Tahlil Transposase erişilebilir yüksek üretilen iş sıralama (ataç-seq) ile birleştiğinde Kromatin için erişilebilir Kromatin ortaya çıkarmak için genom geniş bir yöntemdir. Bu bir adım adım ataç-seq insan lenfosit (Th1/Th2) için en iyi duruma getirilmiş son hesaplama çözümleme moleküler üzerinden iletişim kuralıdır. Bu iletişim kuralı yeni nesil sıralama yöntemleri deneyiminiz olmadan araştırmacılar tarafından kabul edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme
Bu makalede
Özet
Özet
Yüksek işlem hacmi sıralama (ataç-seq) ile Transposase erişilebilir Kromatin için tahlil (erişilebilir) bölgelerinde açık: Kromatin tanımlanması için kullanılan bir yöntemdir. Bu bölgeler için hangi transkripsiyon faktörleri bağlamak düzenleyici DNA öğeleri (örneğin, Organizatör, arttırıcılar, odağı kontrol bölgeleri, izolatörler) temsil eder. Erişilebilir Kromatin manzara eşleme bir güçlü açığa çıkarmak etkin düzenleyici elemanlarının için genom arasında bir yaklaşımdır. Bu bilgiler ilgili transkripsiyon faktörleri ağ ve gen ifade programları yöneten Kromatin yapısı mekanizmaları keşfetmek için tarafsız bir yaklaşım olarak hizmet vermektedir. ATAÇ-seq Dnaz için güçlü ve hassas bir alternatif olduğunu ben yeni nesil sıralama (Dnaz-seq) ve formaldehit destekli yalıtım Kromatin genom geniş analizi için düzenleyici elemanlarının (FAIRE-seq) ile birleşince aşırı duyarlılık analizi erişilebilirlik ve micrococcal nükleaz duyarlı sitelerin (MNase-seq) nucleosome konumlandırma belirlemek için sıralama için. Biz insan birincil bağışıklık Yani CD4 + lenfosit hücreleri için en iyi duruma getirilmiş detaylı bir ataç-seq Protokolü mevcut (T yardımcı 1 (Th1) ve Th2 hücrelerinin). Bu kapsamlı protokol hücre hasat ile başlar sonra Kromatin tagmentation, numune hazırlama için yeni nesil sıralama, moleküler yordamı açıklar ve ayrıca yöntemleri ve konuları için kullanılan hesaplama analizleri içerir Sonuçları yorumlayın. Ayrıca, zaman ve para tasarrufu için biz ataç-seq Kütüphane sıralama önce değerlendirmek için kalite kontrol önlemleri tanıttı. Önemlisi, bu protokol için sunulan ilkeleri diğer insan bağışıklık ve non-immün Primer hücre ve hücre hatları onun uyum sağlar. Söz konusu kurallar da yeni nesil sıralama yöntemleri ile yetkin olmayan laboratuarlar için yararlı olacaktır.
Giriş
ATAÇ-seq1,2 düzenleyici3 açık Kromatin bölgeleri ve nucleosome konumlandırma sağlar güçlü bir yöntemdir. Bu bilgileri konumu, kimlik ve transkripsiyon faktörleri Faaliyet çıkarım için uygulanır. Kromatin yapısı nicel değişimler ölçmek için yöntemin duyarlılığı Kromatin remodelers ve değiştiriciler, RNA polimeraz II1transkripsiyon aktivite gibi Kromatin faktörlerin aktivitesinin çalışma sağlar. Böylece ataç-seq ilgi herhangi bir hücre tipi transkripsiyon yönetmelikte yöneten mekanizmaları deşifre için güçlü ve tarafsız bir yaklaşım sağlar. Biz ataç-seq adaptasyon için birincil insan Th1 ve Th2 hücreleri tanımlamak.
ATAÇ-seq adaptörler için yeni nesil sıralama (NGS) çiftler DNA fragmantasyonu DNA'sı adaptörler (örneğin, "tagmentation" süreci)1ile etiketleme ile olan hiperaktif Tn5 transposase dolu. PCR güçlendirme elde edilen DNA kütüphaneler yeni nesil sıralama (şekil 1) için hazırsınız demektir. Erişilebilir Kromatin tercihli tagmentation ataç-seq sıralama okur yerel zenginleştirme analiz tarafından algılanır.
