Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir atmosferik basınç plazma Jet yeni uygulama SH-SY5Y hücrelerin glikoz yoksunluğu kaynaklı yaralanma karşı bir nöro-koruyucu ajan olarak

8.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56323

⸱

9 Ekim 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 2School of Physics, Beijing Institute of Technology, 3Beijing Key Laboratory of Central Nervous System Injury, Beijing Neurosurgical Institute, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Translational Medicine for Cerebrovascular Disease, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 5China National Clinical Research Center for Neurological Diseases, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Düşük doz atmosferik basınç plazma glikoz yoksunluğu kaynaklı SH-SY5Y yaralanmalar tedavisine nöroprotektif uygulanması için bir iletişim kuralı.

Özet

Kendi emisyon reaktif nitrojen türler (RNS) ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) birden çok türde içerdiğinden atmosferik basınç plazma jet (APPJ) son yıllarda birden fazla disiplinlerden gelen pek çok araştırmacı dikkatini çekti. Bizim önceki çalışma oksidatif stres kaynaklı yaralanmalara karşı APPJ cytoprotective etkisini göstermiştir. Bu da çalışmanın amacı SH-SY5Y hücreleri glikoz yoksunluğu kaynaklı yaralanma helyum APPJs nöroprotektif uygulamalara ilişkin detaylı vitro tedavi protokolü sağlamaktır. SH-SY5Y insan Nöroblastom türetilmiş hücre kültürünü RPMI 1640 orta % 15 fetal buzağı serum ile birlikte devam edildi. Kültür orta sonra glikoz APPJ tedavi öncesi olmadan RPMI 1640 için değiştirildi. Bir hücre kuluçka 1 h kuluçka sonra hücre sayım Kit 8'i kullanarak hücre canlılık kararlıydı. Sonuçları gösterdi ki, glikoz yoksunluğu grubuna göre hücre APPJ ile tedavi önemli ölçüde artmış hücre canlılığı doz bağımlı bir şekilde s/iyi bir optimal doz gözlenen 8 ile sergiledi. Bu arada, helyum akışı glikoz yoksunluğu indüklenen hücre bozukluğu üzerinde bir etkisi vardı. Sonuçlarımız APPJ glikoz yoksunluğu için ilgili merkezi sinir sistemi hastalıkları için bir tedavi yöntemi olarak potansiyel olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Bu iletişim kuralı da bir cytoprotective uygulaması olarak farklı Engelli, diğer hücreler için kullanılabilir ama hücre kültürü ve APPJ tedavi koşulları ayarlamalara gidilmesi ve tedavi dozu nispeten düşük olması gerekir.

Giriş

Yetişkin beyin neredeyse sadece glikoz enerji metabolizması normal fizyolojik koşullar altında için bir substrat kullanır. İnsan beyninin vücut ağırlığı sadece % 2'si kabul ettiğiniz anlamına gelir ama toplam glikoz vücut1içinde yaklaşık % 25'i kullanır. İyi belgelenmiş bu glikoz metabolizması bozukluğu önemli patolojik değişiklikler iskemik inme ve Alzheimer hastalığı (Ah), Huntington hastalığı (HD) ve Parkinson hastalığı (PD) de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklar sırasında biridir 2,3. Glikoz ve bozulmuş glikoz alımı veya oksidatif fosforilasyon eksikliği doğrudan etkisi ATP üretimi ve daha fazla bu Bakımı hücre canlılığı düşündüren nöronal disfonksiyon riskini artırabilir sinir hücre ölümü teşvik veya glikoz yoksunluk bu hastalıkların tedavisi için makul bir yaklaşım olabilir sonra hücre yaralanma geciktirmek. Nöroprotektif etkileri odaklanarak anti-enflamatuar ajanlar, iyon kanal modülatörler, serbest radikal leş yiyiciler, Nörotrofik faktörler, glikoz modülasyon yoluyla incelenmesi vb ilgi olmuştur. Ancak, çeviri tezgah klinik pratikte bu nöroprotektif yaklaşımlar başarılı4olmamıştır.

