL takıma DMEM eklemek için hücreleri eşit dağıtmak için çanak girdap).
      Not: Hücrelerin sayılması gerekmez ama her yemek için eklenecek hücre hacmi hücreleri confluency bağlı olarak değişir.
    3. Dönüş kaplama hücrelere bağlı kalmak ve kurtarmak izin vermek için hücre kültür kuluçka makinesi gecede hücrelere.
  2. Yetişkin fare ventrikül miyositler
    1. böylece tek tek hücreler görselleştirildiği laminin ve plaka miyositler doğrudan doğruya üstüne uygun bir yoğunluk, kaplamalı coverslips Aspire edin. Bu hücrelerin izolasyonu elde yoğunluğuna göre değişir.
    2. Bir kubbe coverslip ve yer bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO 2 ~ 45 yapışma izin vermek üzere min için hücre süspansiyon dengelemek.

5. Fiksasyon hücre

  1. kuluçka makinesi hücreleri kaldırmak ve dikkatli bir şekilde orta Aspire edin.
    1. Bir kez PBS ile yapışık hücreleri durulayın.
    2. Bireysel uygulama ve antikorlar için en iyi duruma getirilmiş bir sabitleştirici hücrelerle düzeltme.
      Not: bir sabitleştirici seçerken dikkat edilmesi gereken önemli bir örnek, hücresel yapısına korunması Ayrıca antijen ilgi konformasyon değişiklik olduğunu kontrol ettikten süre kriterdir. Bu iletişim kuralı fiksasyon ile % 3 paraformaldehyde/0.1% oxazolidin (PFA/GA) ve % 100 ile fiksasyon amacıyla metanol anlatılan.
  2. Sec61β mCherry ifade transfected COS-7 fiksasyonu PFA/GA hücreleri
    1. 1,9 mL % 16 Mix PFA ve 20 µL % 50 GA ve son hacmi 10 mL yapmak için PBS ekleyin.
    2. Ekleyin 1 mL taze hazırlanmış PFA/GA çözüm her yemeğin hücrelerin ve düzeltme için oda sıcaklığında 10 dk için.
    3. 3 kez PBS ile İngiltere'de yılın/GA ve durulama hücreleri Aspire edin.
    4. 5 kere 5 min için PBS, içeren hücreleri yapıştırılır yıkayın. Bir değiştirici (örneğin, 50 devir / dakika) makul bir hıza ayarlayın tüm çamaşır adımları gerçekleştirmek.
    5. Sonra 1 mL %0.1 kitle/hacim sodyum borhidrür de-iyonize su taze hazırlanmış ile ücretsiz aldehit gruplarını azaltmak.
    6. Durulama hücreleri iki kez daha sonra yıkama 3 kere 5 min her birinin ürettiği ile ücretsiz aldehitler tepki verir zaman alkol ve sodyum borhidrür bütün izlerini kaldırmak için PBS için.
  3. Yetişkin fare ventrikül miyositler fiksasyonu metanol
    1. buz gibi % 100 metanol 1 mL hücrelere dikkatle ekleyin. 6-şey plaka eğilme ve metanol yan duvara yerine doğrudan coverslip üzerine pipette. 6-iyi plakasına geri metanol eşit yıkamak izin vermek için yatay eğimli hücrenin üzerine. -20 ° C'de 5 min için tamir
    2. 3 kez ile PBS sabitleştirici ve durulama hücreleri Aspire edin.
    3. PBS, yapıştırılan hücrelerle bir rotator üzerinde her 5 min için 5 kez yıkayın.

6. Spesifik olmayan bağlama engelleme

  1. blok engelleme çözüm içinde oda sıcaklığında 1 h için (bkz. Tablo reçetesi).
    Not: %3 sığır serum albumin (BSA) veya non-immün serum birincil antikor olarak aynı türlerden dahil non-spesifik antikor bağlama engellemek için çeşitli çözümler kullanılabilir.