Kısa deneysel işlemin ve Kromatin erişilebilirlik ve nucleosomal Dnaz seq4, dürüst-seq5ve MNase-seq6, gibi konumlandırma ölçmek için diğer yöntemleri göre daha az başlangıç materyali için gereksinim vardır ATAÇ-seq kullanımı insan Primer hücre1,7 ve klinik örnekleri8yanı sıra tek hücreli organizmalar9, bitkiler10, meyve sinekleri11 de dahil olmak üzere birden çok biyolojik sistemlerde terfi ve çeşitli memeliler12.
Kimlik için erişilebilir loci bağlı faktörler zenginleştirme onların bağlama sırası motifleri analiz veya ataç-seq takip yüksek üretilen iş DNA sıralama () tarafından Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ile birleştirerek ortaya transkripsiyon ChIP-seq). Bu yaklaşım lineage özgü transkripsiyon faktörleri fare13' te hematopoiesis için önemli tanımlaması etkin. ATAÇ-seq tarafsız ve küresel doğası gen düzenlemesi reaktifler çipi analiz için antikorlar gibi mevcut değildir organizmalarda eğitim sağlar. Örneğin, evrimsel değişimler CIS-düzenleyici bölgeleri tespit edilmiştir kafatası nöral crest hücrelerden insan ve şempanzenin14, düzenleyici elemanlarının gelişimsel değişimler sırasında erken fare inceleyerek embriyogenez15, tek hücreli C. owzarzakibir yaşam döngüsü boyunca yasal manzara modunda değiştirir9ve Organizatör ve arttırıcılar 20 memeli türü12arasında evrimi.
ATAÇ-seq Ayrıca Kromatin erişilebilirlik hangi genellikle genom genelinde Çalışmalar7,16evades böylece ifşa değişkenlik hücre popülasyonlarının içinde tek kişilik hücrelerde ölçmek için vesile olmuştur. Buna ek olarak, ATAÇ-seq örnekleri nadir hastalık koşullarında DNA yasal bölgelerde meydana gelen değişiklikler çalışma için kullanılabilir. Örneğin, ATAÇ-seq Akut Miyeloid Lösemi (AML)17 veya Rasbaşlangıcı sırasında değişiklikleri düzenleme peyzaj çalışması için kullanılabilir-oncogenesis11tahrik.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
tüm yordamları Bar Ilan Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından kabul edildi ve protokol deneyler onaylama Komitesi tarafından sağlanan kuralları izler.
1. arıtma saf insan CD4 + hücre ve polarizasyon T yardımcı 1 (Th1) ve Th2 hücrelerinin
Not: burada biz donmuş insan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) başlayan açıklayınız. İlk adım lastikteki kullanarak CD4 + hücreleri izole oluşur ve sütunları genellikle bize hücreleri CD4 + % 95'i daha fazla verin. Ancak, bu adımı her laboratuarında tercih edilen protokolüne göre değişebilir. T hücre aktivasyonu ve polarizasyon için protokolü Jenner ve ark. güncellenmiştir (2009) 18. yalıtım in CD4 + 10 milyon PBMCs verir hücrelerden artış 4-6 milyon için CD4 + hücre. Bölünmüş iki şişe ve Th1 altında yetiştirilen ve sadece bir hafta içinde koşullar verimli 3-5 milyon Th1 ve Th2 hücreleri Th2 polarize.
Not: santrifüj ile 4 ° C arasında başlamadan önce soğumasını.
- İnsan PBMCs çözülme 1 mL (10 7 hücreleri) %1 penisilin-streptomisin, 2 mM L-glutamin ve % 10 ısı inaktive fetal sığır serum RPMI orta 10 mL içeren bir 50 mL tüp. 500 x g 5 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve ilave RPMI orta 15 ml steril 25 mL pipet içeren hücreleri resuspend. Hücreleri (ile steril 25 mL pipet) bir T75 kültür şişesi transfer.
