Method Article

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

DOI:

10.3791/56293

⸱

October 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 2School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 3Department of Infectious Diseases, Monash University, 4University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koroner arter hastalığı (CAD) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen nedenidir. Ateroskleroz, önde gelen CAD neden, doğuştan gelen bağışıklık monosit için büyük arter orta atardamar duvarlarında bulunan yağlı çizgiler olarak adlandırılan yatırılan lipid inflamatuvar sitelerine hicret tarafından başlatılır. Ana patojenik lezyonlar ateroskleroz bu erken aşamada köpük hücreleri veya lipid yüklü makrofajlar oluşturmak için damar göç monosit olgunlaşma özelliğidir. Önemli kanıt romatoid artrit ve HIV yanı sıra genel yaşlanma gibi hastalıkların eşlik eden kronik inflamatuar koşulları ateroskleroz riski artar ve bu riski monosit tarafından öngörülmektedir hipotezi destekler harekete geçirmek. Fare modelleri atherogenesis in vivomonosit rolünü araştırmak için iyi bir platform sağlarken, onlar doğal kolesterol metabolizmasının genetik değişiklik ve normal fare diyetler köklü değişiklik gerektirir ve uygunluğu için sınırlı çalışma insan hastalarının hastalıkların aterojenik etkiler. Bu bize ile tanımlanan hastalık durumlarında bireyler izole monosit aterojenik potansiyelini ölçmek için bir insan vitro model geliştirmek için motive. Şu anda, onlar yalıtım monosit hicret ve köpük hücre oluşumu değerlendirmek o insan vitro modelleri sınırlı hale gelir. Burada biz bir protokol hangi tarif monosit hasta kan izole transmigrate insan endotel hücreleri arasında bir tip 1 kollajen Matrix'e ve eksojen lipid içinde köpük hücre içine olgun için onların eğilimi ölçülür. Protokol insan monosit HIV enfeksiyonu olan bireyler ve yaşlı bulaşmamış HIV bireyler saf kullanımı için doğrulandı. Bu model çok yönlü ve her iki mikroskobu kullanılarak değerlendirilecek monosit hicret ve köpük hücre oluşumu sağlar veya aterojenik faktörlerin değerlendirilmesi izin yanı sıra Akış Sitometresi serum veya plazma göstermek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monosit hicret tromboz, kontur ve miyokard infarktüsü yol açabilecek aterosklerotik plak gelişiminde çok önemli bir adımdır. Yağlı çizgiler, nerede yatırılan lipid endotel harekete geçirmek katkıda bulunur ve iltihap1yerelleştirilmiş büyük arter için ortamda genellikle mevcut düşük salınım kan akımı sitelerinde üzerinden aterosklerotik plaklar gelişir. Monosit monosit kemotaktik protein (örneğin CCL2) üzerinden yağlı çizgiler bulunan endotel hücrelere işe ve intima2' ye transmigrate. Hicret, monosit köpük hücrede lipit alımı, lipit sentezi, aşağı-kolesterol sızma düzenlenmesi veya yukarıdaki faktörlerin birleşimi sonucu olarak adlandırılan aterojenik, lipid yüklü makrofajlar oluşabilir. Monosit da dolaşımda bulunan lipidler birikir ve muhtemelen hücre köpük hücre oluşumu3,4için predispozan bir 'köpüklü' fenotip var. Köpük hücreleri yağlı çizgiler ve aşamasındaki aterosklerotik plaklar belirleyici özelliği vardır ve onların oluşumu lipid ve inflamatuar aracılar5tarafından etkilenir. Alternatif olarak, monosit tersine çevirmek için yeteneğine sahip arterin intima ve damar sağlığını korumak için oyunculuk böylece lipid kaldırma kan dolaşımına6, içine transmigrate.