7. Algılama

  1. birincil antikor kuluçka
    1. aspiratı engelleme çözüm. Değil yıkamak veya durulama.
    2. Hazırlamak birincil antikor çözüm aşağıdaki gibi (bkz. adım 7.1.5): 10 µg/mL bir konsantrasyon için birincil antikor seyreltik (veya üretici ' s önerilen konsantrasyon) antikor kuluçka çözüm (malzemeleri tablo görmek ). Bu küçük hacimli coverslip üzerinde denge ve dikkatli bir kare plastik parafin filmin üstüne ayarla. Bu antikor küçük hacimli coverslip yaymak için yardımcı olur ve korur buharlaşma karşı.
    3. 6-şey plaka bir nem odasında yerleştirin ve gece buzdolabında kuluçkaya.
    4. Sabah, hücre nem odasından kaldırma, dikkatle parafin film kare coverslip yüzeyinden çıkarmak ve birincil antikor çözüm Aspire edin.
    5. 3 kez ile PBS, durulama sonra 5 kere 5 min için blok çözüm yıkama ile yıkayın (Tablo malzemeleri görmek) üzerinde rotator.
      Not: Aşağıdaki antikorlar bu protokolü kullanır, anti-RFP fare Monoklonal antikor görüntüler için Şekil 2 ' de görüntülenen ve tavşan poliklonal FP1 7 anti-Ca V 1.2 antikor (Prof hediyesi. Johannes cehennem, UC Davis) şekil 3 ' te görüntülenen görüntüleri için. Nem odası açısından dar Kapaklı plastik beslenme çantası kaplı ıslak kağıt havlu ile çalışır. PBS bu protokolü etiketleme özgüllük artırır ve adımları yıkama seyreltilmiş bir engelleme çözüm kullanarak arka plan azaltır ancak adımları, yıkama için kullanılabilir.
  2. İkincil antikor kuluçka
    1. yıkama çözüm Aspire edin ve 200 Birleşik µL ikincil antikor seyreltilmiş çözüm 1:1,000 antikor kuluçka çözümde ekleyin. Bir kare parafin film coverslip üstüne yerleştirin (bkz. adım 7.1.2).
    2. Incubate içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 1 h için.
    3. Aspiratı ikincil antikor ve durulama 3 kez ile PBS.
    4. Yıkama seyreltilmiş engelleme çözüm 5 kere rocker üzerinde 5 min için hücrelerle.
    5. Yıkama 3 kez PBS ile 5 min için.
      Not: Bu protokol Anti-fare Alexa 647 konjuge ikincil antikor ve anti-tavşan Alexa 647 konjuge ikincil antikor Şekil 2 ve şekil 3, sırasıyla açıklar. Tek protein etiketleme için Alexa 647 olduğunu onun yüksek foton sayısı (Yerelleştirme hassas geliştirir) ve düşük iş hacmi (geliştirir zamansal çözünürlük) nedeniyle tercih edilen fluorophore 8. Atto veya Cy-boya, gibi diğer birçok ikincil antikor fluorophore Birleşik seçenekleri mevcuttur. Dempsey vd için başvurun 8 ve Chozinski vd. birkaç fluorophores/boyaları süper kararlılık düşsel uygunluğu kapsamlı değerlendirmeler için 9.

8. Sonrası fiksasyon (isteğe bağlı adım)

  1. seyreltik 50 µL % 50 GA 10 ml % 0.25 GA çözüm elde etmek için PBS. Hücreler bu çözüm oda sıcaklığında 10 min için sonrası düzeltme.
  2. 3 kez bir rotator üzerinde 5 min için PBS ile yıkayın.

9. Depolama örnekleri

  1. gelen ışık görüntüleme kadar korumak için bir alüminyum folyo kaplı kapsayıcısında depolamak örnekleri (4 ° C) buzdolabında.
  2. Örnekleri (en çok birkaç ay) uzun süreli depolanması için PBS içinde 3 mM sodyum azid içeren Bakteriyel büyüme önlemek için mağaza.