- Hücreleri oksijen İnkübatör (37 ° C, % 5 CO 2) geceleme bırakın.
- Steril 25 mL pipet ile yüzen hücreleri 50 mL tüp için transfer. Cep telefonu numarasını ve canlılığı trypan mavi dışlama tarafından belirlemek.
- İzole CD4 + 10 milyon hücrelerden canlı olmayan-yapışık PBMCs lastikteki CD4 + ve üreticiye göre sütunları kullanarak pozitif seçime göre ' s öneriler (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman) aşağıdaki değişiklik: 10 7 PBMCs % 0.5 BSA PBS içinde 120 µL CD4 lastikteki 30 µL ile etiketlenir.
- RhIL-2 (10 ng/mL), plaka bağlı anti-CD3 (5 µg/mL) ve çözünebilir anti-CD28 (2 µg/mL) tarafından CD4 + T hücreleri 72 h için etkinleştirin. Th1 polarizasyon için rhIL-12 (20 ng/mL) ve anti-Il-4 (10 µg/mL) ekleyin. RhIL-4 (40 ng/mL) ve anti-IFN-γ (10 µg/mL) Th2 polarizasyon için eklemek.
- RhIL-2 (10 ng/mL) huzurunda ek 7 gün ve aynı polarize sitokinler (rhIL-12 için Th1 ve Th2 için rhIL-4) hücreleri kültür.
2. Çekirdeklerin yalıtım
Not: ataç-seq sağlam çekirdeği ile gerçekleştirilir. Lizis arabellek içeren % 0.05 nonylphenyl polietilen glikol (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman), çekirdek birincil insan Th1 ve Th2 hücrelerden yalıtmak için kalibre. Bu adım laboratuvar Kimyasalları ve hücreleri ile ayarlama tavsiye ediyoruz. Aşırı yetersiz deterjan sağlam hücre transpozisyonu tepki verimliliğini düşürür. Hücre lizis verimliliği göre hücrelerin sayısı toplam çekirdek (trypan mavi pozitif hücrelerinin) sayısına göre belirlenir.
Not: lizis arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2) hazırlayın. Bir salıncak-kova rotor 4 ile bir santrifüj soğumasını ° C. sabit açılı santrifüj yerine bir salıncak-kova santrifüj hücrelerde peletleme hücre/çekirdek kaybı azaltır. Çekirdeği veya hücre kaybı, dikkatle süpernatant atarak zaman damlalıklı önlemek için.
- Ekle taze nonylphenyl polietilen glikol (için son bir konsantrasyon % 0.05) ve soğuk lizis arabelleğine kullanımdan hemen önce proteaz inhibitörleri (için 1 x son bir konsantrasyon) x 100. Arabellek buz üzerinde tutmak
- Kendi tutar ve canlılığı trypan mavi yöntemini kullanarak belirlemek için sayısı T hücreleri. Daha yüksek non-spesifik sindirim sonuçlarında % 90 daha düşüktür canlılığı.
- Transfer 0.5 x 10 6 T hücreleri (Th1 veya Th2) 1.5 mL mikrotüpler için. Spin aşağı vasıl 500 x g 5 min için saat 4'te ° C.
- Hücre Pelet 1 mL soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm resuspend. Spin aşağı vasıl 500 x g 5 min için saat 4'te ° C.
- Hücre Pelet 1 mL soğuk lizis arabellek (nonylphenyl polietilen glikol ve proteaz inhibitörleri içeren) resuspend. Tüp buz üzerinde tutun. Yavaşça çekirdeklerin etkilemesini önlemek için pipet.
