Yöntem makalesi

İnsan serebrospinal sıvı Endopeptidomic analiz için numune hazırlama

DOI:

10.3791/56244

⸱

4 Aralık 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inst. of Neuroscience and Physiology, Dept. of Psychiatry and Neurochemistry, Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, 2Clinical Neurochemistry Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, 3Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) kitle spektrometrik analizi için bir yöntem sunulur. Moleküler ağırlık kesme filtrasyon, Kromatografik ön ayırma, kitle spektrometrik analizi ve peptid kimlik stratejileri sonraki bir arada istihdam ederek, yaklaşık on göre bilinen CSF peptidome genişletmek olası Önceki çalışmalar için.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) tanımlamak için geliştirilmiş bir yöntem açıklanır. Bu amaçla daha önce gelişmiş bir yöntem molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtrasyon üzerinde temel ve kitle spektrometrik analizi bir çevrimdışı yüksek pH ters faz HPLC ön ayırma adım ile kombine edildi.

Salgı içine CSF merkezi sinir sistemi hücreleri tarafından döken molekülleri kaldırılması için ana yoludur. Böylece, merkezi sinir sistemi birçok süreçlerinde değerli bir tanı sıvı işleme bos yansıtılır. CSF 8-9 büyüklük konsantrasyon aralığı span protein içeren karmaşık bir kompozisyon vardır. Proteinler yanı sıra, önceki çalışmalarda de çok sayıda endojen peptidler varlığını göstermiştir. Daha az yoğun protein okudu, bunlar da potansiyel ilgi biyolojik basılı tutarak.

Endojen peptidler MWCO filtrasyon yoluyla CSF protein içeriğinden ayrı kaldık. Protein içeriği çoğunluğu örnekten kaldırarak, okudu numune hacmi ve böylece aynı zamanda endojen peptidler toplam miktarını artırmak mümkündür. Filtrated peptid karışımı karmaşıklığı ters faz (RP) HPLC ön ayırma adım alkali pH önce LC-MS analizi de dahil olmak üzere tarafından ele alındı. Ayırma kombine edildi nerede 60 kesirler 12 havuzlu bir basit birleştirme düzeni ile analiz zaman tüketimi böylece hala büyük ölçüde ortak elüsyon kaçınarak azaltılabilir.

Otomatik peptid kimlik üç farklı peptit/protein kimlik yazılım programları kullanarak ve daha sonra sonuçları birleştirerek gerçekleştirildi. Farklı programlar tamamlayıcı yerine üç arasında üst üste tanımlamaları % 15'den az ile karşılaştırılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik beyin-omurilik sıvısı (bos) içinde şu anda nörodejeneratif hastalıklar araştırma dönüştürme. Alzheimer hastalığı içinde 60 milyon etkileyen en sık görülen nörodejeneratif bozukluğu, insanlar dünya çapında1,2, amiloid beta peptid, protein tau, Mikrotubul sabitleme oluşan bir biyomarker üçlüsü ve bir fosforile tau formu, hastalık yüksek duyarlılık ve özgüllük ile algılayabilir ve tanılama araştırma ölçütünü3' e eklenmiştir. Parkinson hastalığı ve Multipl skleroz, gibi diğer nörodejeneratif hastalıklarda proteomik çalışmalar bazıları şu anda klinik çalışmalar4,5 değerlendirilmesinde altında olan çok sayıda biyomarker adayları belirledik ,6.

Proteinler, CSF endojen peptidler7,8,9,10,11,12bolluğu da içerir. Bölünme ürünleri birçok beyin kaynaklı proteinlerin oluşturan, Bu peptidler de potansiyel olarak önemli hastalık biyolojik bir kaynağı gösterir. İnsan CSF içinde tanımlanan endojen peptidler stok artırmak ve CSF endopeptidomic analizleri klinik çalışmalarda etkinleştirmek için bir yöntem numune hazırlama LC-MS analizi (kısa protokol düzeni şekil 1 ' de dahil edilmiştir için geliştirilmiş ). Yeni yapılan bir çalışmada Bu yöntemde uygulama neredeyse 16400 endojen CSF peptidler havuza alınan CSF örneklerinde belirsiz tanı, birkaç bireylerin bilinen CSF endopeptidome panolarında13genişleyen tanımlaması içinde sonuçlandı. Yöntemi, isteğe bağlı olarak miktar için izobarik etiketleme yaklaşımı ile birlikte kullanılabilir.

