$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hangi görüntüleme veri elde tüm hayvan iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tartışılan ve video makalede tasvir tüm hayvan iletişim kuralları British Columbia Üniversitesi hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. hazırlanması tümör hücreleri PuMA modeli için malzeme ve enjeksiyon için
Not: Çözümler ve hücre miktarı 1 fare için yeterli olacaktır. Daha fazla fare çalışmada kullandıysanız gerektiği şekilde büyütmek. Ortam için yemek tarifleri, Tablo 1 ve Tablo 2bakın.
- Bir Media 5 mL 15 mL konik tüp 37 oC su banyosu içinde önceden ısıtmak.
- Laboratuvar mikrodalga kullanarak % 1.2 düşük erime özel çözümde (steril su) eritin.
- 15 mL konik tüpe 5 mL de erimiş özel aktarım ve bir 37 oC su banyosunda sıcak tutun. 37 oC ve akciğer üfleme adım önce sıvı, erimiş özel olduğundan emin olun.
- Hücre kültürü grade 1 X kalem/strep nedense odamızda buz kovası ile takıma PBS önceden sakin 30 mL.
- 6-şey plaka bir kuyuda bir jelatin sünger B-medya 1,5 ml önceden ıslatın. Sünger akciğer dilimleri için destek çapa olacaktır.
- İşletim sistemi hücreleri yaklaşık % 70-90 emin olmak Konfluent yordamı gününde. Aşırı birleşmesi veya ortamdır hücreleri genellikle vurguladı ve canlılık bu noktada azalmış beri sarı turuncu olan hücreler kullanmayın. Osteosarkom hücre hatlarında, MNNG ve HOS, 5 x 105 ' te 100 μL hacmi 1 fare kuyruğu damar içine enjekte etmek için kullanılır. Daha fazla fare çalışma için kullanılmışsa buna göre lüks.
- % 0.25 tripsin-EDTA (3 mL T75 şişesi veya 10 cm kültür tabak 2 mL) kullanarak tümör hücreleri hasat. Ne zaman hücre tabağını kaldırın başlıyor, tripsin-EDTA ile komple bir medya etkisiz hale getirin. Hücreleri aşağı spin ve bir kez hücre kültürü sınıf PBS ile durulayın. Pelet PBS 5 mL resuspend.
- Bir hücre sayısı standart yöntemlerle gerçekleştirmek. Daha fazla hücre süspansiyon hücre süspansiyon kaybı sık sık iğne çizmek-up sırasında oluşur ve enjeksiyon girişimleri başarısız oldu çünkü aslında gereken şey daha yapmak en iyisidir.
- Trypan-mavi dışlama tahlil hücrelerin canlılık değerlendirmek için hücre süspansiyon bir örnek üzerinde gerçekleştirin. Yalnızca hücre % 90 canlılığı göster, devam veya daha yüksek.
- 100 μL hacmi 5 x 105 hücrelere enjekte. 2 X bu miktarın aşırı hazırlamak için 1 x 106 hücre aşağı döndü ve 0.2 mL HBSS resuspended.
- Hücre süspansiyon enjeksiyon için fareler hazırlarken bir buz kovası yerleştirin.
2. kuyruk ven enjeksiyon ve akciğer üfleme
Not: Çözümler ve bu bölümdeki hücrelerin miktarı 1 fare için yeterli olacaktır. Daha fazla fare çalışmada kullandıysanız gerektiği şekilde büyütmek. Ekipman, malzeme ve aşağıdaki adımlarda kullanılan cerrahi aletler listesi için Tablo 3 ve Tablo 4bakın.
- Dişi fare (yaş 6-8 hafta) 5 min için Isıtma lambası altında damar kuyruğunu gözle görülür daha belirgin hale getirmek için sıcak. Fare K7M2 veya K12 hücreleri için Balb/c fare kullanma; insan MG63.3, MG63, MNNG ve HOS hücreleri için ağır kombine immün yetmezlik fare kullanın.
- Hücre süspansiyon tüpü hafifçe sallayarak düzgün olduğundan emin olun. Dikkatle iğne olmadan 1 mL şırınga içine hücre süspansiyon kadar çizin. Kap bir 27 şırınga iğne ölçmek. İğne eğim iğne üzerindeki birim işaretleri olarak aynı tarafta olduğundan emin olun.
