Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Summary

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Abstract

GABAergic kortikal interneurons heterojen bir nüfus eksitatör piramidal nöronların çıkışını düzenleyen hem de piramidal nöron topluluklar çıkışlarını eşitleme kritik rol oynarlar hücre vardır. İnterneuron işlevinde açıkları nöropsikiyatrik bozukluklar, şizofreni, otizm ve epilepsi gibi çeşitli karıştığı olmuştur. Embriyonik kök hücrelerden kortikal interneurons türetme sadece kendi geliştirme ve fonksiyon incelenmesi için izin verir, ama kortikal interneuron ile ilgili bozukluklar patogenezinde temel moleküler mekanizmaları görmemizi sağlar. İnterneurons da hayatta, göç ve bütünleşmek içine ana bilgisayar kortikal devresi sonrası nakli, yapım onları kullanmak için ideal aday hücre tabanlı terapiler için olağanüstü kapasitesine sahip. Burada, bir ölçeklenebilir, yüksek verimli, değiştirilmiş embryoid vücut monolayer yöntemi interneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl fare embriyonik kök hücreler (mESCs) üzerinden türetme için mevcut. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir mESC satırını kullanarak, Nkx2.1 ataları veya onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl olabilir (FACS) sıralama Floresans aktif hücre ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Ayrıca parvalbumin (PV) veya somatostatin için (SST) interneuron alt grupları, hangi-ebilmek var olmak yararlı kader tayini yönlerini çalışmak için veya kullanmak için alt grubu vitaminlerle zenginleştirilmiş interneuron yararlanacak terapötik uygulamalarda zenginleştirmek için yöntemler sağlar nakillerine.

Introduction

Fareler ve insanlar içinde kabaca tüm kortikal inhibitör interneurons (CIns) yarısı nerede medial ganglionic hazretleri (MGE) bilinen bir geçici subcortical yapısı içinde kaynaklanan neuroepithelial ataları, CIns ve diğer nöronal ve gliyal alt gruplar transkripsiyon faktörü Nkx2.1^1,2hızlı. CIn alt gruplar veya alt türlerinden kesişen morfolojik, nörokimyasal, Elektrofizyolojik ve bağlantı özellikleri^3,4tarafından tanımlanır. MGE elde edilen CIns gruplandırılabilir çoğunlukla üst üste alt gruplar PV veya SST, hangi ilişkilendirir belirli Elektrofizyolojik ve bağlantı eğilimler⁵ile ifade onların ifade dayalı. İşlev bozukluğu interneurons, özellikle o PV alt grubu içinde birden çok nöropsikiyatrik bozukluklar ve hastalıklar^6,7' karıştığı olmuştur. Bu yöntem genel amacı Mitotik ataları kök hücre kaynaklı ve göçmen öncüleri PV veya SST CIn kader kortikal interneuron biyoloji okuyan ve kullanılmak üzere hücre tabanlı terapiler için zenginleştirilmiş üretmektir.

İnterneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl mESCs gelen türetme ölçeklenebilir ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP kullanarak çift muhabir mESC kaplamak⁸, Nkx2.1 ataları ya da onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl FACS yolu ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Sinyal yolları bir dizi, kültür süresi ve neurogenesis modu manipüle ederek, biz fluorescently etiketli interneuron öncüleri aşağı akım uygulamaları bir dizi için uygun milyonlarca alabilirsiniz.

MESCs^{9,10,11,12,13,14}, Wnt üzerinde dayanır bizim yöntem MGE benzeri ataları oluşturmak için birkaç yöntem mevcut olmasına rağmen antagonist XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 telencephalic ataları ortak ifade oluşturma özellikle verimli. Buna ek olarak, interneuron ataları veya onların sonrası Mitotik Lhx6 ifade döl çift muhabir sistemimiz üzerinden seçin yeteneği büyük ölçüde farklı ataları ve onların döl üretmek için kapasite artırır.

Protocol

Not: Bu protokol için açıklanan çift muhabir mESC hattı (sande@mail.med.upenn.edu) istek üzerine sağlanmaktadır.

1. medyası hazırlama

Not: tüm medya hücre kültüründe kullanmadan önce 37 ° c sıcak.

