Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Özet

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Özet

Yeni antimicrobials ve aşı geliştirilmesi Streptococcus pneumoniae (pnömokok) için çoklu dirençli suşların hızlı artış durdurmak gerekli. Karbonhidrat substrat proteinler (SBPs) protein bazlı aşılar ve yeni antimicrobials geliştirilmesi için uygun hedefler nedeniyle ekstrasellüler onların Yerelleştirme ve pnömokok metabolizması için karbonhidrat alma merkezi temsil etmek, anılan sıraya göre. Burada açıklanan SP0092, pnömokok ve diğer bakteriler diğer karbonhidrat SBPs uzatılabilir kapsamlı bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için entegre bir ayrıştıran protokoldür. Bu yordamı inhibitörleri bu sınıfın proteinlerin yapısı tabanlı tasarımı yardımcı olabilir. Sunulan bu yazının ilk bölümünde termal üst karakter tahlil göre biyokimyasal analiz için kurallarıdır, çok ışık saçılma (MALS) açı ve dışlama Kromatografi (sn), hangi istikrar optimize boyutu ve örnek polimerlerin yönelik kristalizasyon denemeler ve bu yüzden başarı geliştirin. Bu yordamı ikinci bölümü kristalize protein çözümlemek için kullanılan ölçüm verileri için ayarlanabilir dalga boyu anormal kırınım sinkrotron beamline ve veri koleksiyon iletişim kurallarını kullanma SBP kristalleri karakterizasyonu açıklar yapısı.

Giriş

S. pneumoniae (pnömokok) olduğunu asymptomatically neden otitis, septisemi, pnömoni, sepsis normalde steril nişler geçirmek için yeteneği ile insan solunum yolu üst solunum yolları içinde bulunan gram-pozitif bir bakteri ve Menenjit^1,2. Ayrıca, pnömokok enfeksiyonu bir klinik ve ekonomik yük dünya çapında^3,4' e katkıda bulunan topluluk edinilen pnömoni önde gelen nedenidir. Antibiyotik dirençli S. pneumoniae suşları dünya genelinde yayılmış ve yedi valent ve on üç-valent pnömokok protein eşlenik aşı yardımcı oldu rağmen antibiyotik direnci, yedek suşları oranını azaltmak aşı kullanımı ortaya çıkmıştır ve araştırma için artan talepleri pnömokok hastalığı^5,6,7,8için yeni tedavilerin geliştirilmesi içine açmıştır.

Pnömokok ev sahibi bir karbon kaynağı^9,10olarak alınan şeker bağlıdır; Gerçekten de onun alma makine taşıma 32 farklı karbonhidrat^11,12,%1330'u ayırıyor. Bu ithalatçılar en az sekiz ABC-taşıyıcı¹³içerir. ABC Taşıyıcılar hücre dışı SBPs ligand için özgüllük belirleme ve hücre alımı için integral membran taşıyıcı için sunma temel bir rol oynar. Çünkü onlar yüzey proteinleri ve hücresel onların önemli rol SBPs yeni aşılar ve antimicrobials tasarımı için geçerli hedefler temsil eder.

Hedef protein karakterizasyonu ve ligand cepler ve etki alanları arasında esneklik gibi yapısal özellikleri ayrıntılı bir açıklama yararlı bir araç için uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım^14,15sağlar. X-ışını kristalografisi atomik çözünürlük yakın proteinlerin yapısal karakterizasyon için seçim yöntemi, ama kristalizasyon işleminin öngörülemeyen, zaman alıcı ve her zaman başarılı değil. Gelişmiş sistematik yöntemlerle başarı oranı ve örnek kalite ve istikrar önemli faktörlerdir. Kristalizasyon başarı oranını içindeki protein kimyasal özellikleri ve örnek hazırlama yöntemleri tarafından etkilenir. Bunlar etkisini değerlendirildi ve biyokimyasal karakterizasyonu^16,17tarafından haberdar.

Bir başka komplikasyon yapısı tabanlı tasarımı için ele alınması gereken crystallographic faz sorun. Gibi daha fazla protein yapıları kullanılabilir, birçok yapılar homolog yapısı¹⁸gerektirir moleküler değiştirme yöntemi tarafından çözülebilir. SBPs esnek etki alanı yapısı sunmak, moleküler değiştirme de zorlu¹⁹olabilir. Hedef protein için yeterince benzer bir yapısal model kullanılabilir değilse, bir takım teknikler deneysel aşamalı²⁰almak için kullanılabilir. Bunlar arasında tek dalga boyu anormal dağılımı (SAD) yöntemi birincil tekniği ortaya çıkmıştır ve yoğun faz sorun²¹çözmek için kullanılan. ÜZGÜN yönteminin kullanımı daha fazla donanım ve yazılım gibi algılama ve^22,23, phasing için zayıf anormal sinyallerin kullanım izin vermek için veri toplama stratejileri geliştirmeleri ile gelişmiş ²⁴. yapıları oluştururlar, hangi kırınım veri atomik çözünürlükte gerekli, geçmişte şimdi programda uygulanan olarak stereochemical bilgi Örneğin, birleştirerek yararlı olabilir için Ayrıca, doğrudan yöntemlerdeki gelişmeler ARCIMOLDO²⁵. Kristalografi faz problem çözme yöntemleri yararlı bir daha gözden geçirme Taylor²⁶tarafından verilir.