Atmosferik basınç plazma jetlerin (APPJs) yeni bir teknolojiyle son yıllarda birden fazla disiplinlerden gelen pek çok araştırmacı dikkatini çeken atmosferik düşük sıcaklık gaz deşarj vardır. APPJs yıllardır kanser hücre tedavisi, bakteriyel inactivation, kan pıhtılaşması, yara iyileşmesi, oral ilaç, vb5,6, birden çok türünün kendi emisyon nedeniyle gibi çeşitli Biyomedikal uygulamalarda kullanılan Reaktif nitrojen tür (RNS) ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) (Resim 1)7. Önceki plazma biyo-Tıp uygulamaları başlıca oksidatif ve/veya nitrative stres bakteriler, hücre ve dokulara8üzerinde duruldu. Ancak, birçok fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin9ile ilgili önemli hücre içi sinyal molekülleri RNS ve ROS olduğundan APPJ da "iki ucu keskin kılıç" olacaktır. Nitröz oksit (NO) biyolojik süreçlerin geniş bir kontrol eder ve insan vücudunda, özellikle merkezi sinir sistemi (MSS) ikili bir rol oynar. NO seviyesinin düşük her iki vitro nöroprotektif faaliyetlerini göstermiştir ve vivo içinde birden çok sinyal yolları10üzerinden. Önceki çalışmamızda ilk helyum rapor APPJ kaynaklı hiçbir üretim APPJ nöroprotektif etkisi oksidatif stres kaynaklı yaralanmaları11karşı söz konusu. Ancak, diğer yaralanma APPJs etkileri bildirilmiştir değil. Bu nedenle, mevcut çalışmada helyum APPJ nöroprotektif uygulamalara ilişkin bir vitro tedavi protokolü üzerinde SH-SY5Y hücreleri glikoz yoksunluğu kaynaklı yaralanma sağlamaktır. Önceki çalışmalarda farklı, bizim protokol düşük doz plazma tedavi APPJ tedavi potansiyel bir roman "hiçbir donör ilaç olarak kullanılabileceğini gösteren aşırı plazma kaynaklı yaralanmalarının sonuçları olmadan nöroprotektif uygulamaları için kullanılan "gelecekteki araştırma ve klinik çeviri için bile. Bu iletişim kuralı da diğer hücre tipleri farklı bozukluğu olan bir cytoprotective uygulaması olarak kullanılacak önerildi ama APPJ tedavi koşulları yeniden ayarlanmış olmalıdır ve tedavi dozu nispeten düşük olması gerekir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. APPJ aygıt hazırlanması

dikkat: ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen uygun güvenlik yöntemleri bir duman hood ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, koruyucu eldiven, önlük, vb) kullanımı da dahil olmak üzere tüm deneyler yaparken kullanın. Standart hücre işleme teknikleri (sterilizasyon, hücre kurtarma, cep passaging, hücre dondurma, hücre boyama, vb) protokolü gerektirir.

  1. Bir iç çapı 1 mm ile bir kuvars tüp seçin ve bir dış çapı 3 mm. düzgün kesit parlatma folyo kullanarak her iki ucunda.
  2. Nikel paslanmaz çelik iğne 1.0 mm çapı ile yüksek gerilim elektrot kullanın. Ucu 0.05 mm eğrilik yarıçapı için eziyet.
  3. Wrap alüminyum folyo (2 mm genişliğinde) 1 cm kuvars tüp etrafında kuvars tüp başlığı. Paslanmaz çelik iğne nokta 1 cm alüminyum folyo diğer ucunu düzeltmek. Alçak gerilim elektrot alüminyum folyo yüzüğü kullanın.

2. Jetler edinimi

bir AC sinyal sağlamak, bir güç kaynağı hizmet işlevi sinyal üreteci yüksek voltajlı güç amplifikatörü bağlanmak için
  1. . Yüksek gerilim elektrot için uygulanan gerilim dalga formu kaydetmek için yüksek voltajlı sonda dijital osiloskop bir ucunu ve diğer ucunu güç kaynağına bağlayın. Devre koruması için 2 k kullanın Ω direnç olarak koruyucu bir direnç. Devre Şekil 2 ' de gösterildiği gibi bağlayın.
    Uyarı: yüksek gerilim hatları dokunmayın.
  2. Sürekli olarak helyum (birim kesir, % 99.999) kuvars tüp geçmek ve gaz akış oranı istikrarlı bir 1.4 standart litre başına dakika (SLM) adlı denetim.
    Not: Bir filtre hücre kültürleri tedavi önce kullanmayın. Birim deneyde kullanılan helyum % 99.999 bir bölümüdür ve çoğu mikroorganizmalar bu koşullar altında yaşayamam.
  3. Gücü osiloskop, sinyal üreteci ve yüksek voltajlı güç amplifikatörü açın. 5 kHz frekans ayar düğmesi döndürün. Yavaş yavaş artırın 6 tepe tepe değeri için voltaj kV.
    Not: Jet yeterince uzun (yaklaşık 3 cm) ne zaman iğnede uygulanan gerilim tepe tepe değeri ise yaklaşık 6 kV.