- Hızlı bir şekilde 10 µL al ve lysed hücreleri ile microtube buz üstünde ise bir otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak. Bu adımı çekirdeklerin zarar görmesini önlemek için beş dakika aşmaması gerekir. Hücreleri en az % 80'i lysed. Hemen yanaşma tepki ile
- devam et. Hazırlanan çekirdeği üzerinde buz tutmak
3. Transpozisyon reaksiyon
Not: Bu adımda, izole çekirdeği NGS sıralaması bağdaştırıcısı yüklü prokaryotik Tn5 transposase (TDE1) ile inkübe. Hiperaktif Tn5 aynı anda DNA parçaları ve bağdaştırıcıları (tagmentation süreci) genom erişilebilir bölgelere ligates. Çekirdek ve Tn5 transposase arasındaki oran erişilebilir Kromatin adlı tercihli bölünme için önemlidir. Bu iletişim kuralı için 100.000 çekirdeği 100 μL tepki birimindeki kalibre edilmiş. Ancak, reaksiyon küçültülmüş.
- Ayarla sıcaklık termal bir shaker 37 ° c
- Transfer 100.000 çekirdekler için 1.5 mL microtube.
- 10 dk 4 ° C'de ve yavaşça için 500 x g, santrifüj süpernatant kaldırmak.
- Transpozisyonu reaksiyon bileşenleri çekirdek için belirtilen Tablo 1 ekleyin.
- Nazik pipetting tarafından resuspend.
- (500 rpm) sallayarak nazik ile yanaşma tepki bir termal shaker-37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya.
Not: DNA Temizleme katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk 19 tarafından gerçekleştirilir (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman) veya PCR arıtma sütunlar. Temizlik sonunda, 10 mm Tris-HCl, pH 8 20 µL içinde DNA parçaları elute. EDTA elüsyon arabellekte kaçının.
4. PCR zenginleştirme ataç-seq kütüphanelerin
Not: ataç-seq Kütüphane Yani, DNA parçalarının takılı bağdaştırıcılar ile yükseltmek için bu adım hedefleniyor. Aynı yeni nesil sıralama şeritte birkaç ataç-seq kütüphanelerin karıştırma sağlamak için (" çoğullama ") kullanım Sıralanmayan astar 1 (Ad1_noMx) 1 tüm örnekleri için ve farklı bir dizine (barkodlu) astar 2 (reklam 2.1-2.24) Her örnek için 1. Astar dizileri desteklenmiştir Tablo malzemeleri/ekipman sağlanmaktadır.
- İlk PCR güçlendirme
Not: astar 1 (Ad1_noMx) ve astar 2 çalışma konsantrasyonu 25 µM olduğunu. Tüm astar için 25 µM 100 µM özgün stoktan seyreltilmiş. Tüm PCR reaksiyonları, astar 1 (Ad1_noMx) ve dizin oluşturulmuş astar 2 yalnızca birini kullanın.- PCR reaksiyon bileşenleri belirtilen Tablo 2 steril bir PCR tüp ekleyin.
- Yer PCR tüp bir termal cycler ve PCR güçlendirme Tablo 3 ' te ayrıntılı bisiklet koşullarını kullanarak gerçekleştirmek.
- Ek amplifikasyon döngü sayısı değerlendirilmesi
Not: ek PCR döngü sayısı Kütüphane parçaları f yeterli miktarda verimya da başarılı bir gelecek nesil sıralama çalışmasını, GC önlemek ve önyargı 20 boyutlandırmak için simge durumuna küçültülmüş. En iyi kütüphane parçası amplifikasyon için gerekli PCR döngü (N) sayısı tayini kantitatif PCR (qPCR) tarafından yapılır.- Seyreltik astar 1 (Ad1_noMx) ve 2 25 µM den 6.25 µM (ilk kütüphane amplifikasyon için kullanılır).
- Optik PCR tüpleri veya bir tabak Tablo 4 ' te belirtildiği gibi bileşenleri ekleme.
- Bir qPCR alet ve döngüsü olarak belirtilen Tablo 5.
- Ek amplifikasyon döngüsü (N) süreyi tahmin etmek için arsa devir sayısı x ekseni ve y ekseni üzerinde göreli floresan (RFU).