Burada karbonhidrat taşıma SBP, SP0092 S. pneumoniae, karakterizasyonu için ayrıştıran bir protokol biyokimyasal ve yapısal teknikleri (şekil 1) entegre mevcut. Bu adım adım iletişim kuralı hayat tüm Krallık içinde bulunan genel olarak, SBPs üzerinde yapısal çalışmaların başarı oranını artırmak için stratejiler yararlı örnek test olgusu sağlar. Özellikle, protokol hızlı ve etkili bir yöntem çözümde protein en istikrarlı oligomeric durumunu karakterize önemini vurgular ve kristalizasyon deneyler için takip etmek için en iyi tür tanımlamasını sağlar. 500'den fazla SBP yapıları içinde Protein veri Bankası²⁷rapor olsa da, moleküler yedek bir menteşe bölgesi¹⁹tarafından bağlı iki α/β etki alanı doğal esnek yapısı nedeniyle zor olabilir. Böylece, iletişim kuralının ikinci bölümü, üzgün phasing üzgün yöntemiyle ilişkili metal iyonları SBPs ortak yanı sıra selenomethionine birleşme ve selenyum (Se) kullanımı olan phasing için açıklar.

Protokol

Not: sinyal peptid silindi kodlama dizisi standart bir füzyon protokol sonrası pOPINF vektörde klonlanmış; yerli protein Escherichia coli BL21 Rosetta hücrelerdeki bir etiket onun füzyon olarak ifade ^{28 , 29}. değişken etiketli selenomethionine üretici ³⁰ göre standart yöntemleri aşağıdaki ifade edilir. SBP daha önce saflaştırılmış rekombinant ^{31 , 32} açıklanan.

1. biyokimyasal karakterizasyonu

1. termal kayması tahlil
   1. hazırlamak 48 tampon çözeltiler 4.0 arasında değişen pH 9,5 ve NaCl konsantrasyon için 0-0, 5 M ve açıklandığı gibi bir 96-şey plaka 40 µL dağıtmak Tablo 1 ³³.
   2. eklemek için 1-2 mg/mL konsantrasyonu SBP çözümün de 5 her µL.
   3. Eklemek için 20 x için (bkz: Malzemeler tablo) protein flüoresan leke de 5 her µL.
   4. Pipetting tarafından çözümleri karıştırmak, şeffaf yapışkan film kullanarak plaka mühür ve spin 112 x g oda sıcaklığında 2 min için.
   5. Deney gerçek zamanlı bir makinede çalıştırın: 99 ° C ile 10 s ayrı tutma zamanı için 4'ten 3 ° C/dak bir sıcaklık rampa ayarlayın ve floresan her 0,5 ° C uyarma, 483 nm ve emisyon 568, okumak nm.
   6. Analiz için erime sıcaklık (T _m) türevi en az tanımlayan her arabellek durumuna Floresans emisyon eğrileri.
      Not: Bu yordam protein istikrar düzelme yardım için en iyi arabellek çözüm iyi bir göstergesi verir. PH aralığı ve tuz konsantrasyonu yüksek T _m ile arabellek durumuna göre seçim ve gliserol ve 0,5 mM, %2.5 (v/v) eklemek tris(2-carboxyethyl) aşağıdaki adımları (sn-tampon) için arabellek çözüm tanımlamak için fosfamin (TCEP).
2. MALS ve analitik sn
   1. degassed filtrelenmiş su (kullanım geniş moleküler ağırlık 24 mL sütun) ile ambalajlı jel filtrasyon sütunun iki sütunlu cilt yıkama gerçekleştirmek.
   2. Sütun ışık saçılma bulmak-e doğru bağlamak ve termal üst karakter tahlil kararlı sn arabelleğinden sütunla equilibrate.
   3. 5 mg/mL dengelenmiş sn sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine, saflaştırılmış SBP enjekte 100 µL.
   4. Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve molar kütle ve tüm türler için polydispersity dizin edinme analiz yazılımı kullanarak saçılma verileri incelemek.
      Not: bir oligomeric türlere karşılık gelen her zirve için polydispersity kontrol etmek yararlı olduğunu dizin hesaplanan molar kitle ağırlıklı molekülleri (Mw/Mn) sayısına kütle/azı kitle üzerinde ağırlıklı olarak. Polydispersity değeri 1 yakın bir monodispersed pik gösterir.
      Not: Bütün Oligomerizasyonda türlerin tanımladıktan sonra daha yüksek konsantrasyonlarda daha büyük oligomer oluşumu lehine protein konsantrasyonu, bağımlılığını eğitim yararlı gibi.
   5. Yürütmek birden çok analitik sn çalıştırma; artan konsantrasyonları (0.1 - 10 mg/mL) dengelenmiş jel filtrasyon sütuna (kullanım geniş molekül ağırlığı 5 mL sütun), saflaştırılmış SBP 100 µL enjekte ve her zaman bir sütun birim sn-arabelleği akış.
   6. Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve 280 Absorbans Koyulukları çözümlemek için farklı başlangıç protein konsantrasyonları karşılık gelen eğrilerinin nm. Farklı doruklarına göreli yoğunluklarda sabit kalırsa, oligomeric türler arasında arası dönüştürme mevcut değildir. Farklı konsantrasyonlarda göreli Koyulukları içinde çeşididir şekilde protein konsantrasyonu bağlıdır farklı oligomeric türler arasında bir göstergesi.
      Not: Bu karakterizasyonu hangi tür kristalizasyon için daha uygundur tanımlamak için temel adımdır. Gerçekten de, farklı monodispersed tür tanımlanmış bir konsantrasyon bir sabit oligomeric durumda olmaları durumunda kristalize daha yatkındır.