Monosit için eğilimi belirlemede damar endotel arasında transmigrate ve form köpük hücreleri intima veya tersine çevirmek için transmigrate, monosit harekete geçirmek artan rolünün anlaşılması için temel bir gereksinimdir ve lipid plak dışarı taşımak aterosklerotik risk. CADs fare modelleri ateroskleroz gibi yağlı çizgi/aterosklerotik plak geliştirme hakkında gerçek zamanlı vivo içinde bilgi elucidating önemlidir. Ancak, bu modeller işleme yetenekleri genellikle böylece diyet (ApoE/Batı tipi beslenme modeli gibi)7,8, köklü değişiklikler ile birleştiğinde bu hayvanların doğal kolesterol bir genetik değişiklik gerektirir, Dolaşımdaki lipid fizyolojik olmayan birikimi inducing hangi sürücü plak gelişim düzeyleri. Bu modeller alaka kolesterol ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri dolaşan artış ile ilişkili olmayan kronik inflamatuar insan koşullara HIV enfeksiyonu gibi sınırlı olabilir. Ayrıca, monosit Biyoloji fareler ve insanlar arasındaki farkları monosit altgrupları ilgili alaka immünolojik sorular test yapmak (ara monosit gibi (CD14++CD16+))9 zor. Bu ara monosit sayar bağımsız olarak kardiyovasküler olaylar10,11tahmin gibi kardiyovasküler hastalık sürüş mekanizmaları okurken önemlidir. Sırayla her iki monosit hicret veya köpük hücre oluşumu izolasyon ölçmek için deneyleri mevcut iken, hiçbir vitro tahlil erken atherogenesis klinik tabur aynı hücrelerden kullanarak hem yönlerini miktarının için doğrulandı. Transwell modelleri sayede hücreler üst odanın içine yüklenir ve genellikle chemoattractant12 ile ortamı içeren bir alt odasına bir gözenekli plastik bariyer veya hücre monolayer arasında transmigrate tarihinde bir Boyden iki-odası sistemi kullanmak , 13. lökosit hicret analiz etmek için yaygın olarak kullanılan iken, bu modeller genellikle transmigrated hücreleri çözümde, geçiş sonuçlanan intima temsil eden bir katman dahil değil ve köpük hücre ölçüm için izin verme oluşumu veya aynı hücre ters hicret. Bunun tersi olarak, köpük hücre oluşumu modellerinin monosit veya hücre oluşumu14köpük için katkıda bulunmak için bilinen endotel harekete geçirmek etkileri transmigratory kaynaklı değişiklikleri için hesap değil. Ayrıca, bu sistemlerin köpük neden hücre oluşumu makrofajlar üzerinden eksojen oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (oxLDL)15,16, bir anahtar uyarıcı konsantrasyonları doyurarak ek hücre kültür tabakaları bana yapıştırılır köpük hücre oluşumu. Bu modelleri kullanılan LDL kez CuSO4 tedavi17, fizyolojik-ilgili işlemler tarafından bu nedenle, bu modelleri kullanarak çalışmalar fizyolojik önemini sorgulamak okside.

Burada biz monosit hicret ve hangi does değil istemek eksojen oxLDL ilavesi köpük hücre oluşumu aynı hücre quantifies bir tahlil böylece daha iyi modelleme monosit köpük hücre oluşumunda rol tanımlamak. Bu model Aslında Profesör William Muller (Northwestern Üniversitesi, Chicago)18tarafından geliştirildi ve daha fazla ex vivo monosit altında sigara aktive izole atherogenicity değerlendirmek için bizim laboratuvar rafine HIV enfeksiyonu19 gibi hastalıkların eşlik yanı sıra20yaşlanma temel inflamatuar koşulları ile koşulları bireylerin bu ateroskleroz riski ile ilişkilidir. Bu model da sağlamak a peron için köpük hücreleri formu20, endotel etkinleştirme tarafından TNF gibi sitokinler köpük hücre oluşumu14 üzerinde etkisi farklı monosit alt kümeleri eğilimi ile ilgili temel biyolojik sorular cevap için ve monosit derinliği gibi göçmen özelliklerini ve Hicret jelleri19hızını. Ayrıca, monosit hicret ve köpük hücre oluşumu standart mikroskobu kullanarak sayısal, hücre görüntüleme yaşamak, monosit atherogenesis rolünü değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlayan sitometresi ve görüntüleme Akış Sitometresi, bu nedenle, akış.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: tüm deneylerin insan biyolojik örnekler kullanarak Alfred hastane insan Etik Komitesi, Melbourne etik onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm deneyler sınıf II Biyogüvenlik kabinleri içinde belirtilmediği sürece yapıldı. " Prewarmed " bir waterbath 37 ° C'de ısındı reaktifler başvurduğu.

