Yöntem makalesi

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

6.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56398

⸱

2 Mart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Bu makalede

Özet

Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.

Özet

Heterochromatin eklenen reporter genler kullanarak ileri genetik ekranlar kapsamlı model organizmalar epigenetik kontrol mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs) ve kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) gibi teknolojiler böyle ekranlar diploit memeli hücrelerinde etkinleştirdiniz. Burada bir fare hücre satırı ile ateş böceği luciferase kullanarak x kromozomu inactivation (XCI), düzenleyiciler için bir büyük ölçekli shRNA ekran açıklamak ve hygromycin direnç genleri içinde metil CpG bağlayıcı protein C-terminus adlı 2 (MeCP2) gen çaldı etkin olmayan x kromozomu üzerinde (XI). Muhabiri hücre kültürünü inşa reaktivasyonu sağkalım avantajı hygromycin B seçimi, büyük shRNA kitaplık ekranı ve onların sonrası seçim zenginleştirme kullanarak ölçerek muhabir yeniden saç tokaları tanımlamak olanaklı kılar altında doğan yeni nesil sıralama. Zenginleştirilmiş saç tokaları sonra tek tek XI luciferase kahramanlarına etkinleştirmek için yeteneklerini sınayarak geçerliliği.

Giriş

Bir kadın, Rett sendromu, kalıtsal akıl bozukluğu en yaygın formları be neden yanında MeCP2, normal nöronal fonksiyon1için önemli bir protein kodlar bir x kromozomu gen heterozigoz mutasyonlar. Bu hastalık1, , bir fare modeli nörolojik açıkları tersine çevirmek için restorasyon MeCP2 ifadesinin gösterildiği bu hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım vahşi tipi MeCP2 alleli Xi üzerinde reaktivasyonu olacaktır 2 , 4. ancak, bir iki X kromozomları dişi hücrelerdeki epigenetik susturmak sıkı bir organizma3,4ömrü muhafaza ve sağlam bir Xi gen reaktivasyonu büyük olasılıkla büyük bir gerektirir birden çok epigenetik yasal yolları bozulma.

Biz faktörler MeCP2 damping bakım için gerekli belirlemek için önce MeCP2- luciferase - hygromycin direnç gen füzyon (MeCP2-LUC-HR) birinde iki X kromozomu taşıyan bir transgenik fare modeli geliştirildi (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Her ne kadar füzyon yapı ifade MeCP2 kararsız ve işlevi, phenotypically taklit eden MeCP2 silme (XMeCP2-LUC-HR/y) hemizygous erkeklerde, muhabir gen ifade kaybına neden olduğu ortaya çıktı kolayca algılanabilir bir desen endojen MeCP25ifadesi ile tutarlı oldu. Daha sonra ölümsüzleştirdi fibroblast klonlar etkin olmayan veya active x kromozomu üzerinde yapı ile oluşturulan ve o eski vahşi türü MeCP2 ve değil muhabiri yapı ifade doğruladı; tersini ikincisi için doğruydu. Gen susturmak, iptal etmek için bilinen Ajan demethylating bir DNA için 5-azacytidine (5-AZA), maruz kaldığında Xi ("muhabiri hücre") muhabiri hücre bizim yapı yeniden gösteren bir bioluminescence tahlil etkinliği kazandı ve bu nedenle genetik tarama için kullanılan.

Biz sonraki yüksek üretilen iş genetik bir ekran MeCP2 damping düzenleyiciler için geliştirilmiştir. Muhabiri hücre kültürünü ilk içeren bir retroviral kütüphane ile enfekte > 60.000 farklı shRNAs hedefleme > fare genom5,6, boyunca 25.000 genler ve sonra hygromycin B seçime tabi. Saç tokası frekans içinde ön karşılaştırıldı ve sonraki nesil sıralama kullanarak sonrası seçim örnekleri, muhabir olarak yeniden etkinleştirme büyüme avantajı hygromycin B seçimi altında doğan ve sorumlu saç tokaları zenginleştirme sonuçlandı. Bu yaklaşımı kullanarak, biz 30 genler susturmak MeCP2 içinde karıştığı tespit ve sonra bulgular muhabiri hücre bireysel saç tokaları ile transducing ve luciferase faaliyetlerini ölçme doğruladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm adımları Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış protokolleri kullanılarak yapılmıştır. Burada kullanılan hiçbir reaktifler 5-azacytidine (5-AZA) dışında önemli insan sağlığı risk teşkil olduğu bilinmektedir.