- Ek amplifikasyon sayısını döngüleri (N) 1/3, plato qPCR tepki ulaştı döngü sayısı var. Şekil 2 ~ 2,350 göreli Floresans birimler, RFU (kalın yeşil çizgi) plato ulaştı üç ataç-seq kitaplıkları için örnekler sağlar. (Kırmızı ve mavi amplifikasyon eğrileri) kütüphanelerin iki kişilik 8 döngüleri ve üçüncü kütüphane (pembe) 9 ÇSYİ devredir içinde maksimal miktarı (783 RFU, y ekseni üzerinde işaretlenmiş) üçte biri güçlendirilmiş PCR devir sayısına karşılık gelir.
- Son PCR güçlendirme
- kalan 45 µL PCR reaksiyon yükseltmek. Termal cycler 4.1.2 adımda amplifikasyon tepki içeren bir PCR tüpü yerleştirin. Tablo 6 ' da açıklanan PCR programını çalıştırın. Amplifikasyon döngü (N) önceden belirlenmiş (Adım 4.2.5) sayısı kullanın.
5. Boyut seçimi ataç-Seq kütüphaneler
Not: yüksek molekül ağırlıklı Kütüphane parçaları ortadan kaldırdığından deneyim, boyutu seçimi güçlendirilmiş ataç-seq kütüphanelerin yeni nesil sıralama sonuçları geliştirir. son ataç-seq kitaplık.
Not: oda sıcaklığında 30 dk kullanmadan önce ısıtmak manyetik boncuklar izin.
Taze % 70 etanol suda nükleaz ücretsiz hazırlayın.
- Karıştırarak mıknatıslı boncuk resuspend.
- (4.3.1. adımda elde.) ataç-seq kitaplıklarına nükleaz ücretsiz su ekleyin ve en çok 100 µL getirmek.
- Ekle 50 µL (0.5 x) resuspended DNA'ya bağlanıcı manyetik boncuklar için güçlendirilmiş kütüphanelerin 100 µL. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından karıştırın. Örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Gerekirse, hızlı bir şekilde mikrotüpler spin.
- Tüp manyetik boncuklar süpernatant ayırmak 2 dk için uygun bir manyetik stand üzerine yerleştirin. 2 dakika sonra yeni bir microtube süpernatant transfer.
- Pipetting tarafından süpernatant hacmi ölçmek ve manyetik boncuklar 0.7 x ekleyin. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından Mix.
- Oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya. 2 dakika süreyle manyetik bir stand üzerinde yer
- Sonra 2 dk kuluçka, süpernatant atmak. Tüpler manyetik kürsüye iken boncuk yıkamak için 200 taze yapılmış µL % 70 etanol ekleyin.
- Devam microtube mıknatıs için 30 üzerinde s ve sonra atma etanol. Adım 5.7.for iki son etanol yıkar yineleyin.
- Tamamen kalan etanol ve tüp mıknatıs üzerinde ise Boncuk 5 min için kurumasına izin kaldırın. Gerekirse, kısaca microtube spin. P10 pipet ucu ile etanol izlerinin giderilmesi.
- Microtube mıknatıs kaldırın ve 10 mm Tris-HCl, pH 8 22 µL ekleyin. EDTA içeren arabellek ataç-seq kitaplıklarında elute değil.
- Oda sıcaklığında 2 min için tüp kuluçkaya ve manyetik kürsüye getirin.
- Çözüm açık olduğunda, yeni bir steril microtube eluted kütüphanelerin 20 µL transfer.