- Restrainer fareyi getirin ve kuyruk bir alkol bezle temizleyin.
- Bir kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirmek ve hücre süspansiyon 100 μL enjekte için devam edin. 5 dk sonra enjeksiyon, fareyi bir CO2 odaya yerleştirin ve ötenazi standart işletim prosedürü (anahat kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından) başlayıp. Yordamı nefes borusu zarar verir bu yana servikal çıkığı ötenazi aracı olarak kullanılmamalıdır.
- Bir kez fare ötenazi, laminar akış hood hazırlanması için özel/bir-media çözüm ile fare akciğerin üfleme başlar. Laminar akış başlık içinde steril pad ile bir çalışma alanı oluşturun. Bu yastık sterilize cihazlar, IV kateter, IV uzantısı küme ve yerçekimi perfüzyon aygıtlar ( tamamlayıcı şekil 1bakınız) yerleştirir.
- Fareyi sırt recumbancy getirin. Steril küçük makas ile göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için sternum dikkatle incelemek. Özel/bir-media çözümünü akciğer insufflate için kullanılan bu yana akciğer ponksiyon değil için dikkat ediniz.
- Her iki tarafta göğüs giriş geçmiş zaman göğüs kemiği anatomi, Trakea incelemek. Trakea uzak çevresindeki yumuşak doku dissekan tarafından maruz.
- Nefes borusu 20 gauge IV kateter ile cannulate. Gevşek cannulated Trakea etrafında steril akorduna dikiş kullanarak bir cerrahi düğüm.
- Bir IV uzantısı catheterized Trakea yerçekimi perfüzyon aparatı 10 mL şırınga ayarlanabilen iliştirin.
- Önceden ısıtılmış 37 oC özel (5 mL) ve bir-media (5 mL) 1:1 karışım içine birleştirmek. Sıvı özel/bir-media çözüm yerçekimi perfüzyon cihazın 10 mL şırınga dökün. Önce üfleme özel/bir-media çözüm ile akciğer uzantısı küme tüm uzunluğu özel/bir-media, böylece yanlışlıkla üfleme hava ile akciğer örneklerinin inkâr ile hazır olun.
- Özel/bir-media çözüm akciğer akciğer tam insufflated dolduramazsınız.
- Akciğer tam olarak insufflated bir zamanlar kanül çıkarın ve nefes borusu ile agarase/bir-media çözüme kaçağı önlemek için cerrahi düğüm sıkıca bağla.
- Göğüs boşluğu üzerinden (Trakea, kalp ve akciğer) Yiğitlik dışarı incelemek için devam edin. Değil delik için dikkat çekmek veya akciğer yüzeyine zarar verebilir.
- Yer (belirli hiçbir yönde) yiğitlik PBS önceden soğutulmuş 30 ml 1 X kalem/strep ile desteklenmiş ve 20 dk kuvvetlendirmek özel/bir-media sağlar.
- İyi makas ve şekil 1A' gösterildiği gibi akciğer (3 x 1.5 mm) küçük parçalar koparıp cımbız kullanarak. Küçük akciğer dilimleri kolayca 2.5 X amacı istimal yansıması. Genellikle 4-10 dilim grubu başına deneysel koşul birden çok dilim kesebilir.
Not: her deney grubu için B-medyada önceden ıslatılmış bir 2 x 2 cm jelatin sünger içeren akciğer dilimleri ayrı bir kuyuya (6-şey plaka) yerleştirin. Medya iyi ücret miktarı 1,5 mL olmalıdır. Medya her 2-3 gün değiştirin. İlaç araştırmaları için medya/uyuşturucu değişen belirlenen kullanıcı sıklığıdır.
3. Widefield floresan görüntüleme akciğer dilimleri ve analiz
Not: widefield floresan için (3 x 1.5 x 1 mm) akciğer Bölüm 1 Resim 2.5 X amacı istimal sığabilmesi için görüntüleme, daha küçük dilimler kesilir.