1. bir muhabiri hücre satırıyla MeCP2- LUC-HR transgene Xi üzerinde oluşturma

  1. Gelen kadınMeCP2-LUC-HR /X X fare tendon fibroblastlar hazırlanıyorMeCP2 fare
    1. 10-12 gün ötenazi-MeCP2-LUC-HR/X X eski erkekMeCP2 fare.
    2. Düz diseksiyon makası kullanarak, proksimal kuyruk kısmı deri yoluyla çevresel bir kesi yapmak.
    3. Karkas kuyruk yakın tutarak, Cilt uzak kuyruk fibrocartilaginous bölümünü ortaya çıkarmak için fareyi çekin. Kaldırmak ve terminal 10 mm maruz doku 1 mm uzun parçaları cerrahi neşter kullanarak kesti.
    4. Parçalanmış doku 15 ml konik tüp içeren 5 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (1 U/mL penisilin, 1 µg/mL streptomisin ve 1.5 mg/mL collagenase, ile desteklenmiş DMEM) transfer 0,45 µm ve sonra 0.2 µm kafes filtreler önceden filtre. Sürekli rotasyon ile 37 ° C'de 3-4 h için kuluçkaya.
    5. Santrifüj örnek 500 x g de oda sıcaklığında 10 dakika süreyle 10 ml % 10 fetal sığır serum, 1 U/mL penisilin ve 1 µg/mL streptomisin (DMEM-10) ve bir 6-iyi doku kültürü plaka üzerinde plaka ile takıma DMEM Pelet Resuspend. Hücreleri bir kez geçiş ve bir sonraki adıma devam etmeden önce bir 10 cm tabak için genişletin.
    6. Hücreleri HPV-16 viral oncogenes (E6/E7),7daha önce açıklandığı gibi taşıyan bir ifade vektör ile bir iletim gerçekleştirerek ölümsüzleştirmek.
  2. Tek hücre klonlar seçerek ve MeCP2 muhabir ifade karakterize
    1. Bir 10 cm tabak hücrelerden hasat. İlk olarak, medya Aspire edin, % 0.05 tripsin-EDTA 1 mL ekleyin ve 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 9 mL ile gidermek ve 15 mL konik tüp resuspended hücreleri toplamak.
    2. Hücreleri seyreltik DMEM-10 son konsantrasyonu 1 cep/100 µL. Transfer ile 96-şey plakaları için süspansiyon pipetting 100 µL tarafından her kuyuya.
    3. Kuyuları birleşmesi, hangi-ebilmek almak ilâ 2-3 hafta kadar 37 ° C'de kuluçkaya. Ortamı her 3-5 günde taze DMEM-10 ile değiştirin. Konfluent ne zaman, % 0.05 tripsin-EDTA iyi başına 20 µL hücrelerle seferber ve onları iki yinelenen setleri 96-şey bölünmüş.
    4. Luciferase etkinlik için tahlil için bir tabak kümesi kullanır. Medya kaldırma gerektirmeyen bir homojen ateş böceği luciferase tahlil Paketi'ni kullanabilirsiniz. Kit ile birlikte protokol izleyin.
    5. Adım 1.2.4 sonuçlarından klonlar hiçbir tespit luciferase etkinlik ile plakaların kalan kümesinden seçmek için kullanın. Bu klonlar 24-şey ve sonra 6-iyi plakaları için genişletin.
    6. Aynı yüksek luciferase aktivite ile bir klon için gerçekleştirmek; Bu olumlu bir denetim olarak doğrulama amacıyla kullanılacaktır.
    7. Bir aliquot her şey bir Western blot 6-şey plaka hasat. 200 µL % 0.05 tripsin-EDTA hücrelerle seferber. 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 ile 2 mL gidermek ve hücreleri yarısı 1,5 ml santrifüj tüpü için transfer. Bir kez PBS içeren hücreler için Western blot lysing önce yıkayın. Alternatif olarak, hücrelerin yarısı başka bir 6-şey plakasına aktarın. Hücreleri plaka altına iliştirdiğinizde, PBS ile durulayın ve Western blot için koşullar.
    8. Gerçekleştirmek bir Western blot luciferase pozitif hücreler vahşi tipi MeCP2 active X kromozomu; dan ifade yok iken luciferase negatif hücreleri, hızlı olduğunu onaylamak için anti-MeCP2 antikor ile yukarıda açıklanan protokol8izleyin. Beyin dokusu herhangi bir vahşi türü fare lysate olumlu bir denetimi kullanın.
    9. 2 x 105 hücreleri/iyi bir 6-şey tabak içinde birkaç negatif klonlar plaka. Bir kez 10 µM 5-AZA ile tedavi, medya değiştirmeden 72 h için kuluçkaya ve 1.2.3. adımda açıklandığı gibi luciferase etkinlik için tahlil.
    10. 5-AZA ile luciferase etkinliğini kazandı ve birden çok 10 cm tabak için genişleyen başlayan negatif bir klon (Xi klon) seçin. Kalan negatif klonlar yedek olarak sıvı azot dondur. Pozitif klon (Xa klon) doku kültürü tutulmaz veya daha fazla kullanılmasını kadar donmuş.