1. Fare embriyonik Fibroblast (MEF) medya (hazırlığı 500 mL)
   1. Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) ve bir 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden 449 ml 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyin.
   2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. 1 ay veya aliquot ve ≤ dükkanında 4 ° C'de medya saklamak-20 ° c
2. N2 medya (hazırlığı 500 mL)
   1. 5 mL L-alanin-L-glutamin ekleyin (100 x) ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 489.5 ml DMEM: Besin karışımı F-12 (DMEM/F-12) ve 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden.
   2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) ve 5 mL N2 ek-B filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° c ilâ 1 ay boyunca karanlıkta saklayın.
3. (500 mL hazırlığı) serum-Alerjik büyüme orta (KSR)
   1. 75 mL serum-Alerjik orta ek, 5 mL L-glutamin ekleyin (100 x), 5 mL MEM sigara-esansiyel Amino asitler (MEM-NEAA) (100 x), ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 413.5 mL sigara-glutamin içeren DMEM ve filtre 500 mL 0,22 µm gözenek filtre birimi üzerinden.
   2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.
4. Fare embriyonik kök hücre medya (hazırlığı 500 mL)
   1. 75 mL kök hücre sınıf FBS, 5 mL MEM-NEAA ekleyin (100 x), 5 mL L-glutamin (100 x), ve 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) 413.5 mL sigara-glutamin içeren DMEM ve filtre 500 mL 0,22 µm gözenek filtre birimi üzerinden.
   2. 1 mL antimikrobiyal ajan (50 mg/mL) filtrasyon sonra ekleyin. Medya 4 ° C'de 1 ay veya aliquot ve ≤ mağazasında için karanlıkta saklamak-20 ° c

2. Kültür mESCs

1. Plaka mitotically etkin olmayan MEF besleyici hücreler MEF medya doku kültürü üzerine 3-4 x 10⁴ hücreleri/cm²tabak tedavi. En az 12 h onları mESCs kaplama daha önce bir hücre kültür kuluçka ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO₂ 37 ° C'de yerleşmek izin verir. Hemen değil kullandıysanız, her 3 günde MEF ortamı değiştirin. MEFs kaplama 7 gün içinde kullanılmayan eğer atın.
2. MESCs (1-4 x 10⁴ hücreleri/cm²yoğunluk aralığı) MEF plakaları fare lösemi inhibitör faktör (mLIF) (1000 U/mL) içeren mESC medya ekleyin. ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO₂37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
3. Geçiş tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) kullanarak mESCs (1:5-1:10) çanak olur sonra ~ % 70-80 birleşmesi veya koloniler dokunmaya başlıyor. Bu genellikle 2 günde ortaya çıkar, ancak ilk kaplama yoğunluğu bağlı olarak 4 veya 5 gün sürebilir.
4. MESCs mESC orta pluripotency tutmak için MEF besleyici katmandaki korumak.
5. Farklılaşma başlamadan önce en az bir kez üzerine jelatin kaplı plakaları olmadan MEFs sulandırmak için MEFs hücreleri geçiş.
   1. % 0.1 ekleyerek jelatin kaplı plakalar fosfat tamponlu tuz (PBS) ile Ca^{2 +}/Mg^{2 +} bir doku kültürü tedavi çanak içinde jelatin hazırlamak ve en az 1 h. plaka 1.5-2 x 10⁶ hücreler/10 cm tabak için 37 ° C'de bırakarak (2.7-3.6 x 10⁴ hücre/cm²) ve hücre farklılaşması başlamadan önce 2 gün boyunca genişletmek izin verir.