Numune hazırlama

Plazma bileşenlerinin (albümin ve immünglobulin) ana kaynağıdır protein seviye CSF, üzerinde kan beyin bariyerini14,15geçen. Onların yüksek bereket düşük bol, beyin kaynaklı örnek bileşenleri tespiti engellemektedir. Endojen peptidler, böylece önemli ölçüde daha büyük bir hacim böylece alt-bol peptidler olarak algılanmasını sağlayan LC-MS çözümleme için kullanılacak CSF peptid ekstresinin izin veren yüksek bol proteinler üzerinden kolayca ayrılabilir.

Burada sunulan iletişim kuralında, molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtrasyon CSF peptidler protein fraksiyonu ayırmak için kullanılan; önceki birkaç içinde kullanılan bir yöntem8,9,10,11,12,16çalışmalar. Filtrasyon adım yüksek pH mobil faz degrade gerçekleştirilen çevrimdışı bir RP HPLC ön ayırma adım izledi. Ana ayrım varlık pH ile tandem, iki RP HPLC adımları uygulayarak, iki adım arasında seçicilik farkı esas olarak değiştirilmiş peptid saklama sonucu olarak farklı peptid şarj Birleşik kaynaklanır. Yüksek pH peptid ön ayırma LC-MS önce asidik şartlar altında uygulanması peptid kimlik17,18artan ve hatta bu amaç için karmaşık biyolojik üstün olmak için etkili kanıtlamıştır örnekleri daha fazla dik ayırma modu19, güçlü kedi-iyon değiştirme (SCX) ve RP20gibi göre. Analiz süresini kısaltmak için bir birleştirme düzeni, hangi hala büyük ölçüde peptidler farklı ortak elüsyon kaçınılması RP HPLC yüksek çözme gücü nedeniyle her 12inci kesir (örneğin, kesirler 1, 13, 25, 37 ve 49), biriktirmenin kullanılıp yapıldı. kesirler LC-MS20,21adım.

Peptid tanımlama

Peptid kimlik peptidomic çalışmalarda proteomik çalışmaların bundan hiçbir enzim bölünme veritabanı aramada belirtilen ve sonuç olarak, kimlik oranları genellikle daha düşük11farklıdır. Bir son çalışmada13 adaptif puanlama kullanarak varsayılan algoritma ilgili yazılım programının puanlama değiştirildiğinde endojen peptidler Sequest ve maskotu ile elde edilen kimlik oranları önemli ölçüde geliştirilmiş gösterdi algoritma süzücü, endojen peptidler için en iyi skor algoritmaları, tryptic peptidler13farklı gösteren. Çalışma, tepeler (BSI) yazılımını kullanarak otomatik peptid de novo üzerinde dayandırılmış kimlik iki parça iyon parmak izi tabanlı arama motorları için tamamlayıcı bulundu ki, önemli ölçüde daha büyük kümesi içinde bir sonucu tespit peptidler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda açıklanan protokol nerede endojen peptidler büyük miktarda insan CSF15dakika içinde tespit edildi bir önceki çalışmada kullanılan rafine bir sürümüdür. Özgün iletişim kuralını guncellemeleri CSF kimyasal ön arıtma için küçük değişiklikler yanı sıra optimizasyonu çevrimdışı yüksek pH RP HPLC ön ayırma için kullanılan geçişin içerir.

Etik kaygılar

İsveçli hasta ve kontrol malzemelerin tüm çalışmalar etik komiteleri tarafından onaylanmış olan: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). Amsterdam demans kohort CSF örnekleri ve ulusal hastanede toplanan Nöroloji ve Nöroşirürji, Londra için örnekleri tüm katılan hastaların yazılı onayı ve bölgesel etik Komiteler onayı ile araştırma için kullanılmıştır. Burada esas olarak kullanılan malzeme sol-yere CSF tanı amacıyla alınan örnekler üzerinden oluşuyordu ve çalışmalarımız dahil önce de-belirlendi. Geri herhangi bir bireysel donör veya bağış grubu örnek takip hiçbir olasılığı vardır.