10. GSD süper çözünürlük görüntüleme Photoswitching arabellek hazırlık

  1. oksijen atma hazırlamak ' GLOX ' çözüm aşağıdaki gibi:
    1. 1.5 mL microcentrifuge tüp 12.5 µL katalaz (hisse senedi 34 mg/mL), 3.5 mg eklemek glikoz oksidaz ve 0.5 µl 1 M Tris (pH = 8) 49.5 µL PBS için.
    2. Kısaca bileşenleri çözümde geçiyoruz sonra 20,800 x g 3 dk de 4'te santrifüj kapasitesi için girdap ° C.
      Not: oksijen atma eriyik öyle aynı derecede GLOX, ölçüldün photobleaching karşı çıkmak için. GLOX buzdolabında bir hafta kadar tutulmalıdır. Bu her kullanılışında santrifüj yineleyin.
  2. Hazırla photoswitching-inducing thiol çözüm aşağıdaki gibi:
    1. 100 mM β-mercaptoethylamine (MEA) PBS çözümde hazırlamak ve pH pH 8 veya alternatif olarak kullanım β-mercaptoethanol (βME) değiştirebilirsiniz. 1 hafta kadar dondurucuda (-20 ° C) depolamak bölünmemeli MEA çözüm.
  3. Hemen önce görüntüleme, thiol ekleyerek buz üzerinde son anahtarlama arabellek hazırlamak ve bileşenleri birlikte oksijen atma. 500 µL için GLOX-MEA, 5 µL GLOX 50 µL MEA ekleyin (pH = 8) ve 445 µL serum fizyolojik tampon (2.5 mL 1 M Tris pH = 8, 29.22 mg NaCl (10 mM son konsantrasyon), 5 gr glukoz ve 47,5 mL su). Alternatif olarak, GLOX-βME çözüm için 5 µL βME ve 490 µL serum fizyolojik tampon 5 µL GLOX ekleyin.
    1. Buz çözümlerde tutmak ve gerektiğinde örnekleri cam depresyon slaytlarda bağlamak için kullanın.
      Not: Photoswitching siyanür-esaslı boyalar gibi Alexa 647 10 veya xanthene-esaslı boyalar gibi Alexa 568 Thiol içeren eriyik öyle aynı derecede βME ya da bana neden. MEA Alexa 568 veya 2 proteinler ile bir çift etiketleme yaklaşımı kullanmak Alexa 568 ve 647 yansıması olduğunda tercih edilir, ancak βME Alexa 647 ile daha iyi sonuçlar üretir. Arabellek asitleştirme nedeniyle saatlik bir süre içinde bozulacaktır. Bu örnek ortalama foton sayısını bir azalma yol açacaktır. Bunu önlemek için 2-3 h ya da ortalama foton sayısında bir düşüş veya indüklenen photoswitching için geçen süre dikkate değer bir uzantısı görülmektedir Eğer sonra taze photoswitching tampon yapmak tavsiye edilir. Hangi biz henüz test etmedim ama bildirildi sergiler istikrarlı pH seviyeleri için birkaç gün ve çok renkli görüntüleme uygulamaları 11 GLOX daha iyi performans yeni bir görüntüleme arabellek Ox-EA son makalede açıklanan.

11. Örnekleri montaj

  1. Dağı coverslips hücrelerle (bkz: Bölüm 1-9) etiketli depresyon üzerinde slaytlar, 100 µL kullanarak görüntüleme arabellek.
  2. Coverslip hızlı görüntüleme arabellek oksidasyonunu önlemek için silikon yapıştırıcı ile kenarlarını kapatın. Silikon yapıştırıcı tamamen aksi takdirde coverslip tedavi vardır kadar birkaç dakika bekleyelim Imaging zaman kayması.
    Not: βME temas gelirse silikon yapıştırıcı sertleşmesine olacak değil. Silikon yapıştırıcı görüntüleme arabellek iletişim kurmanızı önlemek için coverslip kenarları kuru emin olun.