2. Protein hazırlık ve kristalizasyon

1. partiye hazırlık sn
   1. bir tek sütunluk birimi sonra yıkama degassed süzülmüş suyla equilibrate sn-tampon ile (geniş bir Moleküler ağırlığı 120 mL partiye hazırlık ambalajlı jel filtrasyon sütun sütun).
   2. 1-5 mL, 5-50 mg/mL saf SBP dengelenmiş jel filtrasyon sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine enjekte.
   3. Sütun akışı aracılığıyla 1 mL kesirler toplamak.
   4. Bir tek monodisperse zirveye karşılık gelen kesirler havuz; 15 mL aralıklarla filtreleri 1.500 g de örnekte spin ve istenen konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu ölçmek (genellikle SP0092 için 50-100 mg/mL).
2. Kristalizasyon
   1. kristalizasyon deney öncesi kristalizasyon Test üretici tarafından açıklandığı gibi kullanarak en iyi toplama aralığını belirlemek:
      1. besleme 0.5 - 1.0 mL her dört kristalizasyon testi 24-iyi oturan farklı bir rezervuar çözümlerinde kristalizasyon plaka bırakın.
      2. Protein çözüm 1 µL rezervuar çözüm 1 µL ile karıştırılarak kristalizasyon damla hazırlamak, plaka mühür ve oda sıcaklığında en az 1 (bir gecede kuluçka sonra daha güvenilir sonuçlar elde edilen) s için kuluçkaya.
      3. Kontrol damla kalite 10 x büyütme mikroskop kullanarak her yoğunlaşması.
         Not: Test en az üç farklı protein konsantrasyonu: (I) açık kalan damla çoğunu belirtmek protein çok seyreltik kristalizasyon için; (II) damla çoğu ağır çökelti varlığı bir aşırı yüksek konsantrasyon anlamına gelir; ve (III) dengeli bir oluşum açık düþer ve çökelti (Eğer ışık daha iyi) test konsantrasyon kristalizasyon için olumlu olduğunu iyi bir göstergesidir.
   2. 96-şey oturma inis kristalizasyon tabak hazir; her rezervuar iyi ^{34 , 35 ,} farklı ticari kristalizasyon çözeltinin 100 µL dağıtmak ^{36 , 37}.
   3. dağıtmak 100 nL kristalizasyon Robotik sistem kullanarak tüm kristalizasyon damla Wells önceden tanımlanmış konsantrasyonu (Adım 1.1.6) adlı protein örneği.
   Karşılık gelen kristalizasyon
   4. dağıtmak 100 nL farklı baraj gölünün çözümler adım 2.2.3 reçete protein ile karıştırmak için kuyu bırak. Buharlaşma önlemek ve kristalizasyon damla ile havzanın denge etkinleştirmek için kristalizasyon plaka mühür.
   5. Kontrol damla düzenli olarak (başlangıçta her 1-2 günde, daha sonra her hafta) 10 x (en az) kullanarak kristal oluşumu ve büyüme değerlendirmek için büyütme mikroskobu.
      Not: protein kristalizasyon için kullanılan için otomatik görüntüleme sistemi görselleştirme ve yakalama düşüyor.