1. insan beyin-omurilik sıvısı (bos) çıkarımı:

  1. Lomber ponksiyon (gerçekleştirilmesi gerekir eğitimli bir doktor tarafından) aracılığıyla CSF ayıklamak bir standart iletişim kuralı22kullanarak.
  2. Hücre artıkları ve çözünür olmayan diğer malzeme Santrifüjü 2500 x g 20 dk için de çıkarın.
  3. Kan kirlenme ponksiyon kanama sonucu gösteriyor olabilir renk değişikliği için CSF örnekleri kontrol edin. Kan ve proteaz varlığını önemli ölçüde daha yüksek protein konsantrasyonu analitik sonuçlar büyük ölçüde etkileyebilir.

2. ön tedavisinde CSF (1,5 mL numune hacmi, hiçbir miktar):

  1. CSF aliquots oda sıcaklığında (RT) 1,5 mL çözülme, 10 mL polipropilen borular için içeriği aktarmak ve 1 M Triethylammonium bikarbonat (TEAB) 80 µL arabelleğe alma Aracısı olarak ekleyin.
  2. 0.65 mL 8 M guanidinium hidroklorür (GdnHCl) eklemek (etkin konsantrasyon GdnHCl: 2.4 M) ve girdap RT 10 dk, yavaşça.
    Not: Chaotropic aracı, GdnHCl, hem solvent viskozite etkiler ve enerjik elverişli23olmak unfolding protein sonuçları polipeptid zinciri ile etkileşim kurar. Bu nedenle, GdnHCl protein toplamları çözülür ve endojen peptidler kurtarılması sırasında sonraki filtrasyon artar.
  3. Sulu, 200 mm 60 µL eklemek tris(2-carboxyethyl) fosfamin hidroklorür (TCEP) (etkin konsantrasyon TCEP: 6 mM) ve sistein disulphides azaltmak 1 h 55 ° C'de kuluçkaya.
  4. 400 mM iodoacetamide (IAA) 35 µL ekleyin (etkin konsantrasyon IAA: 4 mM) ve RT karanlıkta katıldı alkylate 30 dk için kuluçkaya. Bir alkil grubu eklenmesi sistein kalıntıları kendiliğinden yeni disülfür köprü herhangi bir noktada sonraki numune hazırlama sırasında oluşamıyor sağlar.
  5. De-iyonize su ve kısaca MWCO filtrasyon, 5.5 mL toplam örnek hacmi içinde kaynaklanan önce örnek sulandırmak için girdap 3.25 mL ekleyin. Bu adım daha yüksek bir konsantrasyon bazen filtre cihazlardan polimer maddelerin leaching neden gözlemlediği gibi GdnHCl için 1 M aşağıda sulandırmak için hizmet vermektedir.

3. ön tedavisinde CSF (10 x 150 µL numune hacmi, izobarik etiketleme-miktar):

  1. CSF aliquots RT, 10 kişilerden 150 µL çözülme ve daha sonra bireysel 1,5 mL düşük-bağlama mikro santrifüj tüpleri için içeriği aktarmak ve 1 m TEAB 8 µL arabelleğe alma Aracısı olarak ekleyin.
  2. 8 M GdnHCl 65 µL ekleyin (etkin konsantrasyon GdnHCl: 2.4 M) ve girdap RT 10 dk, yavaşça.
  3. Sulu TCEP 200 mm 6 µL ekleyin (etkin konsantrasyon TCEP: 6 mM) ve kuluçka 55 ° c sistein disulphides azaltmak 1 h için.
  4. 3.5 µL 400 mM sulu IAA ekleyin (etkin konsantrasyon IAA: 6 mM) ve RT ve karanlık 30 dk için katıldı alkylate kuluçkaya.
  5. İzobarik etiketleme çantası hazırla (örn., Tandem Mass etiketi 10plex izobarik etiketleme reaktif). RT gereksiz reaktif hidrasyon önlemek, HPLC sınıf Asetonitril (AcN) 41 µL ekleyin ve 5 min için nazik ajitasyon tarafından dağıtılması için açmadan önce ulaşmak izobarik etiketleme-reaktif şişeleri izin.
  6. 30 µL izobarik etiketleme-reaktif çözüm için karşılık gelen örnek aktarmak ve nazik ajitasyon altında RT, 1 h için kuluçkaya. İzobarik etiketleme reaktif Birincil aminler peptid N-termini mevcut yanı sıra lizin artıkları ile tepki verir bir NHS-ester grubu içerir.
  7. 8 µL % 5 hydroxylamine Ekle (etkin konsantrasyon hydroxylamine: %0.16) ve etiketleme tepki gidermek için 20 dk RT yavaşça sallayın. Ayrı olarak etiketli örnekleri birleştirilmek üzere olduğundan, etiketleme tepki söndürülür emin olun. Amin grupları hydroxylamine şeklinde bir bolluk ilavesi, kalan izobarik etiketleme reaktif tepki vermek için izin verilir ve böylece etkisiz hale.
  8. Her biri tek 15 mL polipropilen boru 10 tek tek etiketli örneklerinde içeriklerini birleştirebilirler.
  9. Kombine örnek ve kısa bir süre %12 AcN konsantrasyonu % 3 azaltmak için girdap 6.4 mL de-iyonize su ekleyin ve GdnHCl konsantrasyon için GdnHCl yoğun olarak 1 M aşağıda bazen polimerik maddeleri leaching neden olduğu gözlenmiştir Filtre cihazlardan.