1. hazırlık tip ı fibröz kollajen jeller: gün 1

  1. hazırla polimerli kollajen jelleri sırayla ekleme ve 35.7 mM NaOH karıştırma, 0.71 M199, 4,58 mM Asetik asit ve 1,71 mg/mL x tip ı fibröz kollajen 5 mL polistiren tüp başı olarak Tablo 1.
    Not: hafifçe yukarı ve aşağı 5 kere kollajen oluşumunu durdurmak için pipetting tarafından kollajen iyi karışık olduğundan emin olun ' cepler ' jel karışımı. 4-6 jelleri sınama koşulu mikroskopi için ücret veya test koşul için Akış Sitometresi başına 15 jelleri hazırlayın.
  2. Bir kez bir steril düz oturaklı 96-iyi doku kültürü tabak her kuyunun içine karışık, aliquot 50 µL kollajen jel karışımı iyi. Dış satır ve sütun kullanmayın ama 1 200 µL bunlarla doldurmak x Dubecco ' s fosfat tamponlu tuz (PBS) kuruma jelleri korumak için. Tabak 37 °C/5% CO 2 polimerize kollajen izin vermek 2 h için kuluçkaya.
    Not: tabakları doğrudan bile ısı dağılımı sağlamak için kuluçka temiz metal raflar yerleştirin.
  3. Kuluçka 1 İlave M199 x 150 µL ile jelleri yerleşimi (Tablo malzemeleri görmek) ve 5 gün öncesine kadar kullanım için kuluçkaya.

2. Genişletme saklı HUVEC: gün 1

  1. etiket ve kat 10 cm çapında Petri kabına 1 mL 50 µg/mL fibronektin ile 1 x PBS içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya
    2. Cryopreserved birincil insan göbek
  2. tezcan aliquots damar endotel hücrelerinde (HUVEC, 1.0 x 10 6 hücreler) 10 mL M20.
    Not: HUVEC daha önce açıklanan 21 ve düşük geçiş numaradan kullanılan hazırlanmalıdır (< geçiş 4). HUVEC burada insan koroner arter endotel hücreleri ile yerine.
  3. Resuspend HUVEC 10 mL M20 ve gün 3 medyada yerine aşırı fibronektin ek hücreleri ve kültür için izdiham (yaklaşık 5 gün), önce alıyorum fibronektin kaplı yemek, eklemek.

3. HUVEC Monolayer kollajen jeller üzerinde kültür: gün 5

  1. 5 günde kültür Petri kabına süpernatant alıyorum ve uzakta yıkama ile serum-Alerjik M199 10 mL serum içeren medya tarafından HUVEC ayırmak.
  2. 5 mL % 0.05 tripsin/0,53 EDTA M199 içinde HUVEC için ekleyip 1-2 dakika kadar hücreleri ayırma hafifçe sallayarak oda sıcaklığında kuluçkaya.
  3. Müstakil bir kez hızlı bir şekilde Petri kabına 5 mL M20 ile durulayın ve 10 mL tüp hücrelere içeren medya transfer.
  4. Santrifüj örnekler 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de süpernatant Aspire edin, M20 200 µL hücrelerde resuspend ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  5. 2.0 10 5 hücre/mL M20 x hücrelere resuspend, 96-şey plaka (Adım 1.3) jeller üzerinde M199 Aspire edin ve resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 hücreleri) 100 µL (yukarıdaki adım 1.2) hazırlanan her kollajen jel ekleyin. Daha fazla 3 gün 37 °C/5% CO 2 tabak kültür.
    Not: HUVEC monolayer bütünlüğünü 3 gün sonra gümüş nitrat 22 veya immünhistokimya sıkı kavşak proteinler 23 bu aşamada boyama tarafından teyit. Ek jelleri bu amaçla hazırlanan.