< p sınıf "j =ove_title "> 3. Kristal karakterizasyonu ve x-ışını veri toplama

1. kristal montaj
   1. hazırlamak cryoprotectant çözüm % 25'i (v/v) gliserol (son konsantrasyonu) ekleyerek (böylece ilk suda % 25'i yerine kristalizasyon durumuna karışımı) ³⁸.
   2. Doldurmak bir köpük dewar sıvı azot ve yer dewar içine uni-Pak örnek muhafaza parçası ile. Sıvı azot sıcaklık için soğumasını bekleyin.
   3. Kes ve mühürleme teyp kristalizasyon plaka nerede kristalleri oluşan açılan kaldır.
   4. Bir damla hedef damla yakın konumlandırılmış bir coverslide üzerine cryoprotectant çözüm 1 µL yerleştirin.
   5. Seçili kristal bir manyetik değnek ^{39 , 40} üzerinde monte edilmiş bir omurga standart üsteki bir naylon cryo-döngü kullanarak cryoprotectant çözüm damla özgün damla--dan transfer.
   6. Hızlı bir şekilde kristal cryoprotectant damla--dan sıvı azot döngüsü uni-Pak örnek sahibi ilk boş pozisyon yerleştirerek, transfer.
   7. İstenen kristalleri hasat ve uni-Pak örnek tutucu içinde depolanan kadar (sızdırmazlık bandı kesme) tekrarlayın.
   8. Yer uni-Pak temel uni-Pak puck değnek kullanarak ve beamline (sıvı azot koşullarda) Pak almak.
      Dikkat: Son derece düşük derece!
   9. Kullanmak cryo-maşa ve Pak dewar yükleme aracı uni yüklemek için-puck(s) beamline örnek değiştirici robot içine dewar. Uni-Pak örnek sahibi örnek döngü sahipleri örnek robotun içine dik bırakarak temel kapak üzerinden ayırmak dewar ve böylece sıvı nitrojeni maruz ve örnek değiştirici robot tarafından erişilmesini.
2. Kristal karakterizasyonu
   Not: hasat kristaller daha sonra bir laboratuvar x-ışını kaynağı'nı kırınım kalitesi için veya bir sinkrotron radyasyon (SR) x-ışını kaynağı ekranlı. Makromoleküllerin kristalografisi (MX) beamlines yapı çözüm için anormal kırınım yararlanmak için ayarlanabilir enerji kaynağı sağlamak. Aşağıdaki bölümde, deneysel yetenekleri doğrultusunda çalışma talimatların elmas ışık kaynağı MX beamlines bir dizi teklif edilir ancak bu yönergeleri de MX beamlines, diğer synchrotrons dünya çapında adapte edilebilir.
   1. İlk adım olarak, onaylamak veya anormal scatterers kristal tanımlamak yararlıdır. Bu uygun bir x-ışını Floresans spektrum kristal üzerinden ölçerek elde edilebilir. İlk beamline x-ışını enerji tüm öğeler genellikle makromoleküllerin kristalleri için beklenen heyecanlandırmak için yüksek ayarlanır emin olun (14 keV veya daha yüksek).
   2. Örnek değiştirici robot tarafından monte edilebilir örnek seçmek için beamline kontrol yazılımı kullanın; döngü otomatik olarak x-ışını ışının içinde ortalanır ve kristal merkezleme beamline kontrol yazılımı kullanarak el ile onaylanabilir.
   3. Kayıt beamline kontrol yazılımı kullanarak bir x-ışını Floresans spektrum: kullanıcı bir çekim hızı seçer ve ölçüm başlatır (floresan/floresan spektrum ayarı, → koş, şekil 2A). Beamline kontrol yazılımı otomatik olarak Floresans dedektörü yerleştirin ve en az olay Floresans dedektörü okunabilir bir sinyal almak için x-ışını akı belirler X-ray konumlandırır. Edinsel spektrum sonra doğal olarak meydana gelen için donatılmış emisyon zirveleri ile otomatik bir biçimde analiz biyolojik öğeler. Bu yordamlar beamline kontrol yazılım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) - GDA (www.opengda.org) Firmamız ve synchrotrons Europe ^{41 , 42} boyunca içinde kullanılabilir.
   Eğer uygun öğeleri tespit
   4. bu anormal kırınım deney için yararlanılabilir, kristal anormal kırınım veri toplama için en uygun dalga boyu belirlemek için bir x-ışını soğurma kenar enerji taraması gerçekleştirin: beamline tarihinde kontrol yazılımı, öğeyi seçin ve tarama başlatmak (floresan/floresan ayarı, inceden inceye gözden geçirmek → Atom adı, → koş, şekil 2B).
      Not: bir tek anormal kırınım deneme için emme kenar zirvesine anormal saçılma en üst düzeye çıkarmak için kullanılır. Deneysel dikkat edilmesi gereken noktalar bir çok dalga boyu anormal kırınım deneyi gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı ⁴³ olmuştur.
   Kristal birim hücre parametreleri, simetri ve kırınım sınırı belirlemek için
   5. salınım yöntemini kullanarak 45 ° aralıklarla üç x-ışını kırınım desen ölçmek (veri toplama/tarama → geçerli, koşmak Şekil 2C). Beamline kontrol yazılımı, salınım açısı ve çekim hızı ve röntgen ışını yüzdesi ayarlamak için yeteneği ile kullanıcıya sunar. Standart kristal tarama için 0.5°, bir çekim hızı 0.5 s ve % 5 x-ışını demeti iletim salınım açısı önerilir. Ölçülen kırınım görüntüleri EDNA boru hattı tarafından otomatik olarak analiz edilir ve stratejileri tam veri kümesi ²² topluluğu için bir dizi dönmek.
3. X-ışını veri toplama
   Not: Kullanıcı standart salınım modu veya Friedel arkadaşları yakın zaman ve x-ışını doz ve yaklaşık aynı emme davranışı ile kayıt altına sağlar ters ışın modu verilerini toplamak üzere seçebilirsiniz anormal farklılıklar daha doğru bir ölçüm sağlar. İkincisi özellikle küçük anormal farklılıklar bekleniyor ve/veya örnekleri radyasyon hassas anormal kırınım deney gerçekleştirirken kullanışlıdır. En iyi veri toplama stratejileri kullanmak için önemli noktalara kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiş ^{22 , 23 , 44 , 45} olmuştur ^{, 46 , 47}.
   1. beamline kontrol yazılımı kullanarak içe aktarma veri koleksiyon parametrelerini sağlayacak strateji program tarafından önerilen:
      ı. ω-dönme ekseninin başlangıç konumunu
      II. Salınım genişliği ω-eksen dönme açısı için her kırınım görüntü
      III. Pozlama süresi her kırınım resim için
      IV. Sayı-in imge (dolaylı olarak toplam ω-eksen döndürme açısını tüm veri toplama için tanımlama) tam veri kümesi için
      aşırı pozlama ve radyasyon zarar görmemesi için x-ışını demetinin zayıflama yüzdesi v.
      Not: bizim kurumu için veri toplama çalışan, toplanan verilerin otomatik işleme için yazılım boru hatları iyi kurulmuş: (i) kırınım veri (dizin oluşturulmuş, tümleşik ve ölçekli) azalır xia2 boru hattı tarafından hangi kullanıcı için yansıma mtz dosyaları üretir aşamalı ve yapı çözüm/arıtma ⁴⁸ için giriş olarak. (ii) ne zaman önemli bir anormal sinyal algılandığında veri çözümlemesi sırasında SHELX kullanarak bir ilk hızlı otomatik yapı çözüm boru hattı (fast_ep) ağır atom altyapı deneysel çözmeye çalışır phasing, aşamalı elektron yoğunluğu harita sağlayan nerede mümkün. Bir ikinci daha kapsamlı yapı çözüm boru hattı otomatik olarak çözmek ve structu inşa girişimleri taahhüt ederkullanarak bağımsız yazılım suites ^{49 , 50 , 51 , 52}; Nerede bu başarılı olmadığı durumlarda, kullanıcı bir ilk model ve elektron yoğunluğu harita ile sağlanacaktır. Bu arıtma tamamlayıp modeli seçim crystallographic yazılım paketleri ile doğrulamak kullanıcı için temel sağlar.