4. moleküler ağırlık kesme filtrasyon

  1. Potansiyel kaldırmak için kirleticiler, durumu MWCO filtreler sulu 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB ve 15 dakika 2500 x g ve RT, centrifuging 10 mL yükleyerek, akışı sayesinde (FT) atın.
  2. Bütün numune hacmi filtresini yüklemek (5 mL etiketli CSF (Adım 2.5) veya 10 mL isobarically etiketli CSF (Adım 3,9)) ve 30 dk 2500 x g ve RT, az terk için akışı aracılığıyla (FT) koleksiyon kapsayıcısında santrifüj kapasitesi. Filtrasyon, peptidler ve küçük proteinler büyük protein ve kalan hücre artıkları ayrılır sonucudur. Bu adımı peptidler proteomik deneylerde oluşturmak için peptidomic proteolitik sindirimi proteinlerin kullanımına eşdeğer olarak görülebilir.
  3. 5 mL 25 mm TEAB (sulu) filtreleri ve 2500 g x, 15 dk santrifüj ve RT, peptidler kurtarılması artırmak için yükleyin.
  4. Girdap (bir sigara etiketli toplam 10 mL veya 15 mL isobarically etiketli örnek), iki önceki adımlardan gelen kombine FTs ve örnek asitleştirme için devam edin.

5. de-Tuzlama ve örnek temizlik katı faz çıkarma tarafından

  1. Filtre uygulanmış örnek adım 4.4 katı faz ayıklama (SPE) önce acidify. Asitleştirme SPE-kartuş durağan faz ile çözünen (peptid) etkileşimi geliştirmek için gerçekleştirilir.
  2. Sigara etiketli örnek için (Cilt 10 mL): 550 µL % 1 Trifluoroacetic asit (TFA) - örnek hacmi ekleyin: %0,05 10.55 mL TFA.
  3. İzobarik etiketli örnek için (Cilt 15 mL): 20 mL %0,1 ekleyin TFA acidify ve 3 ile % AcN konsantrasyonu % 1 - örnek hacmi: %0,066 30 mL TFA.
    Not: TFA de işlevi için peptidler kendilerini yeterince güçlü hidrofobik etkileşiminin tutulacak SPE kartuşun ambalaj malzemesi ile yetenekli tutma artıran bir iyon eşleştirme reaktifi eklenir.
  4. Eğer pH > 3, titre % 20 fosforik asit ile örnek örnek pH olana < 3.
  5. SPE kartuşları tarafından %84 AcN, %0,1 formik asit (FA) ve at ft tekrar bir kez 1 ml ek koşul. Kartuş filtre Klima aksi halde sonraki adımda peptidler birlikte elute istenmeyen maddeler kaldırmak için gereklidir; Ayrıca, Merkezi Klima filtresi geçirgenliği artar.
  6. Buna ek olarak 1 mL 0.1 tarafından SPE kartuş equilibrate % TFA, atmak FT. tekrar bir kez. Filtre son denge adımdan sonra - kuru çalışmaz sağlamak filtre üst kısmında küçük bir ses tutun. Denge kartuş filtre filtre Klima adımından yaptı hidrofobik madde (Asetonitril) kaldırarak peptidler korumak için hazırlamak amacıyla gerçekleştirilir.
  7. Gerekirse bazı çeşitli bölümlerinde tüm numune hacmi (10.55 mL etiketli olmayan örnekleri için veya isobarically etiketli örnekleri için 30 mL), yüklemek ve çalıştırmak içine atık FT izin. Kartuş mermi yükleme örnek arasında kuru çalıştırmayın ve son numune hacmi yüklendikten sonra - filtre üzerine küçük bir ses tutun emin olun.
  8. 1 mL %0.1 geçmek TFA süzgeçleri üzerindeki tuzları ve Kimyasalları kaldırmak ve bir kez FT. tekrar atmak için. Kartuşu her yıkama adımdan sonra - kuru çalışmadığından emin olun sıvı kartuş üstüne küçük bir hacim tutmak.
  9. Yer 1.5 mL düşük bağlama mikro santrifüj kapasitesi Kartuş altında tüpler ve örnek 1 mL % 84 geçirerek elute AcN, % 0,1 SK kartuş üzerinde.
  10. Çözücüler buharlaşma ezelî kuru kadar etkin Isıtma-80 ° C'de depolamak ya da hemen yüksek pH ayırma için devam çalıştırmak bir vakum santrifüj içinde de-tuzlu örnekten kaldırmak.