4. HUVEC Monolayer ve yalıtım/monosit hicret için aktivasyonu aktivasyonu: günü 8

  1. doğum günü 8, M20 aspirating tarafından her HUVEC monolayer monosit eklenmesi önce harekete geçirmek jeller overlaying ve 10 ng/mL, 100 µL ekleyerek medya insan TNFα M20 jel başına içinde. 37 °C/5% kuluçkaya CO 2 4 h için
    Not: Sigara-harekete geçirmek HUVEC koşulları denetimleri gerekirse de içerebilir.
  2. Sırasında 4 s HUVEC harekete geçirmek adım, ayrı tutulan monosit manyetik kullanarak PBMCs gelen olumsuz hücrelerin üretici göre seçmek için teknikleri boncuk ' s yönergeleri. 6,5 x 10 6 PBMCs en az bu adımda monosit genellikle PBMCs yaklaşık % 10-15 hesaba güvenilir bir koşul için gerekli 10 5 monosit x 3.0 kurtarmak amacıyla kullanılmalıdır.
    Not: monosit etkinleştirme monosit hicret ve köpük hücre oluşumu önce etkisini değerlendirmek için monosit bu aşamada aktif hale getirebilirsiniz. Monosit (Yani, saklı hasta numuneleri) gerekirse çözdürülen PBMCs ayrılmış olabilir. Monosit alt kümeleri FACS sıralayarak izole jelleri (şekil 1) için ek için hazırlıklı ol.

5. Birincil insan monosit hicret: gün 8

monosit hicret ölçmek, TNFα içeren medyayı çıkarın ve jelleri iki kez 100 µL ile yıkamak için
  1. ekleyip kaldırarak medya M199. Çamaşır, ekleyin 2.0 x 10 taze izole veya çözdürülen ve yıkanmış 5 PBMCs veya 5.0 x 10 4 taze izole monosit cryopreserved veya saf monosit alt kümeleri için 100 µL HUVEC monolayers M20. Monosit ileri hicret jel içine izin vermek için 37 ° C ve % 5 CO 2 1 h için kuluçkaya. 6 kuyular muayene deneysel her koşul için izin vermek en iyisi.
    Not: hicret ve köpük hücre oluşumu Otolog serum etkisini değerlendirmek için ısı inaktive donör serum istenen konsantrasyonu içeren hücreler M20 ile kuluçkaya ve koşulları için havuza alınan insan serumu kontrol ile karşılaştırın. Lökosit monosit dışında bu aşamada eklenebilir. Belirli lipidler/lipid türler (örneğin, HDL, oxHDL) etkisini araştıran, 20-50 µg/mL lipidler içeren serum-Ücretsiz medya ile tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
  2. Sonra ileriye doğru hicret s 1 jelleri prewarmed 1 mm EGTA 1 x PBS içinde 100 µL ile iki kez ve bir kez 100 µL ile yıkayarak sigara transmigrated hücreleri toplamak M199 (aynı santrifüj kapasitesi koşulları), aynı her kuyudan supernatants havuzu oluşturma deneysel durum (genellikle 6 kuyu) buz bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine. 4 ° c, 300 x g 5 min için sigara transmigrated hücreleri santrifüj kapasitesi ve 30 µL 1 x PBS resuspend.
  3. İleri transmigrated hücreleri belirlemek için süpernatant içinde toplanan hücreleri saymak.
  4. İleri transmigrated hücre yüzdesi aşağıdaki gibi belirlenir:
    figure-protocol-1 figure-protocol-2 figure-protocol-3
  5. yıkanmış kapak 100 µL ile transmigrated hücreleri içeren jeller M20 ve bir daha da 48 h. için kuluçkaya
  6. Sonra 48 h, süpernatant toplamak ve yıkama sigara transmigrated hücrelerle iki kez 100 µL 1 mM EGTA/PBS toplama ve süpernatant adım 5.2 olduğu gibi her durum Havuzu, prewarmed.
    Not: Bu hücreler f ters transmigrated hücre fenotip test edilebilirollowing standart Akış Sitometresi protokolleri boyama.
  7. Hücreleri 4 ° c, 300 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve 30 µL 1 x PBS hücrelerde resuspend. Say hücreleri ve trypan mavi boyama yoluyla canlılık belirlemek.
  8. Aşağıdaki denklemi kullanarak ters transmigrated hücreleri yüzdesini belirlemek:
    figure-protocol-4
    Not: olası ileri hicret olduğu gibi ileri transmigrated hücre toplam sayısı ters hicret daha doğru bir göstergesi verir için muhasebe olacak % 100.
  9. Her şey için 100 µL % 2 formaldehit (son konsantrasyonu) ekleyerek jelleri mikroskobu göre analiz düzeltmek için kapak levha alüminyum folyo ve analiz kadar 4 ° C'de depolayın. Akış Sitometresi için bu aşamada hücreleri tamir etmeyin. Aşağıda iletişim kuralları mikroskobu (Bölüm 6) veya Akış Sitometresi (Bölüm 7) çözümlemesi için bkz:.
    Uyarı: Toksik ve aşındırıcı formaldehit; kişisel koruyucu donanım (PPE) kullanın. Formaldehit eklerken bakım alınmalıdır, ancak, bu adım bir duman başlıklı kullanılan düşük konsantrasyon nedeniyle gerçekleştirilmesi gerekmez.