Resim alma widefield floresan mikroskop Tarih:
- Akciğer dilimleri genellikle 0, 3, 7 ve 14 gün sonrası enjeksiyon görüntüsü. Biyolojik kabine steril ortamda dikkatle akciğer dilimleri aktarım jelatin sünger bir steril 35 mm cam alt çanak yuvarlak. Akciğer dilim üzerinden aşırı sıvı kapalı olarak fazla sıvı bir ayna olarak hareket ve tümör hücreleri Floresan ışık yansıtacak kurulamak için dikkat ediniz.
- Şekil 1A' tasvir benzer bir şekilde akciğer dilimleri düzenleyin. Her sütun farklı bir deneysel durumu temsil eder. Çapraz-akciğerleri cımbız ile kirletmek değil kendine iyi bak. % 70 etanol ile durulayın ve akciğer dilimleri başka bir deney grubu üzerinden tutmadan önce kurumasını bekleyin.
- Görüntüleme parametrelerini optimize etmek (yani. kazanç, ofset, pozlama zaman, binning) arka plan Akciğer doku (tedavi edilmezse araç) denetiminde ve floresan tümör hücreleri arasında en iyi kontrast sağlayan grup. Kontrol grubundan aynı parametreler deneysel grupları görüntü için kullanın. TIFF görüntü formatında kaydedebilirsiniz.
- Bir ölçek başvurusu için aynı amacı bir mikrometre dijital bir resim çekmek.
- Akciğer auto-floresan zaman içerisinde değişen beri görüntü parametreleri denetim akciğerlere görüntüleme her oturum ayarlanması gerekir. Bir oturum için görüntüleme parametreleri mutlaka sonraki görüntüleme oturumlar için en uygun olmayabilir.
Görüntü analizi:
Not: Aşağıdaki görüntü işleme adımlarını ImageJ 1,51 h yazılım paketi 17ile yapılır.
- Bir görüntü dosyası ImageJ (şekil 3A) açın.
- Arka plan çıkarmak: işlem > arka plan çıkarmak > Rolling ball RADIUS (50 piksel başlamasıyla), "Işık arka plan" (şekil 3B) işaretini kaldırın.
- Resim 8-bit biçimine dönüştürme: Görüntü > türü > 8 - bit (şekil 3 c).
- Birimleri piksel olarak ayarlayın: Görüntü > Enter "Piksel" 1 "Piksel genişliği", "Piksel Yükseklik", "Voxel derinlik" uzunluğu birimi girin. Sonraki görüntülere uygulamak için "Global" onay kutusunu işaretleyin.
- Çokgen seçim aracını kullanarak, tüm akciğer dilim Şeklin anahattını ve toplam akciğer dilim alanının (piksel2) belirlemek. Bu değer yüzde tümör yükünü akciğerin hesaplamak için kullanılır.
- Eşik görüntü: Görüntü > ayar > eşik > "Varsayılan" ve "siyah-beyaz" vurgulamak > tümör hücrelerinin çoğunluğu doğru bir şekilde vurgulanmış şekilde eşik görüntü kaydırıcıyı kullanmak. "Uygula" tuşuna basarak bir siyah beyaz görüntü burada akciğer tüm siyah ve beyaz floresan lezyonlardir sonuçlanır (şekil 3D). İkinci kez "Uygula" tuşuna basarak tüm floresan yapıları şimdi siyah şekilleri (şekil 3E) nerede görüntü ters çevirmek.
- Miktar sayısını ve lezyonlar şeklinde:
Analiz > ölçümleri ayarla > kontrol "Alan". Tüm diğer kutuların.
Parçacıklar analiz > boyutu (piksel2): 0-Infinity ImageJ Numaralandırılacak şekiller aralığını temsil eder. Ampirik olarak gün 0 araç görüntüleri tek tümör hücresinde sayılan en küçük lezyon belirlemek. Bu tek tümör hücre alanının kalan görüntüler veri kümesi için alt sınır kullanın. Bu raporda sunulan çalışma için 11 piksel2 alt sınır ayarlanır. Video örnekte sunulan iş için 24 piksel2 alt sınır ayarlanır. "Döngü" aralığı 0-1 olarak bırakın. "Show" ayarlanabilir "Hiçbir şey". Alternatif olarak, "Göster" ve "Ana hatlarıyla" Seçili, tüm özetlenen şekillerin çizimi oluşturulur. "Göstermek-den sonuçlanmak" ayrı bir pencere açılır ölçümlerin denetleyin. İsteğe bağlı olarak, "yöneticisine Ekle" kutusunu kontrol sahip ilerisi için kaydedilebilir bir yatırım Getirisi Yöneticisi için sayısal şekiller kurtaracak. Tamam bastıktan sonra tüm numaralandırılmış şekillerin ve alan ölçüleri (şekil 3F) içeren bir "Sonuçlar" pencere açılır.