12. Görüntü alma

  1. Şekil 2 ve şekil 3 ' te kullanılan parametreler görüntüleme listesi için bkz: Tablo 1.
    1. Başlar, seçili fluorophore bağlı olarak örnek aydınlatmak için uygun lazer seçin. Bu protokol için kullanılan SR-GSD sistemi yüksek güçlü lazer ile donatılmıştır (488 nm, 1.4 KW/cm 2; 532 nm, 2,1 KW/cm 2; 561 nm, 2,1 KW/cm 2 642 nm, 2,1 KW/cm 2). Şekil 2 kullanılan 642 nm lazer.
  2. Bir petrol-daldırma objektif lens ile yüksek bir na kullanın Burada kullanılan SR-GSD sistemi bir HC PL APO 160 X ile donatılmıştır / 1,43 NA hedefi.
  3. Uygun dikroik görüntüleme küp açmadı. Bu iletişim kuralı SR-GSD sisteminde 488 HP-T ile donatılmış 532 HP-T, 568 HP-T, 642 HP-T ile emisyon bant geçiren Filtre 505-605 nm, 550-650 nm ve 660-760 nm.
  4. 2D satın alma modunu seçin. Kamera çerçeve transfer modu ve pozlama süresi 10 ms (100 Hz) için ayarlayın. EM kazanç 300'e ayarlayın. Algılama eşik seçin.
    Not: Düşük eşikleri ile yüksek arka plan görüntüleri üretmek. Yüksek eşikli faiz sinyal filtre uygulayabilir. Coverslips sigara transfected hücre veya hücreleri yalnızca ikincil antikor ile inkübe görüntüleme gibi negatif denetimleri temel alan eşik belirlemek.
  5. Oto olay kontrol ve ayarlama olayları görüntüleri 8 başına açın.
  6. GSD-kazanç sekmede piksel boyutu girin (10 ile başlatmak nm veya 20 nm piksel boyut). Emin " çubuk grafik modu " GSD Araçlar sekmesinde resim alma önce yüksek çözünürlüklü görüntü hesaplama seçenekleri altında seçili.
  7. Proteinler plazma zarı, resim, TIRF modu seçin ve penetrasyon derinliği belirlemek için görülme sıklığı açı değiştirme.
  8. Elektron (pompa denir) karanlık durumuna göndermek, lazer yoğunluğu % 100 olarak ayarlarsanız.
  9. Pompalama sırasında tek molekül algılama seçip çerçeve korelasyon 0,20 ne zaman otomatik olarak almaya ayarlayın.
  10. Alımı için ayarla lazer yoğunluğu % 50'ye.
  11. Ayarla edinme kare sayısı için 60.000.
    Not: Araştırmacı bir örnek daha fazla veya daha az çerçeve bundan daha gerektirir bulabilirsiniz. Daha fazla hiçbir olay tespit olduğunda fluorophore photobleaching ve stop Alım gözlem dayalı kare sayısı değiştirmek.
  12. Başlangıç edinme.
    Not: Edinme başında tüm boya molekülleri floresan durumda olan ve karanlık durumuna geçin. Çerçeve korelasyon 0,20 ulaştığında, görüntüleri elde edilebilir başlayacak. Ne zaman daha az 8 olaylar çerçeve başına tespit edilir, 405 lazer fluorophores geçiş için zemin durumuna karanlık devletten teşvik, geçecektir. Ne zaman n bir veri kümesi için görüntüleri elde etme = n hücrelerden x gibi TIRF penetrasyon derinliği, algılama eşiği ve alınan çerçeve sayısı sabit tutulmalıdır y hayvanlar, parametreleri =.