3. mESCs MGE benzeri Telencephalic ataları doğru ayırt

1. Farklılaşma gün (DD) 0 "hücreleri float" =
   1. MESCs büyüdü sonra jelatin kaplı levha 2 gündür medya Aspire edin ve PBS olmadan Ca^{2 +}/Mg^{2 +}bir kez hücrelerle yıkayın. Yeterli tripsin-plaka (tipik olarak 4 mL tripsin-EDTA bir 10 cm doku kültürü yemek için) yüzeyine kapak ve geri içine ≥95% bağıl nem ve % 5 CO₂ 37 ° C'de kuluçka makinesi 4 dk için hücreleri yerleştirmek için EDTA (% 0.05 tripsin) ekleyin.
   2. 4 dk sonra mESC medya ile 2 kez birimi kullanan tripsin-EDTA gidermek. Hücreleri bir uygun ölçekli santrifüj tüpü aktarmak ve hücreleri 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi. 5 dk sonra tüpü çıkarması ve medya Pelet bozmadan Aspire edin. BMP inhibitörü LDN-193189 içeren Pelet 1 ml KSR:N2 medya (1:1) resuspend (250 nM) ve Wnt inhibitörü XAV-939 (10 µM).
   3. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonu ölçmek. LDN-193189 içeren KSR:N2 medya (1:1) 75.000 hücre/mL ekleyerek olarak embryoid organları (EBs) hücreleri büyüyen Başlat (250 nM) ve XAV-939 (10 µM) yapışık olmayan doku kültürü yemekleri. ≥ % 95 bağıl nem ve % 5 CO₂37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
2. DD1 üzerinde "kaplama doku kültürü tedavi yemekleri ile Poli-L-lizin (10 µg/mL PBS ile Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) tarafından bir gecede açılış" hücre (O/N) ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de veya en az 1 h için hazırlayın.
3. DD2, Poli-L-lizin Aspire edin ve laminin (10 µg/mL PBS ile Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) ile plakalar ceket O/N ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de.
   Not: O/N optimal, gibi küçük ise 2 h yeterli olabilir. Tabak diğer gün kullanılmazsa, laminin Aspire edin, PBS ile Ca^{2 +}/Mg^{2 +}değiştirin ve 4 ° C'de 2 hafta için saklamak.
4. DD3 ("Kara hücreleri")
   1. EB ayrılma işlemine başlamadan önce laminin Aspire edin ve tabakaları bana izin tamamen kuru bir doku kültürü Hood. Parlak veya gözle görülür ıslak görünen plakaları kullanmayın. EBs medya ile 15 mL tüp ve 15 g x veya EBs pelleted kadar 3-4 dk santrifüj içine aktarın.
5. Medya Aspire edin ve 3 mL Dnaz içeren hücre dekolmanı çözümü ekleyin (2 U/mL) ve ≥ % 95 bağıl nem ile 37 ° C'de kuluçkaya ve % 5 CO₂ 15 dakika süreyle yavaşça EB ayrılma yardım için tüp her 3 dakikada fiske.
6. EBs artık görünür veya 15dk geçen kez Dnaz içeren 6 mL KSR:N2 (1:1) eklemek (1 U/mL) ve 200 x g de 5 dk santrifüj.
7. KSR:N2 (1:1) LDN-193189 içeren hücrelerde plaka (250 nM), XAV-939 (10 µM) ve ROCK inhibitörü Y-27632 (10 µM) 4.5-5 x 10⁴ hücreleri/cm².