- Kopyalayabilir ve veri "Sonuçlar" penceresinden bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz. O belirli akciğer dilim için metastatik lezyonlar tüm alanlarında özetlemek için Excel'de topla matematiksel işlevini kullanın. Akciğer dilim yüzde akciğer tümör yükünü değerlendirmek için metastatik lezyonlar alanlara göre akciğer dilim toplam yüzölçümü toplamı bölün. Bu parametre de açıklanan alan kesir (birA) denir Underwood 18tarafından daha fazla.
Akciğer tümör yükünü metastatik lezyon alanları/toplam akciğer dilim alanının toplamı =
- Akciğer tümör yükünü kontrol grubu ve gruplar kalan akciğer bölümlere kalanında hesaplayın. Ortalama akciğer tümör yükünü grubu başına 0, 3, 7 ve 14 gün içinde arsa. Yüksek ve düşük metastatik insan OS hücre ilerici zaman noktalarda PuMA modelindeki büyüyen temsilcisi widefield floresan resimler (şekil 4A) gösterilir. Kat değiştirme (0 gün normalize) yüzde metastatik tümör yükünü zaman içinde gösterilen bir çizgi grafiği (şekil 4B) gösterilir.
4. confocal floresan görüntüleme PuMA modeli
Not: yansıması daha fazla ROIs için izin vermek için kesilmiş büyük akciğer dilimler (tam transvers kesitler, 1-2 mm kalınlığında) dışında confocal görüntüleme için doku işleme önceki bölümde buna benzer.
Akciğer parankimi ile DAR4M, etiketleme:
- Akciğer dilim içinde 10 μμM DAR4M (HBSS) olarak 37 ° C'de 45 dk için bırakın DAR4M hücreleri içinde reaktif azot türleri akciğer Etiketler.
- Taze HBSS akciğer dilimlerle, kuluçka 45 dk sonra yıkayın.
- Akciğer dilim bir 35 mm cam alt yuvarlak çanak ve confocal mikroskop görüntüsünde yerleştirin.
- Şekil 5 ' te gösterilen örnek görüntüler için görüntü parametreleri Tablo 5' te listelenen.
- İlgi bir bölge için bir Z-yığını elde etmek. Önerilen Z dilim kalınlığı Nyquist örnekleme için kullanın. Yeşil flüoresan OS hücreleri DAR4M etiketli akciğer dokusunda gösterilen bir 3B yığın temsilcisi bir film film 1 ve tamamlayıcı film 1sağlanır.
Şekil 5' te gösterilen örnek confocal görüntülerde görüntüleme oturumu terminal. Boyuna görüntüleme gerekiyorsa, yaşam için daha az duyarlilik olduğundan 2-Foton veya çoklu foton donanımlı confocal LSM mikroskop görüntüleme için kullanımı tavsiye edilir doku19,20.
Mito-RFP ifade MG63 hücrelerde PuMA modeli görüntüleme:
- PuMA iletişim kuralı olarak anahat içinde adım 1 ve 2 MG63 hücreleri mito-RFP yapı ifade kullanarak gerçekleştirin.
- Akciğer dilim bir 35 mm cam alt yuvarlak çanak ve confocal mikroskop görüntüsünde yerleştirin.
- Şekil 6 ' da gösterilen örnek görüntüler için görüntü parametreleri Tablo 6' da listelenir. Film 2 ve tamamlayıcı film 2yeşil flüoresan OS hücreleri floresan mitokondri sağlanan kırmızı ile gösterilen bir 3B yığın temsilcisi bir film.