- Deposu boyutu seçili ataç-seq kitaplıkları, -20 ° c
6. ATAÇ-Seq kütüphanelerin kalitesi analizi
- ataç-seq kitaplıkları tarafından gerçek zamanlı PCR kalitesini doğrulanmasını
Not: yeni nesil önce ataç-seq kütüphanelerin gürültü oranı sinyal değerlendirmek önemlidir sıralama. Bu DNA parçalarının üzerinden erişilebilir ve ulaşılmaz loci kantitatif PCR (qPCR) kullanarak göreli miktarı belirlenerek yapılır. Ulaşılmaz loci (negatif kontrol, chr1:48, 137, 860-48,137,934 ve chr1:193, 093, 748-193,093,827) 1 ve 2 astar çiftleri tarafından güçlendirilmiş. Erişilebilir loci (pozitif kontrolü, chr19:30, 336, 166-30,336,253 ve chr19:11546154-11546237) 3 ve 4 astar çiftleri tarafından güçlendirilmiş. Pozitif ve negatif loci insan CD4 + hücreleri (KODLA katılımların ENCSR000EQE ve ENCSR000EQG) Kromatin erişilebilirlik (DHS-seq) profillerden tanımlı değil. Negatif astar 1 büyük bir heterochromatic intergenic bölgeye (230 kb TRADB2 ve FOXD2 dan 88 kb) yer alır. Negatif kontrol bölgesi 2 CDC73 gene ilk intron içinde mevcuttur. Astar çifti 3 pozitif bir açık Kromatin bölge içinde olumlu astar çifti 4 süre siklin E (CCNE1) gen aşağı protein kinaz C substrat 80 K-H (PRKCSH) düzenleyici içinde ortalanır. Önemlisi, bu denetim loci onlar insan hücre türleri geniş bir yelpazede kitaplıklardan ataç-seq izlemek için uygulanabilir düşündüren başka insan hücre tipleri KODLA proje 3, erişilebilirlik benzer bir yol gösterir. Astar verimliliği ve tüm astar çiftleri özgüllüğü qPCR (hücrelerden insan Th) genomik DNA'ın seri bir seyreltme ve elde edilen güçlendirilmiş ürünler bir erime eğrisi analizi tarafından doğrulanmış.- İzole genomik DNA ticari olarak kullanılabilir kullanarak (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman) kit.
- Güçlendirilmiş ataç seq seyreltik Kütüphane 1:10 (1 µL Kütüphane + 9 nükleaz ücretsiz su µL) ve genomik DNA ~ 5 ng/µL '.
- Reaksiyon karışımı (Tablo 7) tepkiler nüsha gerçekleştirilen dikkate alarak her pozitif ve negatif kontrol astar çifti için hazır olun.
- QPCR ana mix tedarikçi tarafından önerilen protokolüne göre qPCR termal cycler Incubate.
- Analiz sonuçları qPCR alet ' s yazılım (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman). Genomik DNA kontrolü örnek olarak seçin. Elde edilen değerler bir zenginleştirme erişilebilir bölgeler (pozitif kontrol astar tarafından güçlendirilmiş) temsil eder. Bir örnek Tablo 8 ' de gösterilen.
Not: Tahmini ortalama Kütüphane boyutu ve konsantrasyon: ataç-seq kitaplıklarından DNA parçalarının boyutu dağılımı yüksek-duyarlı otomatik Elektroforez Sistemleri üretici göre belirlenir ' s yönergeleri. Bu örnek toplama dsDNA yüksek-duyarlı kit ve en az 2 µL her DNA örneği kullanarak bir yer olarak ölçmek için tavsiye edilir.
Not: Yeni nesil sıralama - kütüphaneler çoğullama önce her ataç-seq Kütüphane molarite formülü kullanarak hesaplama: (ng/µL x 10 6) / (660 x ortalama kitaplığı parçası uzunluğu). İçin amaç > açık Kromatin değerlendirmek için her ataç-seq kitaplık 30 milyon defa okundu insan örnekleri bölgelerinde. Kütüphanede NGS sıralama için yeterli olup olmadığını belirlemek istiyorsanız, başlangıçta ~ 10 milyon okur (sıralama Lane DNA sıralama cihazda hızlı çalıştırma modunda % 5) nişan al. Nucleosome konumlandırma anlaması için eşleştirilmiş uç sıralama gerekli 1 olduğunu göz önünde bulundurun.
7. Yeni nesil sıralama elde edilen sonuçların analiz
- FastQC resimler, her kitaplık için ayrı ayrı inceleyerek sıralama okuma kalitesini sonucuna.