6. Nefelometri köpük hücreleri ve makrofajlar tarafından mikroskobu (petrol-kırmızı O leke)

  1. formaldehit kaldırmak ve jelleri ile 100 µL % 50 (v/v) metanol 5 min için ve sonra 100 µL % 78 (v/v) metanol 15 dakika süreyle yıkayın
    Not: Laboratuvar tezgah ve değil bir sınıf II Biohazard dolap boyama adımlar gerçekleştirilebilir.
  2. Leke için (bkz. Tablo reçetesi ayrıntılarını) lipid damlacıkları ekleyerek 100 µL % 0,2 taze hazırlanmış olan tarafından (w/v) yağ-kırmızı O oda sıcaklığında 1 h için.
  3. x (v/v) metanol, alıyorum ve süpernatant her yıkama sonra atarak 100 µL ile jelleri 4 yıkama tarafından Kaldır fazla leke kez
  4. İçin distile suda 1:10 Giemsa, 15 dk 100 µL ile oda sıcaklığında seyreltilmiş counterstain.
  5. Giemsa leke Aspire edin ve jelleri bir kez su ile yıka.
  6. Plaka jelleri ayırmak için dışa doğru jel kenarında karşı karşıya eğim ile 21 G iğne kullanarak wells jant.
  7. Jeller mikroskop slaytta, bağlayın çift taraflı bant 2,54 cm x 1,5 cm Şeridi'nde iki delik (6.35 mm çap) yumruk. Standart mikroskop yan teybe düzeltmek ve koruyucu kaplama en baştan çıkarmak.
    1. Ekle bir damla su transferi pipet kullanarak bant delikler için. Cımbız kullanarak, yavaşça jelleri teyp ve boyutu 1,5 cam coverslip ile kapak delik aktarın. Yavaşça teybe uymaları coverslip basın.
  8. 40 X amaç üzerinde ters bir mikroskop kullanarak fark girişim kontrast parlak alan mikroskobu ile inceleyin.
    1. Bring HUVEC monolayer 40 X odak haline büyütme ve kaydırma ' içine ' makrofaj köpük hücreleri jel tüm derinliği boyunca sayma jel. Üç farklı alanları mümkün kenar etkileri en aza indirmek için jel kenarından benzer mesafelerde bulunan görüntülemek için yineleyin. Bu jel derinliğidir bölgeler sayım arasında tutarlı sağlayacaktır.
      Not: jel hücrelerde Puan edinildi olarak köpük hücreleri (içeren hücreleri tanımlanan > 1/3 olarak petrol-kırmızı O onların sitoplazma lekeli lipid damlacıkları) veya makrofajlar içinde 2 h montaj slaytlarda ( Şekil 2). Köpük hücre oluşumu geçirilen hücrelerin toplam sayısına oranla köpük hücre yüzdesi olarak ifade edilir ve muayene 3 alanları bakış medyan sayar koşul, başına 6 jeller için bu nedenle koşul başına 18 ölçümleri ortancası olarak ifade edilir. Tipik bir deney gelen ham hücre sayısı bir örnek Tablo 2 ' de gösterildiği.
      Not: bir hücre köpük hücre vs makrofaj mikroskobu tarafından sınıflandırma özneldir ve sonuç olarak araştırmacı bağımlı olabilir. Klinik çalışmalarda, uzun bir zaman aralığı içinde deneyler yapıldığı, bu tek bir dedektif tarafından kör gerçekleştirilecek tüm sayım için önemlidir. Köpük hücreleri ve makrofajlar jelleri örnekleri Şekil 2 ' de sağlanan.