13. Görüntü analizi

  1. protein küme boyutunu ölçmek için kullanın ' parçacıklar analiz ' özelliği ImageJ.
    Not: Daha fazla çözümleme Stokastik optik imar göreli yerelleştirme mikroskobu tabanlı analiz (fırtına-RLA) veya benzer 13 kullanılarak gerçekleştirilebilir.
    1. ImageJ aşağıdaki gibi kullanarak küme ( şekil 3) çözümlemesi:
    2. çözümlenmesi için görüntü dosyasını açın. Bu düşsel bilgisayar yazılımı (Bölüm 12) açıklanan oluşturuldu olarak bir 10 nm çubuk grafik tek molekül yerelleştirme harita olmalıdır.
    3. Parlaklık ve kontrast görüntü görselleştirmek için ayarlayın: görüntü menüsünden seçin ayarlamak, sonra parlaklık ve kontrast. Otomatik seçeneği'ı tıklatın.
    4. 8 bit görüntü türünü değiştirme: görüntü menü sonra türünü seçin ve 8-bit seçin.
    5. Görüntü ölçeğini ayarlayın: analiz menüsünü açın, küme ölçek öğesini tıklatın ve aşağıdaki parametreleri girin: mesafe = 1, mesafe bilinen = 10, 1 piksel = 10 nm.
    6. Edinilmesi için ölçümleri seçmek için analiz menüsünü açın, ayarlama ölçümleri seçin ve alan seçeneğinin yanındaki kutuyu işaretleyin.
    7. Görüntü eşik ayarlayın. Fazla/eksik görüntü menüsü, seçim ayarlamak ve eşik, seçin Aç seçeneðini belirleyin. En yüksek değer 255 ve en düşük değer 1 ve tıkırtı uygulamak taşır.
    8. Parçacıklar, analiz etmek için Çözümle menüsünde Aç, analiz seçen. Piksel birimleri seçin, sonuçları görüntülemek ve özetlemek için bir onay işareti koyun. 4-sonsuza kadar boyutu ayarla (çözünürlük ~ 20 olduğundan nm), çıplak anahatlar seçeneğini belirleyin ve Tamam'ı tıklatın. Bir Özet dosyası-ecek var olmak mahluk hangi ortalama küme boyutu ve görüntü küme sayısı gibi analiz ayrıntılarını içerecektir.
      Not: ne zaman sonuçlar proteinler içinde belirli bir küme sayısı hakkında sayıda yerelleştirilmiş noktası yapma doğrusal olarak proteinler numarası ile correlated değil dikkat edilmelidir. GSD yerelleştirir antikorlar, Birleşik boyalar tarafından epitope floresan etiketten yerinden bir bağlantı hatası sonuçlanan > 10 nm herhangi bir yönde. Ayrıca, poliklonal antikorlar kullandıysanız, birden fazla antikor için tek bir antijen bağlayabilirsiniz ve sorunu daha da, ticari ikincil yıkmak için antikorlar için ortalama olarak, bir fluorophore her zaman eşit değildir bu yüzden boya 3-6 molekülleri Birleşik bir protein. Bağlantı hata bir boya için doğrudan birincil antikor (ikincil ortadan kaldırarak) conjugating veya bir nanobody tabanlı etiketleme şeması 14 kullanarak azaltılmış.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Giriş bölümünde de belirtildiği gibi birçok farklı süper çözünürlük mikroskobu görüntüleme yöntemleri vardır. Bu iletişim kuralı, GSD süper kararlılık düşsel üzerinde duruluyor. Temsili resim ve yerelleştirme haritalar Şekil 2 ve şekil 3' de gösterilmektedir.

Şekil 2 ER protein, mCherry-Sec61β ve işlenmiş yukarıda açıklanan yöntemi kullanar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kırınım sınırını aşan görüntüleme sağlayan teknolojileri son patlama teklif var yeni windows memeli hücre uzay ve zaman içinde sinyal karmaşıklığı içine. Bu teknolojiler fırtına, STED, PALM, GSD, SIM ve onların türevleri (örneğin, dSTORM, FPALM) içerir. Bilim adamları bu teknikleri arkasındaki marifet ışığın kırınım yöneten fizik yasaları tarafından uygulanan sınırlamaları aşmak bize izin verdi. Bu büyük başarı rağmen bu tekniklerin herbirini bir uzlaşma süper çözünürlük elde etmek için yapar ve, gibi kendi sını...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