Sonuçlar

Bu tümleşik iletişim kuralı dört ile başarılı olmak için kanıtlanmıştır (iki yayınlandı ve iki yapıları yayımlanmamış) pnömokok bağlayıcı protein hedefler altı karbonhidrat analiz^32,53bugüne kadar. Bu bölümde, biz SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon SBPs yapısal çalışmaların genel rehberlik için temsil edici bir sonucu olarak mevcut.

Sonra SBP SP0092 ifade edilen ve daha önce³²tanımlandığı gibi saf saf protein termal üst karakter tahlil kullanarak arabellek istikrar için analiz edildi: SP0092 sergileyen bir artan T_m pH 6,5 NaCl varlığında 0 - 0.2 M konsantrasyon aralığı (şekil 3A). Bunun ışığında, aşağıdaki adımları için arabellek çözüm olarak tanımlanmıştır: 0,02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, %2.5 (v/v) gliserol, 0,5 mM TCEP. SP0092 farklı Oligomerizasyonda durumları mutlak molar kütlesi tetrameric, trimeric, dimerik ve monomeric türleri için karşılık gelen 187.2, 140.8, 97.0 ve 49,4 kDa, moleküler ağırlık ölçme sn birleştiğinde MALS tarafından ölçüldü () sırasıyla Şekil 3B). Farklı protein dilutions sn profilde analizini artan protein konsantrasyonu, daha büyük reaksiyonlar genellikle kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündüren Oligomerizasyonda tetiklediği saptandı kristalizasyon. Nitekim, saflaştırılmış büyük oligomeric türler kristalizasyon denemeler için yönetmen başarıyla üretilen protein kristalleri tür did değil monomer tamamlayın.

En iyi duruma getirilmiş kristalleri yerli elde edilen ve Se-metiyonin SP0092 türlü etiketli x-ışını kırınım tarafından karakterize. Bu kristaller gelen x-ışını Floresans ölçümü Se beklendiği gibi sadece Se-metiyonin kristalleri için algılandı ise protein, bağlanan Zn için emisyon tepeler her iki durumda da ortaya koydu. Hangi olay x-ışını dalga boyu ilgili x-ışını soğurma kenarlarına Zn veya Se ayarlamak için doğrudan deneysel veri kristallerin anormal sinyal en üst düzeye çıkarmak için mevcut sağlanan x-ışını soğurma taramaları Se ve Zn kenarlarında sonra gerçekleştirilen Sonuç veri (şekil 4A-B) üzerinden elde edilebilir.