7. Transmigrated hücreleri tarafından Akış Sitometresi Analizi

phenotypically köpük hücreleri ve makrofajlar transendothelial geçiş takip karakterize, 37 ° C prewarmed 1 mg/mL collagenase M199 için seyreltilmiş D 100 µL ekleyerek jelleri sindirmek için
  1. Her şey ve 20 dk 37 °C/5% CO 2 için kuluçkaya.
    Not: 96-şey plakaları doğrudan bile ısı dağılımı sağlamak için kuluçka temiz metal raflar yerleştirin.
  2. Kuluçka, 200 µL pipet ucu kullanarak jelleri macerate ve bir daha da 20 dk 37 °C/5% CO 2 için kuluçkaya.
    3. Bir kez tam olarak
  3. sindirilmiş, filtre ve havuzu buza, yer kaplama FACS tüpler sindirilir Çoğalt jelleri 35 µm naylon ile mesh ve yıkama bir kez FACS ile yıkayın (malzemelerin tabloya bakın) 4 ° C'de, 300 x g. Resuspend FACS 100 µL hücrelerde yıkama
  4. Kuluçkaya antikorlar belirli fluorophore Birleşik elde edilen hücrelerle CD45, canlı/ölü hücre işaretçisi ve standart Akış Sitometresi protokolleri kullanarak ilgi yüzey/hücre içi fenotipik veya işlev işaretçileri için.
    Not: Denetim hazırlamak tüpler uygun fluorophores ve IG tazminat boncuk kullanarak tazminat. Ayıklanan hücreleri, ayrıca cytospinning tarafından ayirt mikroskopi için cam slayta toplanabilir. Alternatif olarak, başarılı bir şekilde Akış Sitometresi Imaging üzerinden değerlendirme için bu iletişim kuralını kullanan hücreleri topladık.
  5. Akış Sitometresi kullanarak hücreleri elde etmek ve gerektiği gibi tazminat gerçekleştirmek.
    Not: köpük hücreleri/makrofajlar bireysel nüfus ışık saçılım özelliklerini kullanarak oluşturabilir değil ve büyüklüğü ve şekli oldukça farklı olabilir, liberal ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) gates gösterildiği gibi geçirilen hücrelerin tümünü yakalamak için ayarlamak < güçlü sınıfı "xfig" = > şekil 3A.
  6. Satın alma, Akış Sitometresi yazılım kullanarak veri çözümlemesi gerçekleştirin. Geçirilen hücrelerini tanımlamak için ilk olarak negatif canlı/ölü işaretleyici şekil 3B ' gösterildiği gibi hücre seçin. Ardından, tek hücreli ayrımcılık SSC-alan vs SSC-yükseklik arsa üzerinde gösterilen hücrelerin etrafındaki sıkı bir kapı oluşturarak gerçekleştirmek.
  7. Seçin CD45 + hücreleri ve bu makrofajlar/köpük hücreleri olarak geçirilen hücrelerin FSC/SSC mezarlığına mevcut büyük nüfusu kapısı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monosit hicret miktarının