6. çevrimdışı yüksek pH ters faz HPLC örnek ayırma

  1. Sulu yüksek-pH (YBH) mobil aşamaları hazırlayın:
    YBH arabellek A: Saf su
    YBH arabellek B: %84 AcN
    YBH arabellek C: 25 mM NH4OH
    Arabellek YBH yükleme: 2.5 mM NH4OH, %2 AcN
    Not: YBH yükleme arabellek taşıma çözüm ve örnek arabellek kullanılır
  2. 16 µL arabellek YBH yükleme örnek 20 dk için nazik ajitasyon tarafından yeniden dağıtılması
  3. 96-derin-da tabak Batth vd göre yapılandırılmış bir iç kesir toplayıcının 15 µL örnek bir HPLC sistemi üzerinde yükleyin 20 küçük değişiklikler ile. 100 µL/min bir akışı bir pH-kararlı ayrılık sütun üzerinde (C18 3.5 µm, 2.1 mm x 250 mm) fractionate ve min başına bir kesir bir doğrusal 60 dk degrade toplamak.
  4. Aşağıdaki degrade zaman puan kullanın: t 0 dak, B = % 1, C = = %10; t 4 dk, B = % 1, C = = %10, başlangıç kesir koleksiyonu; t 76 dk, B = % 70, C = = %10; sonunda kesir koleksiyonu; t 76,5 min, B = % 85, C = = %10; t 80 dk, B = % 85, C = = %10; t 80,5 min, B = % 1, C = % 10 ve t = 90 dk, B = % 1, C = = %10.
  5. Böylece 12 kesirler her 6 art arda eklenmiş alt kesir içeren kaynaklanan 12 dk tarafından aralıklı kesirler birleştirerek oluşan bir dairesel düzende 12 kuyu içinde hkr kesirler toplamak.
  6. Çözücü tarafından RT ve 3000 rpm kadar kuru vakum Santrifüjü örnekleri çıkarın ve örnekleri-80 ° c LC-MS analiz önce saklayın.