3. SH-SY5Y hücreleri hazırlanması

  1. RPMI 1640 bir 25 cm 2 şişeye Grow SH-SY5Y insan Nöroblastom türetilmiş hücre hattında orta % 15 fetal buzağı serum (FBS) ile desteklenmiştir. %37 5 CO 2 ve % 95 hava içeren bir oksijen kuluçka hücreleri korumak ° C.
  2. Ne zaman hücreleri % 85 izdiham ulaşmak, dikkatle kültür medya Aspire edin ve 1 mL % 0.25 tripsin + %0,1 EDTA hücrelere ekleme.
  3. Sonra 15 s kuluçka oda sıcaklığında dikkatle tripsin Aspire edin ve 2 mL RPMI % 15 içeren 1640 ekleyin nötralize etmek için FBS.
  4. Yavaşça yukarı ve aşağı, SH-SY5Y monolayer tamamen müstakil olana kuyunun, yıkama pipet.
  5. Hücreleri aracılığıyla hemasitometre saymak ve hücre konsantrasyonu 2 x 10 5 hücre/ml RPMI 1640 orta + 15 ekleyerek ayarlamak % FBS ve hücre süspansiyon için her şey bir 96-şey plaka, transfer 100 µL.
  6. Hücre kuluçka APPJ tedavi öncesi 12 h for ILIŞTIRIN hücrelere izin.

4. SH-SY5Y tedavisinde APPJ

  1. ayarlama kuvars meme arasındaki mesafe tüp ve nerede 96-şey plaka alınacaktır 3 cm. için platform sağlamak kiriş kültür orta yüzeyine dokunamaz.
    Not: Mesafe kalenin altından ölçülen değildir. İlk kuvars tüp başlığı ve 96-şey plaka yerleştirmek için kullanılan platform arasında 3 cm ayarlanır.
  2. APPJ tedavi öncesi, her şey kontrol wells dışında kültür ortamında RPMI 1640 glikoz orta değiştirin.
  3. APPJ başlığı altında tabak yerleştirin ve jets dikey olarak her kuyuya çekim yapabilirsiniz sağlamak.
  4. Tedavi hücreler için 0 APPJ ile ayrı Wells s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s ve 12 s.
    Not: APPJ helyum ( şekil 1) iyonize tarafından oluşturulur. Hücreleri glikoz yoksunluğu tarafından yaralı 4 tarafından kabul edilir s ve 8 s helyum akışı hücreleri helyum etkilerini ortadan kaldırmak için. Tüm tedaviler nüsha gerçekleştirilmelidir.

5. Canlılığı tahlil hücre

Not: Bu adımda orta değiştirmeyin.

  1. APPJ tedavi sonrası hücre kuluçka 1 h için hücreleri kuluçkaya.
  2. Her şey hücre sayım Kit-8 (CCK-8) çözüm eklemek 10 µL.
  3. 4 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya
    Not: SH-SY5Y hücre kültürünü glikoz yoksunluğu koşulları 12 ' ye duyarlıdır. Hücre canlılığı özellikler çalışmaları için optimum hücre canlılığı durumdur 1s glikoz yoksunluğu sonra yaklaşık % 50 azalır. CCK-8 yok sitotoksisite hücrelere bulunmaktadır ve hücreleri glikoz yoksunluğu koşullarda başka bir 4 h için CCK-8 reaktif ile hücre canlılığı kontrol etmek için APPJ tedavi sonrasında inkübe. Çünkü uzun süreli glikoz yoksunluk SH-SY5Y hücrelerinin ağır hasar liderliğindeki 8 h glikoz yoksunluğu ve APPJ tedavi sonra APPJ koruyucu etkisi önemli ölçüde azaldı. Sonra 24 saat glikoz yoksunluğu 11 canlı hücreler kanıtı yok oldu.
  4. 450 Absorbans ölçmek Mikroplaka okuyucu ile nm.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Veri en az üç bağımsız deneyler ortalama ± SD ifade edilir. Grup sonuçları için varyansı ANOVA kullanarak analiz edildi. Tüm analizleri p ve istatistiksel analiz yazılımı prizma kullanarak gerçekleştirilen < 0,05 istatistiksel anlamlılık için eşik yapıldı.