Monosit şekil 1' de açıklandığı gibi modeline eklenir ve altı jeller her koşul için hazırlanır. Monosit donör başına 6 jeller için (Yani, 5.0 x 104 monosit jel 6 jelleri başına 3.0 105 monosit başına donör x =) son hacmi 600 µL gerekli serum/izole lipid içeren M199 medya için resuspended. Hücreleri (Yani, jel başına 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol monosit hicret ve köpük hücre oluşumu birleştirerek monosit insan klinik tabur, üzerinden atherogenicity değerlendirmek için çok yönlü ve fizyolojik olarak uygun bir yöntem sunar. Bu monosit hicret köpük hücre oluşumu üzerine etkisi dikkate alır ve geriye doğru hicret6 ek olarak içsel ölçüm sağlar gibi bu model köpük hücre oluşumu alternatif yöntemler avantaj sunar eksojen faktörler içinde köpük hücrelerine olgunlaşmaya monosit eğilimi. Ayrıca, biz bu endotel harekete geç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar minnetle Prof. William Muller ve Dr Clare Westhorpe iş geliştirme, önceki yineleme bu modelin içindeki anahtar rolü için kabul. Yazarlar ayrıca monosit sıralama için AMREP Akış Sitometresi çekirdek teşekkür etmek istiyorum alt kümeleri ve Alfred hastane bulaşıcı hastalık birimi klinik araştırma hemşireler bireylerin HIV + bazı çalışmalar için işe alım için. Yazarlar bu çalışmaya katkı Victoria operasyonel altyapı desteği Burnet Enstitüsü tarafından alınan programın minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. TAA bir RMIT Üniversitesi-Şansölye Yardımcısı'nın doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. Bu eser NHMRC proje desteği AJ ve AH 1108792 tarafından desteklenmiştir. TK tarafından desteklenmektedir NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124 verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Jel hazırlama reaktifleri< / güçlü >
NaOHSigma-Aldrich221465-500GH 2 < / sub>0 içinde seyreltilmiş 0.1 M NaOH
10x M199Sigma-AldrichM0650
AcCOOHSigma-Aldrich695092-100MLH 2< / sub>0 Cultrex Sığır Kollajeni içinde seyreltilmiş 20 mM Asetik
asit BenAr-Ge D Sistemleri3442-050-01Tip I Lifli Kollajen
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü
> < güçlü > Hücre kültürü< / güçlü >
M199Yaşam Teknolojileri11150-059Earle tuzları, L-glutamin ve 2,2 g/L Sodyum Bikarbonat içeren M199 ortamı.
100 & ile desteklenmiş ortam; g/mL L-glutamin  ve 100 U / mL penisilin / streptomisin & nbsp;
M20%20 ısıyla inaktive edilmiş havuzlanmış veya donör serumu içeren takviyeli M199.
LDL gibi bireysel lipid türleri M199'a eklenebilir.
HUVECPrimer insan göbek kordonu endotel hücreleri (HUVEC), bilgilendirilmiş onam ve etik onay ile bağışlanan göbek kordonlarından izole edilebilir. İzole edilmiş HUVEC ticari olarak da satın alınabilir.
İnsan koroner arter endotel hücreleri: Primer insan koroner arter endotel hücreleri, bilgilendirilmiş onam ve etik onay ile bağışlanan arterlerden izole edilebilir. İzole edilmiş hücreler ticari olarak da satın alınabilir.
EDTABDH Merck10093.5VEtilendiamintetraasetik asit (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTASigma-AldrichE3889-500GEtilen glikol-bis (β -aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
%0.05 tripsin EDTAGibco25300-054%0.05 tripsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutaminGibco25030-081L-glutamin (200 mM)
Penisilin/streptomisin Gibco15140-122Penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL Penisilin ve 10.000 &mikro; g / mL Streptomisin)
Yeni doğan buzağı serumuGibco16010-142Yeni doğan buzağı serumu: Yeni Zelanda kökenli
FibronektinSigma-AldrichF1056-1MGFibronektin - 50 &; mikro; hazırlanan ve saklanan g/mL alikotlar
PBS (1x)Gibco14200-075Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (10x): Steril H ile 1 kata seyreltin < alt >2< / sub>0