7. LC-MS

  1. Sulu mobil aşamaları hazırlayın:
    Arabellek A: % 0,1 SK
    Arabellek B: % 0,1 SK, %84 AcN
    Yükleme arabellek: % 0.05 TFA, %2 AcN
    Not: arabellek yük taşıma çözüm, örnek arabellek ve yükleme pompa mobil faz olarak kullanılır.
  2. Her biri 12 kesirler için 20 dk RT titreyerek ve arabellek yükleme 6 µL eklenmesi tarafından yeniden dağıtılması
  3. Yük 5 µL örnek üzerinde tuzak sütun yapılandırmada çalışma bir nano-akış HPLC (tuzak sütun: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å gözenek boyutu, 3 µm partikül büyüklüğü; ayrılık sütun: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å gözenek boyutu, 2 µm parçacık boyutu ve peptid ayrılık 150 nL/dk aşağıdaki degradenin kullanarak akış hızında gerçekleştirmek: t = 0 dak, B = %2; t = 10 dk, B = %2; t = 11 dk, B = %7; t 100 dk, B = % 26; = t = 170 dk, B = %45; t = 175 min, B = %80; t 181 min, B = %2 ve t = 210 min, B = = % 2.
  4. MS HPLC bir nano-ESI arayüzü üzerinden bağlı yüksek çözünürlüklü hibrid Kütle Spektrometre gerçekleştirin. Tam tarama spectra 350-1400 m/z aralığında 120.000 (2.0e5 AGC hedef) çözünürlük ayarı, MS modunda kaydedin.
    1. Kütle Spektrometre veri bağımlı satın alma modunda işletmek, MS/MS spectra en iyi on en yoğun doruklarına m/z > 150 ile ve yoğunluk aralığı 1.0e4-1.0e5 parça iyon analiz için içinde seçin. %60 1 m/zquadrupole yalıtım penceresi, en büyük enjeksiyon zaman 100 ms ve RF lens kullanarak habercisi iyonları yalıtmak.
    2. Bir hariç tutma süresi 15 dinamik dahil etmeme geçerli s ve m/z hoşgörü ±10 ppm. Parçalanma çarpışma daha yüksek enerji ayrılma (PİLGRİM6A) hücreye gerçekleştirmek ve orbitrap bir çözünürlük ayarı 50.000 (5.0e4 AGC hedef değeri), MS/MS satın almalar kaydetmek.

8. peptid tanımlama

  1. Peptid tanımlama için elde edilen .çiğ-dosyalarından kitle spektrometrik analizi aşağıdaki ayarları uygulanıyor proteomik arama motoru için gönderin:
    Not: bizim önceki15, üç arama motorları çalışma; Burada belirtilen ayarları tüm üç arama motorları için aksi belirtilmediği sürece istihdam edildi ve maskot v2.4, Sequest HT ve tepeler v7.5 paralel olarak kullanıldı. Ayarlanabilir ayarları çoğunluğu peptit/protein tanımlama için evrensel ve ilgili ayarları herhangi bir arama motorunda olmalıdır.
    Spektrum seçici:
    Min. habercisi kitle: 350 Da
    Max. öncü kitle: 5. 000'da
    Tarama türü: tam
    Sinyal/gürültü eşik: 1.5
    Sıra veritabanı arama
    Veritabanı: UniProt_SwissProt [version2015_11]
    Taksonomi: Homo sapiens
    Enzim: hiçbiri
    Max. İçkilerimiz cevapsız: 0
    Enstrüman (sadece maskotu): ESI-tuzak
    Min. peptid uzunluğu (sadece SequestHT): 6
    Max. peptid uzunluğu (sadece SequestHT): 144
    Öncü kitle tolerans: 15 ppm
    Parçası kitle tolerans: 0,05 Da
    Statik değişiklikler: Carbamidomethyl (C); [Etiketli Eğer] TMT10plex (N-terim)
    Dinamik değişiklikler: oksidasyon (M); [Etiketli Eğer] TMT10plex (K)
    Peptid spektrumlu maç (PSM) doğrulayıcı
    Süzücü (maskotu ve Sequest HT sadece) veya yem füzyon (sadece tepeler)
    Hedef FDR: 0,01
    Doğrulama dayalı: q-değer

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yöntemi uygulanan ve örnek ön ayırma (tablo 1) getirilmesi önce üç çalışmalar değerlendirildi. İlk çalışma çevrimdışı LC CSF kesirler maldı hedef tabağa tespit için kullanılan ve 730 tanımlanan endojen peptidler11' sonuçlandı. İki aşağıdaki çalışmalarda, izobarik etiketleme istihdam edildi. Öncelikle bir vaka/kontrol içinde çalışma kimlik belgesi ve olası biyolojik CSF endopeptidome ve Proteom karakterizasyonu için aynı anda24ve ikinci çalışma izobarik etik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yüksek-pH RP HPLC ön ayırma adım endojen peptidler kurtarılması için daha önce gelişmiş bir iletişim kuralı için moleküler ağırlık Ultrafiltrasyon11 tarafından getirilmesi göreli örnek karmaşıklığı azaltmak ve böylece bir 5-fold daha büyük için izin belirlenmesi için numune hacmi. Bu, sırayla, peptidler her kesir mevcut alt kümesini konsantrasyonu artar ve böylece düşük bol peptidler algılama olasılığını geliştirilmiş.