4. SST zenginleştirici Protokolü: "DD12 GFP yüksek Sonic Kirpi (SHH)" (Adım 3.7 devamı)

1. DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve SSH (50 ng/mL).
2. Gün 8 (Adım 4.4) yeniden kaplama için doku kültürü tabak hazırlamak 3.2-3.3 adımlarda açıklanan yönergeleri kullanarak.
3. DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve ŞŞŞ (50 ng/mL).
4. DD8 üzerinde hücreleri yeniden plaka.
   Not: Bu adım gerekli değildir, ancak hücreleri yeniden kaplama erken farklılaşmış, istenmeyen hücre tipleri azaltabilir. Yeniden kaplama aynı zamanda aşağı akım immunohistokimyasal analizleri yapmak zor hücre topları keser ve sonraki zaman noktalarda FACS verimliliğini artırır.
   1. Hücreleri yeniden plaka, plaka ile tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin) hücrelerden ≥95% bağıl nem ve % 5 CO₂37 ° C'de 5 min için ayırmak için. KSR:N2 ile 2 kez birimi kullanan tripsin-EDTA gidermek ve 5 dakika süreyle 200 x g, santrifüj filtre hücreleri herhangi bir kümeleri kaldırmak için 40 µm filtre tüpünden. FGF-2 içeren hücreler 250.000 hücreler/cm² N2/KSR (1:1)'de yeniden plaka (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) ve Y-27632 (10 µM) ŞŞŞ ile (50 ng/mL).
      Not: Bunun yerine, karar DD8 sayfasındaki hücreleri yeniden plaka değil yaptıysanız, medya ŞŞŞ içeren KSR:N2 ile değiştirmek (50 ng/mL) DD12 DD7 her 2 gün ve IGF-1 eklemeye devam edin (20 ng/mL) ve FGF-2 (10 ng/mL) DD9 kadar.
5. DD10 üzerinde medya ŞŞŞ içeren KSR:N2 ile değiştirmek (50 ng/mL).
6. DD12 üzerinde SST alt için zenginleştirilmiş hücreleri elde etmek için FACS Lhx6::GFP belirlemek için kullanın-sadece hücreleri ifade.
   1. Hücreleri ayırmak için bir sigara tripsin içeren hücre-ayrılma reaktif tripsin-EDTA yerine kullanın. Hücreleri bir kez PBS olmadan Ca^{2 +}/Mg^{2 +}ile yıkayın. Dnaz içeren önceden ısıtılmış tripsin sigara içeren hücre-ayrılma reaktif ekleyin (2 U/mL) hücreleri. Kuluçka makinesi 10-30 dk ya kadar hücreleri bağlantısız ≥95% bağıl nem ve % 5 CO₂ 37 ° C'de yer onları. Yavaşça plakaları her 5 dk ayrılma yardım için dokunun.
      Not: DD11-12 kültürler için sadece 10-15 dk gerekli olabilir. DD15-16 kültürler için 30 dakika veya daha fazla tam ayrılma için gerekli olabilir.
   2. Hücreleri tamamen tabağını kaldırdı, standart protokolleri kullanarak FACS izolasyon için ilerlemek veya diğer aşağı akım analizleri hücrelerdeki kullanmak.

5. PV zenginleştirici Protokolü: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi"--dan adım 3.7 (devamı)

1. DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).
2. DD8 yeniden kaplama için doku kültürü tabak hazırlamak (Adım 4.4) kullanma yönergeleri özetlenen adımlar 3.2-3.3.
3. DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).
4. DD8 üzerinde hücreleri aşağıdaki istisnalar 4.4. adımda açıklandığı gibi yeniden plaka: hücreleri yeniden kaplama, ŞŞŞ ile smoothened agonist yerine (SAG; 30 nM) ve atipik PKC inhibitörü (aPKCi; 2 µM) ekleyin. Birlikte, yeniden hassasiyette medya ele alındığında şimdi N2/KSR (1:1) FGF-2 içeren (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) ve aPKCi (2 µM).
5. DD10 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin.
6. DD11
   Not: Bu noktada, Nkx2.1::mCherry+ hücreleri PV CIns olmak için zenginleştirilmiş.
   1. 4.6. adımda belirtilen aynı iletişim kuralını kullanarak FACS için plaka hücrelerden ayırmak. Karar daha sonra bir farklılaşma gün Nkx2.1::mCherry+ hücreleri toplamak için bu adımı dikkate almayın.
7. DD12 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD14 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD16 üzerinde medya aPKCi (2 µM) içeren KSR:N2 ile değiştirin. DD17 üzerinde 4.6. adımda belirtilen aynı iletişim kuralını kullanarak Nkx2.1::mCherry+ hücreleri toplamak.

6. PV zenginleştirici Protokolü: "DD17 mCherry düşük ŞŞŞ" (Adım 3.7 devamı)

1. DD5 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL). DD7 üzerinde FGF-2 içeren medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirmek (10 ng/mL) ve IGF-1 (20 ng/mL).
2. DD9 üzerinde medya KSR:N2 (1:1) ile değiştirin. Bu noktadan itibaren hiçbir ek büyüme faktörleri gereklidir.
   1. 2 günde DD17 hücrelerdeyse hasat kadar medya değiştirmeye devam.

Results

Bu raporda açıklanan iletişim kuralı bizim yayımlanmış protokolleri^15,16,17 değiştirilmiş bir versiyonu ve Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir mESC hattımız ile kullanım için optimize edilmiştir. DD0-5 DD8 yeniden kaplama ile birlikte, Wnt inhibitörü XAV-939 ekleyerek neyin yukarı tüm DAPI + çekirdeği kültüründe % 50'si de Nkx2.1 (şekil 1A, B) ifa...