Hücre canlılığı CCK-8 kuluçka 4 h sonra ölçüldü. Şekil 3' te gösterildiği gibi glikoz yoksunluğu 44.1 ± kontrol grubuna kıyasla % 2.6 hücrelere SH-SY5Y canlılığı azaltılmış (normalde % 15 içeren RPMI 1640 ort...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

SH-SY5Y hücreleri bir insan Nöroblastom türetilmiş hücre satır ve bir uygun hücre modeli olarak nörotoksisite veya neuroprotection12 vitro araştırmalar yaygın olarak kullanılır. SH-SY5Y hücre kültürünü glikoz yoksunluğu koşulları için hassas. Hücre canlılığı özellikler optimum hücre canlılığı şartı çalışmaları için 1 h glikoz yoksunluğu sonra yaklaşık % 50 azalmıştır. Ayrıca, CCK-8 reaktif yok sitotoksisite hücrelere sahiptir ve hücreleri inkübe CCK-8 reaktif glikoz yoksunluğu koşullarda ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiçbir çıkar çatışmaları bu kağıt ile ilgili olarak ilan edildi.

Teşekkürler

Bu eser Pekin Nöroşirürji Enstitüsü (2014-11), Çin (NOS 11475019 ve 81271286) Ulusal Doğa Bilimleri temeli ve Pekin doğal Bilim Vakfı (No. 7152027) yenilik Fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SH-SY5Y hücre hattıÇin Tip Kültür Toplama Merkezi3111C0001CCC000026
RPMI 1640 ortaThermo Scientific218750914 ° C'de saklanır; C
RPMI 1640 orta glikoz içermezThermo Scientific118790204 ° C'de saklanır; C
fetal buzağı serumuThermo Scientific16000044-20 ° C'de saklanır; C
tripsin-EDTA çözeltisiSolarbioT13004 ° C'de saklanır; C
96 kuyu plakasıcorning3599
Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8)Dojindo LaboratuvarlarıCK044 ° C'de saklanır; C
mikroplaka okuyucuTecanM200 Pro450 nm Yüksek voltajda absorbansı ölçmek için
Güç Amplifikatörü TrekPD06087gücü yükseltmek için
Fonksiyon Sinyal ÜreteciMaZe Elektronik Bilimi ve Belirlisinyali sağlamak içinteknoloji AT30120
Yüksek & Sinyaligörüntülemek için yüksek voltajlıTektronixP6015A
, Dijital Osiloskop Tektronix DPO4104B algılamak için Voltaj Probu

Kaynaklar

  1. Yang, S. H., et al. Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots. Prog. Neurobiol. , (2015).
  2. Bhat, A. H., et al. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight. Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).
  3. Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction? Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).
  4. Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
  5. Yan, D., et al. Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment. Scientific Reports. 5 (5), 18339(2015).
  6. Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets. Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005(2012).
  7. Lu, X., et al. Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects. Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).
  8. Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. Guided ionization waves: Theory and experiments. Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).
  9. Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions. Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049(2016).
  10. Contestabile, A., Ciani, E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation. Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).
  11. Yan, X., et al. Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study. J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401(2017).
  12. Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  13. Tsutsui, C., et al. Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma. Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309(2014).
  14. Graves, D. B. Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review. Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücre Canlılık AnaliziHücre Sayım Kiti 8Helyum Akış HızıYüksek Gerilim AmplifikatörüNöroprotektif TedaviPlazma Tıbbı UygulamasıIn Vitro Protokol
Bir atmosferik basınç plazma Jet yeni uygulama SH-SY5Y hücrelerin glikoz yoksunluğu kaynaklı yaralanma karşı bir nöro-koruyucu ajan olarak
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.