- Papyon 21 yazılım Unix/Linux ortamında kullanarak okuma insan başvuru genom (hg19 birleştirme) için hizalayın. Komut ' papyon -m 1 - q -S Genom dizini reads.fastq output_aligned.sam '. Genom dizini papyon genom dizinleri depolandığı klasörün için duruyor. Parametre -m 1 genomu içinde birden fazla locus okuyan hizalamasını izin vermiyor - q fastq biçiminde olması gerektiğini giriş dosyası için -S mı SAM biçiminde çıktı için.
- Yinelenen okuma UNIX/Linux ortamında SAMtools 22 rmdup seçeneğini kullanarak kaldırın. Komutları ' samtools göster -S output_aligned.sam -b | samtools sıralama -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. İlk komut, görünüm, hangi sonra sıralanır BAM biçime SAM biçimini değiştirir. Rmdup seçeneği daha sonra sıralanmış BAM dosyada uygulanır. İsteğe bağlı olarak bir özgün ataç-seq kağıt 1 ' de açıklandığı gibi okuma transposon ekleme sitesi için ayarlayabilirsiniz. Bu yapılır 23 UNIX/Linux ortamında komutları kullanarak BEDtools. Komutları ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genom > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. İlk komut, bamTobed, sonra shiftBed komut için kullanılabilecek yatak biçime BAM biçimini değiştirir. Genom genom her kromozom uzunluğunu içeren bir sekme sınırlandırılmış dosya dosyadır. Dosya genellikle BEDtools dizinine eklenir.
Aşağıdaki parametrelerle kayar yatak dosyada UNIX/Linux ortamında modeli tabanlı analiz ChIP-seq (MACS2) 24 yazılım kullanarak - gerçekleştir tepe arama:--nomodel--extsize 75 - shift -30. Bu parametreler her sıralama okuma ortasında transposon ekleme sitedir okuma ayarlamak için kullanılır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu iletişim kuralı, nihai sonucunu genellikle 3-20 ng/µL bir ataç-seq kütüphanedir. Ne zaman bir sistemde DNA bütünlük analizi için koşmak (bakınız Tablo malzemeleri/ekipman), merdiven gibi bir görünüm2 (şekil 3A) gösteriyorlar. DNA parçaları ortalama boyutunu genellikle ~ 450-530 bp var.
Yeni nesil sıralama gerçekleştirmeden önce ataç-seq kütüphanelerin uygu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan ataç-seq Protokolü başarılı bir şekilde erişilebilir Kromatin analiz için Primer hücre içinde istihdam edilmiştir (insan Th1, Th2 hücrelerinin ve B hücreleri) yanı sıra kültürlü hücre hatları (MCF10A insan meme kanseri hücreleri ve U261 glioblastoma hücreleri). Diğer hücre tipleri için ataç-seq yüklemeden lizis adımda özellikle bazı protokol optimizasyon gerektirebilir. Non-iyonik deterjan konsantrasyonu çok yüksek ise, mitokondriyal DNA kirlenme daha yüksek bir yüzdesi olabilir. Bu çekirdekler verim aza...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser İsrail Bilim Vakfı (grant 748/14) tarafından desteklenmektedir, Marie Curie Tümleştirme vermek (çiğ) - FP7-insanlar-20013-çiğ-618763 ve ben-çekirdek Program planlama ve bütçeleme Komitesi ve İsrail Bilim Vakfı No 41/11 verin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mL tüpler | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Mikrotüpler | Axygen Inc | MCT-175-C | Diğer satıcılardan olabilir. |
| 25 mL serolojik pipetler | Corning Costar | 4489 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Doku kültürü şişesi | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Countes Otomatik Hücre Sayacı | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Doku | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Periferik kan mononükleer hücreleri ( PBMC) | ATCC | PCS ve utangaç; 800 011 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| RPMI 1640 Orta Biyolojik | Endüstriler | 01-103-1A | Diğer satıcılardan olabilir. |
| L-Glutamin Çözeltisi (200 mM) | Biyolojik endüstriler | 03-020-1B | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Penisilin-Streptomisin | Biyolojik Endüstriler | 03-031-1B | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Fetal Sığır Serumu (FBS), Isı Etkisizleştirilmiş, Avrupa Sınıfı | Biyolojik Endüstriler | 04-127-1 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| MACS CD4 mikro boncukları, insan | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS sütunları | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-İnsan CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Fare IgG1 İzotip Kontrolü FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-İnsan CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-İnsan CD28 SAFIRE Saflaştırılmış | Biyogemler | 10311-25 | |
| Rekombinant İnsan IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Rekombinant İnsan IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Rekombinant İnsan IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| İn Vivo Hazır Anti-İnsan IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Saflaştırılmış anti-insan IFN-&gama; | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analitik sınıf | Carlo Erba | 479687 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Magnezyum klorür, Heksahidrat, moleküler biyoloji sınıfı | Calbiochem | 442611 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| EDTA | MP Biyomedikal | 800682 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Tris, ultra saf,% 99.9 saf | MP Biyomedikal | 819620 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| NP-40 alternatifi (Nonilfenil Polietilen Glikol) | Calbiochem | 492016 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Proteaz İnhibitörleri | Sigma | P2714 | bu proteaz inhibitörü kokteyli bir tozdur. 100 x çözelti yapmak için 1 mL moleküler biyoloji dereceli su ile seyreltin. |