Discussion

Bu yöntem J1 kaynaklı mESCs (SCRC-1010) desenlendirme son derece etkili olmakla birlikte, diğer mESC çizgileri ve klonal yalıtır değişken başarı yaşadım. Örneğin, Foxg1::venus mESCs (EB3 kaynaklı; Danjo vd. ¹³) yanıt kötü bu protokolü ve Foxg1 indüksiyon DD12 tarafından genellikle sırasına % 1-2 olur. Tam olarak anlamıyorum nedeniyle, aynı anda (JQ27 denir) Bu protokol için açıklanan satır olarak izole edildi (JQ59 denir) başka bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir klon üretir az %1 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Şişe üstü vakum filtre sistemi	Corning	CLS430769
Hücre Süzgeci Geçmeli Test Tüpü	Geçmeli Kapaklı ThermoFisher	Corning 352235
Fare embriyonik fibroblastları (CF-1, MEF, IRR 7M),	MTI-Globalstem	GSC-6101G	, dört adet 10 cm'lik TC plakası için 1 şişe 7M MEF yeterlidir. Referanslar: 29,35
FBS	Atlanta Biologicals	S11150H
Primocin	Invivogen	Ant-pm-2	Antimikrobiyal ajan olarak da bilinir. Temel ortamla filtrelemeyin - filtrelemeden sonra ekleyin. Referanslar: 9,11,36,37
N2 supplement-B	Stemcell Technologies	7156	Temel medya ile filtreleme -- ekle filtrasyondan sonra
Glutamax (100x)	ThermoFisher	35050061	L-alanin-L-glutamin olarak da bilinir. Referanslar: 9,11,38,39
KnockOut Serum Değiştirme (KSR)	ThermoFisher	10828028	Serumsuz medyum takviyesi olarak da bilinir. Referanslar: 9,11
L-glutamin (100x)	ThermoFisher	25030081
MEM-NEAA (100x)	ThermoFisher	11140050
2-Merkaptoetanol	ThermoFisher	21985023
KnockOut DMEM	ThermoFisher	10829018	Glutamin içermeyen DMEM olarak da bilinir. Referanslar: 9,11
Hyclone FBS	VWR	82013-578	Kök hücre sınıfı FBS olarak da bilinir. Referanslar: 9,11
Doku kültürü uygulanmış tabak (10cm)	BD Falcon	353003
Yapışmayan steril petri kabı (10cm)	VWR	25384-342
Lösemi inhibitör faktör (mLIF)	Chemicon	ESG1107	Dondurmayınız, 4°C'de saklayınız. Referanslar: 9,11
DMEM/F12	ThermoFisher	11330032
%0.1 Jelatin Çözeltisi	ATCC	ATCC PCS-999-027
Laminin	Sigma	L2020
Poli-L-lizin	Sigma	P6282
Tripsin-EDTA (% 0.05)	ThermoFisher	25300054
Accutase	ThermoFisher	A1110501	Tripsin içermeyen hücre ayrışma reaktifi olarak da bilinir. Referanslar: 9,11
RQ1 RNaz İçermeyen DNase	Promega	M610A
LDN-193189	Stemgent	04-0074	DMSO'da yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın
XAV939	Stemgent	04-0046	DMSO'da yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın
rhFGF-2	Ar-Ge D Systems	233-FB	%0.1 BSA ile PBS'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık
rhIGF-2	R& D Systems	291-G1	0.1 BSA ile PBS'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°
ROCK inhibitörü (Y-27632)	Tocris	1254	DMSO'da yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın
Düzleştirilmiş agonist (SAG)	Millipore	566660-1MG	H20'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık alikotlarda -80°C'de saklayın rm
Sonic Hedgehog/SHH	R& D Systems	464-SH-025	0.1 BSA ile PBS'de yeniden askıya alın ve tek kullanımlık PKC & zeta alikotlarında -80 ° C'de saklayın
; Psödosubstrat İnhibitörü, Miristoillenmiş	EMD Millipore	539624	H20'de yeniden süspanse edilir ve tek kullanımlık alikotlarda -80 ° C'de saklanır