Yöntem makalesi

Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için

DOI:

10.3791/56338

⸱

23 Ekim 2017

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Gunma University Graduate School of Medicine, 2Advanced Scientific Research Leaders Development Unit, Gunma University Graduate School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Malign tümörler ve normal dokuların IR etkileri anlamak için önemlidir. Burada, biz büyük modları IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü morfolojisi 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) üzerinde dayalı değerlendirmek için bir tek adımlı tahlil tarif-floresan mikroskopi tarafından görüntülenmiştir çekirdeği lekeli.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü IR Malign tümörler ve normal dokuların üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Burada, aynı anda IR, Yani, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma tarafından indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü büyük modları değerlendirmek için hızlı ve uygun maliyetli tek adımlı tahlil açıklayın. Bu yöntemde, bir kapak fişinde yetiştirilen hücrelerin x-ışınları ile ışınlanmış ve 4' ile 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lekeli. Floresans mikroskobu kullanılarak, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma DAPI lekeli çekirdeği karakteristik türleri Morfoloji üzerinde göre tanımlanır. Apoptozis apoptotik organları (Yani, yoğun ve parçalanmış çekirdeği) varlığı ile belirlenir. Mitotik felaket sergi iki veya daha fazla ayrı LOB ve micronuclei çekirdeği varlığı ile belirlenir. Hücresel yaşlanma yaşlanma ilişkili heterochromatic foci (Yani, nükleer DNA 30-50 parlak, yoğun foci içeren) varlığı ile belirlenir. Bu yaklaşım deneyci kolayca çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları, ve/veya zaman puan, hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve vade farkı şartları elucidating amacı ile kullanarak klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm modları için ekran sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İyonizan radyasyon (IR) çoklu modları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü neden olmaktadır. IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümünü araştırmaya IR toksisite normal dokulara anlamak için hem de kanser radyoterapi tedavisi etkinliğini artırmak için yöntemler geliştirmek için önemlidir. Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma IR1tarafından indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü büyük modları vardır. Apoptozis hücre ölümü DNA hasar1ile başlatılan düzenlenmiş bir moddur. Mitotik felaket Düzeltilmemiş DNA çift iplikli kırılmalara1ile sonuçlanan anormal mitoz nedeniyle oluşur hücre ölümdür. Hücresel yaşlanma geri dönüşü olmayan hücre büyüme tutuklama2bir devlet olarak tanımlanır; Not hücresel yaşlanma hücre ölümü başına değil, ancak bir modu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü senescent hücre klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar yaşama onuntemsilcilerini içindir.

Çeşitli hücre tabanlı deneyleri apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma ayrı ayrı değerlendirmek için geliştirilmiştir. Apoptozis Akış Sitometresi1tarafından terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick uç (tünel) etiketleme boyama, annexin V boyama, DNA parçalanma deneyleri ve alt-G1 hücre döngüsü aşama belirlenmesi tarafından tespit edilebilir. Mitotik felaket Mitotik işaretler için MPM2, tünel boyama ve elektron mikroskobu1de dahil olmak üzere, boyama ayirt tarafından tespit edilebilir. Hücresel yaşlanma yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) Boyama, büyüme-tutuklama deneyleri ve elektron mikroskobu1tarafından tespit edilebilir. Önemlisi, baskın modu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü hücre satırları ve tedavi ayarları3,4arasında farklı. Bu nedenle, belirli bir deneysel ayarı için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü genel profili aydınlatmak için tüm bu modu ölüm kapsayan birden çok deneyleri birlikte, işgücü ve maliyet yoğun olduğu yürütülmelidir.