Bir kimlik stratejisi için üç proteomik yazılım...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiçbir rakip çıkarları, finansal veya diğer yazarlar arasında bildirilmiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok zeki önder Batth ve meslektaşları kadar ön ayırma yöntemini ayarlama tavsiye için teşekkürler.

Bu eser İsveçli Araştırma Konseyi, Wallström ve Sjöblom Vakfı, silah ve Bertil Stohne Vakfı Stiftelse, Magnus Bergwall Vakfı, Åhlén Vakfı, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för finansman tarafından desteklenen Gamla Tjänarinnor, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, Frimurarestiftelsen ve FoU-Västra Götalandsregionen.

Bu proje için finansman Ana alıcılar Kaj Blennow, Henrik Zetterberg ve Johan Gobom vardı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  1 M Trietilamonyum bikarbonatFluka, Sigma-Aldrich17902-100MLTEAB
ve nbsp; 8 M Guanidinyum hidroklorürSigma-AldrichG7294-100MLGdnHCl
Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorürPierce20490TCEP
İyodoasetamidSIGMAI1149-5GIAA
Hidroksilamin %50 (a/a)Sigma-Aldrich457804-50ML
Asetonitril, Uzak UV, HPLC gradyan sınıfıSigma-Aldrich271004-2LAcN
Formik asitFluka, Sigma-Aldrich 56302-1mL-FFA
Trifloroasetik asitSigma-AldrichT6508-10AMPTFA
Amonyum hidroksit çözeltisiSigma-Aldrich 30501-1L-1MNH4OH
Amicon Ultra-15 Ultracel-30 membranlı Santrifüj Filtre ÜnitesiMerck MilliporeUFC903024MWCO-filtre
Sep-Pak C18, 100 mgSularWAT023590SPE sütunu
Resprep 12 portlu SPE Manifoldu Restek26077Vakum manifoldu
TMT10plex İzobarik Etiket Reaktif SetiThermo Fisher Scientific90110TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC SistemiDionex5200.0356Çevrimiçi numune ayırma
Ultimate 3000 RPLC Hızlı Ayırma İkili SistemiDionexIQLAAAGABHFAPBMBEZÇevrimdışı yüksek pH fraksiyonlama
Orbitrap Fusion Tribrid kütle spektrometresiThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCXÖrnek analizi için kütle spektrometresi
Proteome Discoverer 2.0 Thermo Fisher ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUHProteomics arama platformu
Maskot v2.4Matrix Science - Proteomik arama motoru
Sequest HTTermo - Proteomik arama motoru
ZİRVELER v7.5 Biyoinformatik Çözümler A.Ş.) - Proteomik arama motoru
Beğeni PepMap 100, 75 & m x 2 cm, C18, 100 & gözenek boyutu, 3 ve mikro; m partikül boyutuThermo Fisher Scientific164535Trap kolonu (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 & m x 500 mm, 100Å gözenek boyutu, & nbsp; 2 ve mikro; m parçacık boyutuThermo Fisher Scientific164942Ayırma Kolonu (nano HPLC)
Savant SpeedVac Yüksek Kapasiteli KonsantratörlerThermo Fisher ScientificSC210A-230SpeedVac/Vakum yoğunlaştırıcı
XBridge Peptide BEH C18 Kolon, 130Å, 3.5 &mikro; m, 2.1 mm X 250 mmSu186003566Ayırma Kolonu (mikro HPLC)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
  2. Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
  3. Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
  4. Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
  5. Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
  6. Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
  7. Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
  8. Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
  9. Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
  10. Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
  11. Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555(2012).
  12. Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
  13. Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
  14. Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
  15. Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
  16. Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11(2016).
  17. Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
  18. Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
  19. Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
  20. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  21. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  22. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
  23. Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
  24. Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MWCO FiltrasyonuTers Faz HPLCLC MS AnaliziPeptit n FraksiyonlamaEndojen PeptitlerK tle SpektrometresiPeptit Tan mlama

İlgili makaleler