Düşük iletim adlı üç kırınım şablonlarını ölçmek sonra tam bir anormal veri kümesi EDNA (şekil 4 c) tarafından önerilen veri toplama stratejisini kullanarak elde edildi. Anormal sinyal mevcut otomatik aşamalı boru hattında alt yapısını belirlemek için beamline tetikler ve elde edilen ilk deneysel aşamalarında dayanan, üreten ilk haritalar ve sonra rafine ve doğrulanmış modelleri (şekil 4 d ).

Özet olarak, olası tehlikelere tekniği öncelikle kristal mevcudiyeti ve kalitesinden ortalanır. Optimizasyon protein kararlılığınızı geliştirmek için arabellek koşulların yanı sıra protein çözümde, birden fazla oligomer tanımlandığında kullanılacak en uygun oligomeric durumunu tanımlaması kristalizasyon başarısızlık riskini azaltabilir sahne. Erken bir aşamada teşhis ilişkili metal iyonları kullanımı istismar yapı çözüm kadar hız ve moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olduğunda protein etiketli selenomethionine gereksiz üretimini önlemek.

Şekil 1. Karbonhidrat SBPs biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için iş akışı diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Kristal karakterizasyonu GDA içinde. (A)GDA beamline kontrol yazılımı x-ışını Floresans denetimi sekmesindeki ekran görüntüsü. (B) GDA x-ışını enerji kenar-tarama denetimi sekmesinde ekran görüntüsü. (C) GDA veri toplama kristal tarama sekmesinde ekran görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. SP0092^39-491biyokimyasal karakterizasyonu. (A)3D-Yüzey grafiği pH bir fonksiyonu ve arabellek çözüm NaCl konsantrasyonu SP0092^39-491 erime sıcaklığı komplo. (B) sn ve MALS sonuçları için SP0092^39-491. Emme 280 nm mavi renkle gösterilir. Farklı Oligomerizasyonda Birleşik molar kitlelerin kırmızıyla gösterilir. Paneli (B)³²değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. SP0092^39-491yapısal karakterizasyonu. (A)ve (B) x-ışını soğurma enerji Zn ve Se kenarına SP0092^39-491 kristalleri için tarama. Zn ve kristalleri içeren Se ölçülen Floresans gösterilen mavi ve mavi, hesaplanan f' ve f "anormal saçılma kesirler are yeşil ve kırmızı, anılan sıraya göre. X-ışını kırınım şablon örnekleri (C) SP0092^39-491 kristalleri toplanan. (D) Cartoon SP0092^39-491 dimer yapısı gösterimi. Bir protomer renkli beyaz ve diğer macenta (artıkları 39-366) ve violet (artıkları 367-491), ve anormal saçılma atomları mavi ve mavi topları Zn ve Se, sırasıyla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

0,1 M sitrik asit pH 4.0

0,1 M sitrik asit pH 4.5

0,1 M fosfat pH 5,0

0,1 M sitrat pH 5.5

0,1 M Bis-tris pH 6

0,1 M ADA pH 6,5

0,1 M BEZLERİ pH 7

0,1 M HEPES pH 7.5

0,1 M Imidazole pH 8.0

0,1 M Tris pH 8,5

0,1 M CHES pH 9

0,1 M CHES pH 9,5

NaCl 0 M

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL

40 μL 40 μL 40 μL NaCl 0.1 M 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL NaCl 0.2 M 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL NaCl 0,5 M 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tablo 1. Termal üst karakter tahlil için arabellek oluşturma.

Tartışma

Bu kağıt, açıklama ve karbonhidrat SBPs proteinler S. pneumoniaesayfasından belirli bir vurgu ile biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için entegre bir iletişim kuralı doğrulama. Yine de, bu diğer SBPs farklı organizmalar üzerinden ve hatta diğer ilgisiz çözünür proteinler analizi için standart bir prosedür olarak kullanılabilir.

Protokol ilk bölümünü protein istikrar ve protein örnekleri hazırlanırken kristalizasyon yararlanan dördüncül yapı biyokimyasal bilgilerini sağlamaya odaklanmıştır. Termal kayması deneyleri bölümünde, biz sadece pH ve bu yordamı genel hükümlerini korumak için NaCl toplama varyasyon tanımlamak. Buna rağmen birçok diğer arabellek şartlar benzer bir şekilde, örneğin, herhangi bir kimyasal bileşik teskin katkı maddesi kullanılan da dahil olmak üzere test edilebilir: özellikle belirli bir SBP bağlamak gerçek ligand(s) T_{artırmada son derece etkili m} bir kaç santigrat derece³¹tarafından. Bazı durumlarda, denaturing eğriler kötü düşük sinyal veya protein toplama veya kısmi elinde tutmasına neden bir yüksek floresan arka plan nedeniyle tanımlanabilir. Bunu önlemek için bir protein: boya titrasyon belirsiz denaturing eğrileri en iyi duruma getirmek için gerçekleştirilebilir. Hiçbir gelişme edindiyseniz, protein kararlılığını iyileştirmek çeşitli katkı maddeleri eleme tavsiye edilir ve uygun ekranları yukarıda açıklanan⁵⁴olmuştur.