Bu makalede, biz aynı anda apoptosis, Mitotik felaket ve IR3,4tarafından indüklenen hücresel yaşlanma değerlendirmek için hızlı ve uygun maliyetli tek adımlı tahlil tanımlamak. Bu yöntemde, bir kapak fişinde yetiştirilen hücrelerin x-ışınları ile ışınlanmış ve 4' ile 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lekeli. Floresans mikroskobu kullanılarak, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma her ilgili karakteristik türleri Morfoloji, DAPI lekeli çekirdeği üzerinde göre tanımlanır. Bu yaklaşım çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları ve hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve koşullarının araştırılması amacı ile zaman Puan klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri için tarama dahil olmak üzere uygulamaların yararlı olacaktır faiz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlık malzemeleri

  1. otoklav kapak notları.
    1. Bir cam kabı kapak paket fişi yerleştirin.
    2. Cam kabı folyo ile kapak.
    3. Otoklav 121 ° C'de 15 psi 20 dakika süreyle
    4. Kuru bir kültür başlıklı oda sıcaklığında 50 ° C. mağazasında.
  2. Hazırlamak fiksasyon çözüm: %3 paraformaldehyde + % 2 Sükroz içinde fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
    1. 700 mL PBS ve 30 g paraformaldehyde bir 1000 mL cam şişe ekleyin.
      Dikkat: Paraformaldehyde aşındırıcı, uygun eldiven giymek.
    2. Isıtma ile 80 ° C arasında bir mikrodalga kullanarak tarafından tamamen erime paraformaldehyde.
      Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir, maske takmak.
    3. Oda sıcaklığında gece bırakın.
    4. 20 g Sükroz ekleyin.
    5. Ekleme toplam Cilt 1 yapmak için PBS L.
    6. Aliquot 50 ml tüpler. Fiksasyon çözüm-20 ° C'de 3 yıldır veya 4 3 ay saklanabilir ° C.

2. Hücre kültürü hazırlanması

Not: Bu yordamları bir kültür mahallede gerçekleştirilmelidir.

  1. Kültür ve geçit U2OS insan osteosarkom hücreleri Logaritmik büyüme 5 korumak için.
    Not: Optimum ışınlama doz belirledikten sonra diğer hücre tipleri kullanılabilir.
  2. Kağıt havlu % 70 etanol ile nemlendirilmiş bir neşter silin. Neşteri, kullanarak bir 35 mm hücre kültür çanak üzerinde bir kapak notu yer (bundan sonra sadece olarak da adlandırılır " çanak ").
    Not: Bir tabak içinde kapak paket fişi numarası deneysel göre arttırılabilir (konuya bakın) Tasarla.
  3. Ekleyin 1 mL kültür medya: % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş DMEM.
    Not: Seçilen hücre türüne göre diğer medya kullanılabilir.
  4. Temizleme işlemi forseps kağıt havlu ile % 70 etanol ile nemlendirilmiş. Forseps kullanarak, yavaşça kapak notu ortasına tutun. Yemek kültürü ortamdan tamamen, bir tutun kapak notu üzerindeki koruyarak Aspire edin.
    ​ Not: Bu adımı immobilizasyon çanak için kapak fişinin teşvik.
  5. Yapisan kültürlü hücreleri tripsin 5 kullanarak ayırın.
    1. Çanak kültür ortamından Aspire edin.
    2. 1 mL PBS ekleyin ve çanağı hafifçe çalkalanır.
    3. Aspire PBS üzerinden yemek.
    4. Yemek için 1 mL tripsin [0.25w/v% tripsin-1mmol/M EDTA] ekleyin.
    5. Incubate % 5 CO 2 içeren bir ortamda 37 ° C'de 5 min için.
    6. Yemek için 9 mL kültür ortamı ekleyin.
    7. 1000 μL micropipette kullanarak bir tek hücre süspansiyon hazırlamak.
  6. 5 hücreleri saymak.
    1. 0.9 mL hücre süspansiyon ve 0.1 mL %0,4 1,5 mL tüp içinde ekleyin Trypan mavi çözüm.
    2. Bir hemasitometre için 10 geçerli μL.
    3. Sayısını inceleyin (Yani, canlı) hücreleri bir ters faz mikroskop altında günahı.
  7. 3 mL hücre süspansiyon kültürü medya bir yoğunluğu 0,5 x 10 5 hücre/mL, bir 15 mL tüp hazırlayın.
    Not: hücre yoğunluğu deneysel göre değiştirilebilir gerekir (konuya bakın).
  8. Yavaşça yemek için hücre süspansiyon 2 mL ekleyin.
  9. Gecede 37 ° C'de % 5 CO 2 içeren bir ortamda Incubate.