| Manyetik katı faz ters immobilizasyon boncukları: AMPure XP boncukları | Beckman | 63881 | |
| PCR arıtma kiti | HyLabs | EX-GP200 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Nextera DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti (TDE1 transpozaz ve TD tamponu) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Sıcak Başlangıç HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Yeşil I | Canlandırıcı | S7585 | |
| ve nbsp; CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Algılama Sistem | Bio-rad | 185-5200 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| CFX Yönetici Yazılımı | Bio-rad | 1845000 | |
| qPCR için ana karışım: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Diğer satıcılardan olabilir. |
| Qubit florometre 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Invitrogen | Q32854 | |
| Eppendorf tüpleri için Mıknatıs | Invitrogen | 12321D | Diğer satıcılardan olabilir. |
| 15 mL falcon tüpleri ve eppendorf tüpleri için kovalı salıncak kovalı soğutma santrifüjü | Thermo Scientific | 75004527 | Diğer satıcılardan olabilir. Eppendorf tüpleri için kovalara sahip olması önemlidir. |
| Termo-çalkalayıcı | MRC | Diğer satıcılardan olabilir. | |
| Yüksek Hassasiyetli D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Yüksek Hassasiyetli D1000 Reaktifler | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation sistemi | Agilent Technologies | G2991AA | Elektroforez için bant tabanlı platform |
| Yüksek Hassasiyetli DNA kiti | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reaktif yüksek hassasiyetli TapeStation analizi |
| Primer adı ve sırası | Şirket | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3'IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 dizi-transpozaz dizisi-3'Ad2.1_TAAGGCGA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.1_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.2_CGTACTAG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.2_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [TTCTGCCT] GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.3_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.4_TCCTGAGC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.4_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.5_GGACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.5_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.6_TAGGCATG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.6_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.7_CTCTCTAC | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.7_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [CCTCTCTG] GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.8_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.9_GCTACGCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.9_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.10_CGAGGCTG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.10_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.11_AAGAGGCA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.11_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.12_GTAGAGGA | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.12_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [ATCACGAC] GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.13_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.14_ACCACTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.14_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.15_TGGATCTG | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.15_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.16_CCGTTTGT | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.16_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.17_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.18_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.19_AGGTTGGG | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.19_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [CACCACAC] GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.20_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3' | ||
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT [GAAACCCA] GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.21_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.22_TGGTCACA | ||
| : 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.22_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.23_TTGACCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.23_expected indeks dizisi okuma: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'Ad2.24_CCACTCCT | ||
| : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3'IDT | Ad2.24_expected indeks dizisi okundu: 5'-P7 dizisi-[indeks dizisi]-transpozaz dizisi-3'F1: | ||
| 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT | |||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT | |||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT | |||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACAACATCCTTCAC-3'IDT | |||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT | |||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT | |||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT | |||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT |
Kaynaklar
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030(2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18(2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284(2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