Bu eser AHA bir hibe için R.E.D. (15SDG25560035) tarafından desteklenmiştir. Yazar Dr Fernando Santana için kullanma-in onun Leica SR GSD 3D mikroskop ve Dr. Johannes cehennem tür FP1 antikor sağlamak için kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
KOHThermo ScientificP250-500Kapak camı
# 1.5 kapak camını temizlemek için 18 x 18 mmMarienfeld Superior0107032)Hücreleri büyütmek/işlemek / görüntülemek için
10x PBSThermo ScientificBP3994Deiyonize su ile 1x'e seyreltin
Poli-L-LizinSigmaP4832kaplamak için hücre yapışmasına yardımcı olur
Sigma114956-81-9Camı kaplamak için hücre yapışmasına yardımcı olur
Orta 199Thermo Scientific11150-059Ventriküler miyosit kültür ortamı
DMEM 11995Gibco11995Hücre kültürü ortamı
Fetal sığır Serumu (FBS)Thermo Scientific10437028Ortamı takviyesi
Penisilin / streptomisinSigmaP4333Medya ek
% 0.05 tripsin-EDTACorning25-052-CLHücre kültürü çözeltisi
Lipofektamin 2000Invitrogen11668-019Geçici transfeksiyon reaktifi
Ca2 + içermeyen PBSGibco1419-144Hücre kültürü
% 100 MetanolThermo Fisher ScientificA414-4Hücre Fiksasyonu
ParaformaldehitElektron Mikroskopi Bilimleri15710Hücre Fiksasyonu
GlutaraldehitSigma AldrichSLBR6504VHücre Fiksasyonu
SEAblockThermo Scientific37527BSA veya diğer engelleme çözümü alternatifleri mevcuttur
Triton-X 100SigmaT8787Hücrelere nüfuz etmek için deterjan
Tavşan anti-CaV1.2 (FP1)HediyeYokAlomone Labs Rb, anti-CaV1.2 (ACC-003)
Fare monoklonal anti-RFPRockland Inc.200-301-379Birincil antikor
Alexa Fluor 647 donket anti-tavşan IgG (H + L)Invitrogen (Thermo Scientific)A31573İkincil antikor
Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG (H + L)İnvitrojen (Thermo Scientific)A11031İkincil antikor
Sodyum azidSigmaS2002Numunelerin uzun süreli depolanması için mikrobiyal büyümeyi önler
KatalazSigmaC40Foto anahtarlama tamponu bileşeni
Glikoz oksidazSigmaG2133Foto anahtarlama tamponu bileşeni
TrisSigmaT6066Fotoanahtarlama tamponu bileşeni
beta-Merkaptoetilamin hidroklorürFisherBP2664100Foto anahtarlama tamponu bileşeni
ve beta;-merkaptoetanolSigma63689Foto anahtarlama tampon bileşeni
NaClFisherS271-3Foto anahtarlama tampon bileşeni
DekstrozFisherD14-212Foto anahtarlama tampon bileşeni
Cam Depresyon slaytlarıNeolab1 – 6293Numuneleri monte etmek için
TwinsilPicodent13001000Kapak camını kapatmak için
sec61β- mCherry plazmidAddgene49155
Leica SR GSD 3D mikroskopLeica
ImageJ
bloğu çözeltisi%20 SEAblock
Birincil antikor inkübasyon çözeltisi%0.5 Triton-X100, %20 SEAblock, PBS İkincil
antikor inkübasyon çözeltisindePBS'de 1:1000
Cam laminini gibi ticari anti-CaV1.2 antikorları mevcuttur.PBS'de yıkama

Kaynaklar

  1. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  2. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  5. Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).
  6. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302(2011).
  7. Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  9. Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
  10. Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
  11. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  12. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  13. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  14. Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
  15. Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
  16. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  17. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  18. Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Temel Durum T kenme MikroskopisiSabitlenmi H cre G r nt lemeTIRF ModuFoto Anahtarlama TamponuOksijen Tutucu zeltiTek Molek l TespitiG r nt KantifikasyonuER T b l Yap sKardiyak Miyosit G r nt leme
Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.