3. Işınlama

dikkat: x-ışını irradiator üreticiye göre dikkatle ele ' s yönergeleri.

  1. Hücreleri bir ters faz mikroskop altında incelemek. Hücreleri kapak kayma ve canlı bağlı onaylayın.
  2. 6 Gy x-ışınları ile çanak ışınlatayım (1.4 Gy/dk, 300 KVP, 20 mA).
  3. Incubate % 5 CO 2 içeren bir ortamda 37 ° C'de 72 h için.
    Not: Kuluçka zaman deneysel göre değiştirilebilir (konuya bakın) Tasarla.

4. Fiksasyon

  1. çanak kültür ortamından Aspire edin.
    2. 1000 μL micropipette ucu kesilmiş
  2. kullanma makas, ipucu sondan 5 mm.
    Not: Kesme ipucu sorunsuz fiksasyon çözümü uygulamak için yardımcı olur.
  3. Kesme ipucu kullanarak ekleyin 1 mL (1.2 adımda hazırlanan) fiksasyon çözüm yemek için yemek yan duvardan.
    Not: Bu adım zaman duyarlı ve bu nedenle birden fazla örnekleri işlerken micropipette ipuçları değiştirmeden yapılmalıdır. Uygulama fiksasyon çözümün çanak dibine doğrudan hücrelere zarar verebilir.
  4. Bir kare kültür tabak çanak yerleştirin. Yavaşça fiksasyon çözüm kapak slip üzerinde eşit olarak dağıtmak için kare kültür çanak sallamak.
  5. Oda sıcaklığında 10 dk Incubate.
  6. Aspire fiksasyon eriyik--dan yemek.
  7. Çanak yan duvardan yemek için PBS 2 mL ekleyin.
    Not: PBS uygulama doğrudan dibine çanağı hücreleri zarar verebilir.
  8. Aspire PBS üzerinden yemek.
  9. Yinele adımları 4.7 ve iki kez 4.8.
    Not: Çanak 4 ° C'de 1 hafta 2 mL PBS banyo kapak makbuzları ile saklanabilir.

5. DAPI boyama

  1. 5 μL 1 μg/mL DAPI boyama slayt kadeh uygulamak reaktif.
    Not: reaktif boyama DAPI 6 ay boyunca stabildir korunuyorsunuz ışık veya altında -20 ° c
  2. Bir neşter kullanarak kaldırmak kapak notu yemek.
  3. Kenarına bir kağıt havlu ile kapak fişinin dokunarak ile ilgili kapak formu aşırı PBS çizin.
  4. Montaj kapak fişi ters DAPI hücreleri reaktif boyama DAPI maruz kalır böylece slayt camına reaktif boyama damla üzerine.
    Not: Bu zamana duyarlı adımdır. DAPI kurutma reaktif boyama suboptimal boyama için açabilir.
  5. Örnekleri-ebilmek var olmak stok için 1 yıl, -20 ° c

6. Görüntü alma

  1. inceleyin örnek üzerinde floresan mikroskop. Çekirdeği görselleştirildiği DAPI filtresini kullanarak.
    Not: Ya bir 20 X 60 X Petrol mercek, araştırmacı göre kullanılacak ve ' s ilgi. Bir 60 X Petrol lens kullanırken, bir damla yağ üzerine kapak notu ekleyin. Örnekleri objektif dokunmayın dikkatli olun; Aksi takdirde, objektifin zarar.
  2. Çekirdek bir CCD kamera ve dijital görüntü alma yazılımı aşağıdaki ayarları ve parametreleri kullanarak görüntüleri: DAPI filtre, monolayer görüntüleri, kazanç 1 X ve otomatik pozlama.
  3. Bitiş görüntü edinme: 20 X objektif lens temizleyici nemlendirilmiş kağıt havlu ile silin. 60 X Petrol objektif kloroform ile nemlendirilmiş kağıt havlu ile silin.

7. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm modu değerlendirilmesi

  1. rasgele seçilen Albümdeki sayılan çekirdek sayısı 300 ulaşıncaya kadar apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için ölçütleri karşılayan çekirdeği saymak. Nüsha deneysel her ayar için bu adımda yapmak.
    1. Apoptosis ölçütlerini: apoptotik organları (Yani, yoğun ve parçalanmış çekirdeği) 6 , 7 varlığı.
    2. Ölçütü Mitotik felaket için: iki veya daha fazla ayrı LOB veya micronucl gösteren çekirdeği varlığıei 8 , 9 , 10.
    3. Hücresel yaşlanma için ölçüt: heterochromatic foci (SAHF) (Yani, nükleer DNA 30-50 parlak, yoğun foci içeren) yaşlanma ilişkili varlığı 2 , 11.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek olarak, U2OS insan osteosarkom hücreleri 6 Gy x-ışınları ile tedavi, 72 saat inkübe ve tahlil protokolüne göre boyama DAPI tabi. Şekil 1 gösterir apoptosis, Mitotik felaket ve 60 × petrol lens ile elde edilen hücresel yaşlanma ile ilgili tipik nükleer türleri Morfoloji için Yakınlaştırılmış görüntü. Adımları 7.1.1-7.1.3 karakteristik türleri Morfoloji klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü her modu için başvurun. Şekil 2 çekirdek bir 20 X lens ile elde edilen görüntülerin genel bakış gösterir. Işınlama 6 Gy x-ışınları ile indüklenen Mitotik felaket sık, daha az sıklıkla Apoptozis ve hücresel yaşlanma nadiren. Bu şekilde, muayene düşük-büyütme alanında bir bir bakışta klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profili verilen bir deneysel ortamda genel resim yakalamak izin verir. Şekil 3 gösterir quantified verileri grafik olarak gösterilmesi.

figure-results-1
Şekil 1: Yakınlaştırılmış DAPI lekeli çekirdeği apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma tipik türleri Morfoloji gösterilen görüntülerini. U2OS hücreleri 6 Gy x-ışınları ile ışınlanmış. 72 saat sonra hücreleri sabit ve DAPI ile lekeli. Nükleer görüntüleri bir 60 X Petrol objektifi kullanarak elde. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: hücre çekirdeği DAPI lekeli genel bakış görüntüler x-ışınları ile tedavi. U2OS hücreleri 6 Gy x-ışınları ile ışınlanmış veya sahte radyasyona maruz. 72 saat sonra hücreleri sabit ve DAPI ile lekeli. Çekirdeklerin görüntüleri 20 X lens ile elde. Daireler, Apoptozis; okları, Mitotik felaket. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için Quantified veri indüklenen x-ışınları ile tedavi hücrelerdeki. U2OS hücreleri 6 Gy x-ışınları ile ışınlanmış veya sahte radyasyona maruz. 72 saat sonra hücreleri sabit ve DAPI ile lekeli. Çekirdeklerin görüntüleri 20 X lens ile elde. Rastgele alanlar, toplam 300 çekirdeği apoptosis (Ap), Mitotik felaket (MC) ve hücresel yaşlanma (Sns) için değerlendirilmiştir. Değerlendirme nüsha gerçekleştirilmiştir. Ortalama değerler gösterilir ve hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol içindeki kritik adımlar aşağıdaki gibidir. DAPI lekeli çekirdeği morfolojik bir değerlendirme yapılması çok katmanlı hücreler için zor olduğu için ilk olarak, hücre kültür çanak üzerinde monolayer yetiştirilmeye. Bu amaçla, adım 2.9, dikkatli transferi kültür bulaşık kuluçka önerilir; Kültür fincan sallayarak konsantrasyonu hücre kültür yemeğin ortasına yol açar bir girdap askıya alınan hücre üretir. Buna ek olarak, çok katmanlı hücrelere önde gelen overconfluence-meli var olmak kaçmak. Bu amaçla, adım 2.7, kültür çanak üzerinde seribaşı hücre sayısı zaman ve ışınlama ve fiksasyon arasındaki süreyi iki katına popülasyon temelinde değiştirilebilir. Yaklaşık 80 fiksasyon zaman izdiham önerilir. İkinci olarak, hız fiksasyon ve DAPI boyama (Yani, 4 ve 5) önemlidir. Aşağıdaki adımları için geçen süre açısından arası örnek tutarsızlık heterojenite için morfolojik değerlendirme belirsiz çekirdekleri, DAPI sinyal şiddeti yol açabilir.