Genellikle, çoğu SBPs doğal ortamlarında monomeric, ama burada gösterildiği multimerization kristalizasyon deneylerde kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda oluşabilir, böylece MALS ve SEC tarafından sağlanan Oligomerizasyonda davranış karakterizasyonu kristalizasyon için en uygun istikrarlı monodisperse Oligomerizasyonda durumunu değerlendirmek için gerekli. Bununla birlikte, farklı kimyasallar proteinler Oligomerizasyonda davranışı üzerinde kristalizasyon koşul dahil etkisini tahmin etmek zordur. SN ve MALS muayene protein örneği kapsamlı toplama gösteriyorsa, bu oluşma olasılığını azaltmak için aşağıdaki tavsiye ederiz: taze protein örneği (değil donma çözdürülen) kullanmak ve termal ile gerçekleştirilen sabitleme analiz genişletin shift deneyleri, olası katkı maddeleri ve hafif deterjanlar son bir kaynak olarak toplama en aza indirmek için test. Bu yazıda, bu protokol genel hükümlerini korumak için yüksek üretilen iş seyrek matris ticari kristalizasyon tarama kullanarak kristalizasyon için temel kuralları tanıtacağız. Ancak, yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınım protein kristalleri elde etme kristalizasyon koşulları precipitant konsantrasyonu, pH, kimyasal katkı maddeleri, farklı sıcaklıklarda, ilavesi ile ilgili olarak en iyi duruma getirmek için yinelemeli ince ayar gerekir ve diğer kristal damla ve rezervuar^16,17arasında değişen denge dynamics faktörler.

Protokolünün ikinci parçası üzerinde üzgün phasing için anormal veri edinimi x-ışını kırınım veri koleksiyonu belirli bir odak için en iyi strateji tanımlamak için protein kristalleri karakterizasyonu açıklar. SBPs benzer bir genel yapısı korumak (ve potansiyel olarak kullanılabilir modeller başlangıç olarak yatırılan 3D modellerinden olsa bile), bu Proteinlerin moleküler değiştirme yöntemi tarafından aşamalı her zaman değişkenlik nedeniyle basit değil İkincil yapı elemanları ve bu proteinlerin iç esneklik. Bu nedenle, biz üzgün yöntemi teklif ve bu proteinler zaten özünde metaller veya gerçekten özel bağlama metallerin anormal diffracting öğeleri bir dizi sağlayabilir kristalizasyon arabellek koşullar bağlı olduğunu vurgulamak bir bizim genel iletişim kuralı standart adımda.

Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir standart güdümlü iş akışı yanı sıra yapı belirlenmesi başarı oranını artırmak hızlandırmak için istismar SBPs biyokimyasal ve yapısal özellikleri ayrıntılı açıklamasını sağlayan yordamlar tanımlar SBPs yapısal karakterizasyon genel olarak.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SelenoMetionin Ortamı Tam	Moleküler Boyutlar	MD12-500	L-metiyonin hariç glikoz, vitaminler ve amino asitlerle desteklenmiş sentetik bir M9 minimal ortamına dayanmaktadır. Diğer eşdeğer ürünler, diğer şirketler tarafından ticari olarak temin edilebilir.
MicroAmp Optik 96 Kuyulu plaka	Uygulamalı Biyosistemler	4306737	Uygulamalı Biyosistemler MicroAmp Optik 96 Kuyulu Barkodlu Reaksiyon Plakası, hızlı, verimli PCR amplifikasyonu için eşsiz sıcaklık doğruluğu ve homojenliği sağlamak üzere optimize edilmiştir. 96 oyuklu formatta tek bir sert polipropilen parçasından yapılan bu plaka, Applied Biosystems® 96 Kuyulu Gerçek Zamanlı PCR sistemleri ve termal döngüleyiciler.
SYPRO Turuncu Moleküler	Problar	S6651	SYPRO Turuncu Protein Jel Lekesi, 1D jellerdeki proteinler için hassas, kullanıma hazır bir floresan boyadır. Hidrofobik bölgeler için oldukça evrensel ve köklü bir protein boyası.
MicroAmp Optik Yapışkan film	Uygulamalı Biyosistemler	4311971	Uygulamalı Biyosistemler MicroAmp Optik Yapışkan Film, bir mikroplakaya uygulandığında kuyudan kuyuya kontaminasyon ve numune buharlaşması olasılığını azaltır. Düşük arka plan sağladığı için optik ölçüm için idealdir.
7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Uygulamalı Biyosistemler	4362143	Uygulamalı Biyosistemler 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi, standart 96 kuyulu formatta yüksek hızlı termal döngü sağlayarak kantitatif gerçek zamanlı PCR uygulamaları için çalışma sürenizi önemli ölçüde azaltır ve yaklaşık 30 dakika içinde sonuç verir. Yükseltme Kiti, standart bir 7500 Gerçek Zamanlı PCR Sistemini bir saha servis kurulumu aracılığıyla Hızlı Yapılandırmaya yükseltmek için kullanılabilir. Diğer RT-PCR makinesi kullanılabilir. Eski veri analiz yazılımı için veri aktarımı kolay değil.
Superdex 200 artış 10/300 GL sütunu	GE Sağlık	28990944	Superdex 200 Artış 10/300 GL, küçük ölçekli (mg) hazırlayıcı saflaştırmada boyut dışlama kromatografisinin yanı sıra antikorlar gibi moleküler ağırlıkları 10.000 ile 600.000 arasında olan proteinlerin karakterizasyonu ve analizi için çok yönlü, önceden paketlenmiş bir sütundur. Yüksek çözünürlüklü biyofiziksel teknikler için ideal optimum ayırma.
DAWN HELEOS II	Wyatt		DAWN HELEOS II, çözeltideki makromoleküllerin ve nanopartiküllerin molar kütlesinin ve boyutunun mutlak karakterizasyonu için önde gelen Çok Açılı statik Işık Saçılımı (MALS) dedektörüdür. DAWN, en yüksek hassasiyeti, en geniş moleküler ağırlık, boyut ve konsantrasyon aralığını ve gelişmiş yetenekler için en geniş konfigürasyon seçimini ve isteğe bağlı modülleri sunar. Wyatt dışındaki diğer şirketlerin diğer MALS algılama sistemleri test edilmemiştir, bu nedenle ek geri bildirim sağlanamaz.
Superdex 200 5/150 GL	GE Sağlık	28906561	Superdex 200, biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü, küçük ölçekli hazırlayıcı ve analitik ayrımları için önceden paketlenmiş boyut dışlama kromatografi kolonlarıdır. Superdex 200, moleküler ağırlıkları 10.000 ile 600.000 arasında olan moleküller için bir ayırma aralığına sahiptir. Tepe ayrımı, "artış" versiyonu kadar optimal değildir, ancak bu model standart günlük kullanım için idealdir.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 hazırlık sınıfı, yüksek çözünürlüklü hazırlayıcı jel filtrasyon kromatografisi için tasarlanmış önceden paketlenmiş XK kolonlarıdır.
24 Kuyulu "Büyük" Oturan Damla Kristalizasyon Plakası	MiTeGen	XQ-P-24S-A	24 kuyulu "büyük" kristalizasyon plakası, esas olarak oturarak damla buhar difüzyon teknikleri ile protein kristali taraması ve kristalleşme koşulu optimizasyonu için kullanılır. Oldukça büyük bir rezervuar kuyusuna ve numune kabına sahiptir, bu da manuel kullanımı ve büyük boyutlu protein kristali büyümesini destekler. Ek olarak, düz yüzeyleri şeffaf bant veya lamel ile kolayca kapatılabilir.
PCT Ön Kristalizasyon Testi	Hampton	HR2-140	PCT Ön Kristalizasyon Testi, kristalizasyon taraması için uygun protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır.
96 Kuyulu CrystalQuick	Greiner bio-one	6098xx	Kare kuyulu plakalar, rezervuar başına üç kristalizasyon kuyusuna sahiptir, bu da plaka başına 288 numunenin test edilmesini mümkün kılar. Genellikle sadece ilk tarama için kullanılır, çünkü kare kenarları kristallerin avlanmasını zorlaştırır.
Uni-Puck	Moleküler Boyutlar	MD7-601	Evrensel V1-Puck (Uni-puck), dünya çapındaki otomatik numune montaj sistemlerinin çoğuyla kullanım için bir numune pimi saklama ve nakliye konteyneridir - diğerlerinin yanı sıra ACTOR, SAM ve CATS sistemlerini içerir (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI ve ABD genelinde)
Standart Köpük Dewar	Moleküler Boyutlar	MD7-35	5.7" çap ve 2.8" derinliğinde. 800mL kapasite.
Monte Edilmiş CryoLoop - 20 mikron	Hampton	HR4-955	Monteli CryoLoops. Bu naylon halkalar içi boş, paslanmaz çelik MicroTubes & trade'e bağlanır; kriyokristalografik prosedürler ve X-ışını veri toplama sırasında kristali monte etmek, dondurmak ve sabitlemek için kullanılanlar. Farklı boyutlar mevcuttur ve uzunlukları uyarlanabilir. Oldukça çok yönlü araçlardır.
CryoWand	Moleküler Boyutları	MD7-411
Disk dewar yükleme aleti	Moleküler Boyutlar	MD7-607	Bu alet, tek diskleri ayırmak ve bunları robot dewar'a yüklemek için kullanılır. Teflon boru kısmı ve metal çubuk kısmı olmak üzere iki parçadan oluşur.