0.1 TNFGibcoPHC3015Rekombinant insan TNF - H20'de sulandırılır ve 10 & mikro; g / mL alikotlar
Düşük yoğunluklu lipoproteinMerck MilliporeLP2-2MGDüşük yoğunluklu lipoprotein (LDL)
Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >güçlü < güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü > Mikroskopi< >
1 veya% 2 formaldehitPolysciences4018steril H20
%50 ve %78 metanol ile seyreltilmiş %1 veya %78 formaldehitAjax Finechem318-2.5L GL%50 veya %78 v/v metanol, H20 ile seyreltilmiş
Yağ Kırmızı O lekesiSigma-AldrichO0625-25G%22 1M NaOH ve %78 (h/h) metanolde 2 mg / mL'ye seyreltin
Mikroskop slaytlarıMikro-CamS41104AMKİkiz buzlu 45 derece zemin kenarı mikroskop slaytları (25 X 76 mm)
Kapak kızaklarıMenzel-Glä serMENCS224015GP22 x 40 mm # 1.5 boyutlu cam kapak kızağı
Çift taraflı bant3M Scotch4011Süper dayanıklı dış montaj bandı (25,4 mm x 1,51 m)
Giemsa lekeMerck Millipore1.09204.0500Giemsa'nın azur eozin metilen mavisi çözeltisi (H < sub> 2 < / sub>0 içinde seyreltik stok 1:10
Delik delgeçtipi tek delikli zımba (6,35 mm delgeç)
Name< / strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong><strong>Comments< / strong>
akış sitometrisi< / strong>
Kollajenaz DRoche Teşhisi11088858001M199 ortamında 1 mg / mL'ye seyreltilmiş Kollajenaz D 
35 ve mikro; m naylon örgü kapaklı polistiren FACS tüplerBD Biosciences35223535 & m naylon örgü kapaklı polistiren FACS tüpleri
Canlı/Ölü Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre lekesiYaşam TeknolojileriL34959Canlı/Ölü Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre lekesi
FACS yıkama1 X PBS-, 2 mM EDTA ve %1 Yeni doğan buzağı serumu
NameCompanyKatalog Numarası Comments
Plasticware
96 kuyulu plakaNunclon167008Delta yüzey düz tabanlı 96 oyuklu plaka
10 cm Petri KabıTPP93100Steril 10 cm Petri kabı
1.5 mL Eppendorf tüpleriEppendorf0030 125.150Eppendorf tüpleri
Transferi pipetSamco Scientific222-20SSteril transfer pipeti (1 mL, büyük ampul)
% ) El

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
  3. Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
  4. Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038(2016).
  5. Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
  6. Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
  7. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  8. Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
  9. Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
  10. Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
  11. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  12. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  13. Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  14. Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
  15. Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
  16. Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
  17. Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
  18. Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
  19. Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
  20. Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
  21. Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
  22. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
  23. Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
  24. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
  25. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  26. Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
  27. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte TransmigrationFoam Cell FormationHuman Endothelial CellsCollagen MatrixFlow CytometryMicroscopy AnalysisOxidized LDLPatient Blood SamplesAtherogenic PotentialCollagen Gel Preparation

Related Articles