2.2. adımda kapak fişleri bir tek kültür tabak sayısı artırılabilir; En fazla dört kapak paket fişi bir 35 mm tabak içinde yerleştirilebilir ve sayısı daha da büyük yemekler kullanarak artırılabilir. Her kültür tabak içinde birden fazla kapak paket fişi yerleştirerek saat ders değerlendirmesi (örneğin, paket fişi bir kültür yemek ilgi teker teker birden fazla zaman noktalarda toplanabilir kapak) belirli bir tedavi için verimli çalışmasını sağlar.

3.2. adımda ışınlama doz araştırmacıların ilgi göre değiştirilebilir. Tutarlı bir doz uygulama için birden çok hücre hatları her modu hücre satırları arasında klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü için duyarlılık karşılaştırması sağlar. Öte yandan, ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz kullanımı her hücre satırı için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri hücre satırları arasında karşılaştırma sağlar. ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil12tarafından belirlenebilir. D10 değeri, % 10 klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma, sağlar doz ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz için ortak bir bitiş noktası olur.

Adım 3.3, saat ışınlama fiksasyon ile araştırmacıların ilgi göre değiştirilebilir; en yoğun zaman IR kaynaklı apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için hücre kültürünü ve tedavi göre değiştiğinden bu önemlidir. Bu makalede, biz 72 h sonra ışınlama klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri, bizim grup tabanlı üzerinde birden fazla çalışmaları başlangıç tarama için en yararlı olacaktır zaman noktası olarak kullanılan ve diğerleri aşağıda açıklanan1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) solid tümör çoğunlukla kurulan hücrelerde apoptoz X x-ray kaynaklı bir kaç gün sonra ışınlama oluşur. (ii) X-x-ray kaynaklı Mitotik felaket kanser hücrelerinde oluşur en belirgin ikinci veya üçüncü mitoz serbest bırakmak--dan geçici hücre döngüsü tutuklama sonra ışınlama tarafından indüklenen. Belgili tanımlık serbest bırakmak genellikle yaklaşık 24 saat takip ışınlama sonra ortaya çıkar yaklaşık 24 h (III) aralıklarla tekrarlanan mitoses tarafından X-ray-indüklenen hücresel yaşlanma söz konusu hücre kültürünü bağımlı bir zaman aralığından sonra belli olur: 2 gün sonra Işınlama için bazı erken durumlarda ve 7 gün sonra ışınlama çoğu hücre hatları için. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre genel bir resim ölüm profilleri üzerinden başlangıç tarama elde ettikten sonra zaman ders deneyler en yoğun zaman belirli hücre satır ve/veya durumu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü her modu için daha ayrıntılı bir aydınlatma sağlar faiz4.

Bu tahlil ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil boyama DAPI, radyasyon duyarlılık değerlendirmesi için altın standart yöntem değildir değiştirilebilir olması gerekmektedir. Apoptozis ve Mitotik felaket sadece son saat için. Böylece, bir zaman noktası için tahlil boyama DAPI Apoptozis ve değerlendirme zaman noktada oluşur Mitotik felaket algılar. Öte yandan, belirli bir zamanda noktası dahil toplam tutarı Apoptozis ve genellikle 10-14 gün sonra ışınlama gerçekleşmişti için kuluçka döneminde Mitotik felaket klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma sonuçlarını tahlil. Apoptozis ve Mitotik felaket, senescent hücreler farklı kültür çanak üzerinde kalır; onlar yavaş yavaş ışınlama sonra zamanla birikir. Bu nedenle, her ikisi de sonuçlarını tahlil ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil boyama DAPI kuluçka dönemi sırasında oluştu yaşlanma toplam tutarı yansıtır. Önemlisi, Apoptozis, Mitotik felaket ve ışınlama tarafından indüklenen yaşlanma oranı çok hücre göre farklılık gösteriyorsa çizgi ve ışınlama dozu. Birlikte ele alındığında, teorik olarak, bir tahlil sonuçlarını doğrudan o diğer tahlil çevrilemez.

Tahlil boyama DAPI birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, Mitotik felaket hücre ölümü farklı bir mod olup tartışmalı kalır. Radyasyon Biyoloji alanında, Mitotik felaket klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm1diğer mekanizmaları farklıdır IR indüklenen hücre ölümü büyük bir modu olarak kabul edilir. Öte yandan, diğerleri Mitotik o felaket hücre ölümü ancak13,14Apoptozis ve nekroz dahil olmak üzere hücre ölüm önce gelir bir süreç oldukça farklı bir mod değildir savunuyorlar. Böylece, Apoptozis ve Mitotik felaket bir ölçüde çakışabilir. İkincisi, önceki çalışmalar hücresel yaşlanma bazı hücre satırları ve tedavi ayarları2SAHF, yokluğunda meydana gelebilir öneririz. Her klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre için özel olarak tasarlanmış mevcut, diğer deneyleri, ölüm modu belirli bir deney sonuçlarını sağlamlığı artırmak için kullanılmalıdır. Üçüncü olarak, DAPI tahlil boyama modları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma (örneğin, nekroz ve autophagy) dışındaki değerlendirmek değildir. Dördüncü olarak, tümör yanıt radyoterapi için bir tahmin olarak tahlil boyama DAPI yarar klinikte aydınlatılmamıştır değil. Bu bakış açısından klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü toplam miktarı değerlendiriyor, klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil bir korelasyon SF2, hücreleri ile 2 Gy radyasyona maruz kalan kısmını arasında kurulan çünkü tahlil boyama DAPI üstündür X-ışınları ve radyoterapi15tümör yanıtı. Yine de, bu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil yaygın klinikte özellikle yüksek derecede uzmanlık ve zaman (Yani, 14 gün) uzun bir süre için gereklilik nedeniyle veri toplama için kullanılmaktadır değil ki dikkat çekicidir. Buna karşılık, yordamı tahlil boyama DAPI için basit ve önemli ölçüde sonuçlar üretmek için daha az zaman, yaklaşık 3-4 gün sürer. DAPI boyama yardımcı programıtahlil tümör yanıt radyoterapi için bir tahmin olarak klinikte yakın gelecekte test edilecektir.

Özetle, tahlil boyama DAPI aynı anda üç büyük modu IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirmek için bir düşük maliyetli tek adımlı tahlil olduğunu. Bu yaklaşım bir kolayca klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü için çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları ve zaman puan, modları hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve vade farkı şartları elucidating amacı ile için ekran izin verir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bayan Akiko Shibata teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser önde gelen Enstitüler, ağır iyon Therapeutics ve mühendislik Global liderleri yetiştirilmesi için programlar için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya dan Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
kapak kaymaMatsunamiC013001
paraformaldehitSigma-AldrichP6148-1KG
sükrozSigma-Aldrich84097-250G
fosfat tamponlu salinCosmo Bio16232000
neşterKai MedicalNo.20, 520-A
35 mm hücre kültürü kabıFalcon
tripsinWako201-16945
ters faz mikroskobuShimazu114-909
X-ışını ışınlayıcıFaxitron BiopticsFaxitron RX-650
kare kültür kabıCorning431110
sürgülü camMatsunamiPro-11
DAPI boyama reaktifiHücre Sinyalizasyonu8961S
floresan mikroskobuNikonECLIPSE Ni
floresan mikroskobu DAPI filtresiNikonU-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
floresan mikroskop lensi (20 kez;)NikonPlan Apo λ 20X/0.75
floresan mikroskop lensi (60 kez;, yağlı)NikonPlan Apo λ 60X/1.40 yağ
yağıOlympusN5218600
CCD fotoğraf makinesiNikonDS-Qi2
dijital görüntü elde etme yazılımıNikonNIS-Elements Belge
lensi temizleyiciOlympusOT0552
kloroformWako035-02616
353001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
  2. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
  3. Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588(2017).
  4. Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121(2014).
  5. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
  6. Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
  7. Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
  8. Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
  9. Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
  10. Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
  11. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
  13. Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
  14. Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950(2016).
  15. Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DAPI BoyamaApoptoz TespitiMitotik KatastrofH cresel Senesansyonize RadyasyonH cre l m ModlarN kleer Morfoloji AnaliziKlonojenik Analiz

İlgili makaleler