2. eleme kitaplık için hygromycin B seçimini kullanarak yeniden etkinleştirme

  1. Test klon bulaşmasını, seçim uygulama ve DNA sıralama için hasat
    1. Retroviral yapıları tokalar shRNA kitaplıktan ifade, viral konsantreleri elde etmek veya konsantre viral süpernatant ile istenen kütüphane dahil iletişim kuralını kullanarak üretmek.
    2. Belgili tanımlık perde ile devam etmeden önce (varsa GFP işaretleyici kullanarak) Kütüphane titre. Amaç enfeksiyon arasında 0,3 ve 0,5 çeşitliliği için.
      Not: yanlış pozitif oranları en aza indirmek için en az dört bağımsız ekranı gerçekleştirin. Saç tokaları yeterli gösterimi korumak ve rasgele terkinin9önlemek için kitaplık 100-fold kapsama almak için ekran başına 20 tabak kullanın. Ancak, pozitif seçim ekranı ve bir büyük kütüphane boyutu göz önüne alındığında, bu bir alt kapsam yeterli olacaktır muhtemeldir.
    3. Sabah, 1 x 106 XI hücreleri 10 cm doku kültürü plakalar üzerine plaka.
    4. Öğleden sonra taze DMEM-viral süpernatant ve 5-10 µg/mL polybrene içeren 10 ile medya değiştirerek plakaları bulaştırmak. 2.1.2. adımda belirlenen viral süpernatant miktarda kullanın.
    5. 18-24 h sonra medya Aspire edin ve 10 mL taze DMEM-10 her plaka için ekleyin. Kültür başka bir 48 saat için.
    6. Sabah, 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA plaka başına kullanarak hücreleri seferber ve plaka başına 9 mL DMEM-10 ile gidermek. Süspansiyon 100 µm gözenekli filtre çalıştırmak. Filtre uygulanmış süspansiyonlar birlikte havuz ve 1 x 106 hücreler/plaka iki setleri 10 cm temel olarak belirler.
    7. Öğleden sonra DMEM-10 ile 15 µg/mL hygromycin B (0 gün) içeren bir küme plakaların ortamı değiştirin. Diğer küme taze DMEM-10 ile sadece ortamı değiştirin.
    8. 48 saat sonra 1 ml % 0.05 tripsin-EDTA kullanarak plakaları tedavi edilmezse kümesi hücrelerden seferber. 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 9 mL ile gidermek. Hücreleri 15 ml konik boru ve santrifüj 500 x g de oda sıcaklığında 5 dakika aktarın. Supernatants Aspire edin ve hemen DNA çökeltilerini ayıklanması ile devam edin. Alternatif olarak, hücre Santrifüjü adım önce büyük tüpler içine havuz.
    9. Fenol ve chroroform karışımı kullanarak DNA ayıklamak ve yukarıda açıklanan10olarak sodyum asetat ve soğuk etanol ile DNA çökelti. Bireysel ön seçim DNA örnekleri havuz ve -20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
    10. Hygromycin B seçimi 4 gün daha ayarla kültür devam edin. Taze DMEM-10 içeren hygromycin B seçimi ortamla 2 gün sonra doldurmak.
    11. Gün 7, taze DMEM-10 ile sadece seçim ortamı değiştirin. 2-4 gün kurtarma için izin ve sonra hücreleri 2.1.8 adımda anlatıldığı gibi hasat. DNA ekstraksiyon ile 2.1.9. adımda anlatıldığı gibi devam edin.
  2. Sonrası seçim örneklerinde zenginleştirilmiş saç tokaları tanımlama
    1. Kullanım 5' bağlam (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') ve 3' döngü astar ters (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') yarı-tokalar öncesi ve sonrası seçim DNA örneklerinden yükseltmek için. Tüm ayıklanan DNA ayrı PCR reaksiyonları 100-200 ng ile DNA'ın tepki başına kullanın.
      Not: Bu 5' bağlam astar ve 3' geriye doğru döngü astar miR-30 bağlam dizisi shRNA ucun upstream ve shRNA döngü, sıra sırasıyla karşılık gelir. Farklı Kitaplıklar farklı oligos gerektirir. Arıtma adımları farklı ürün boyutları gerektiği gibi izole etmek için ayarlayın.
    2. Astar ve genomik DNA kaldırmak ve PCR ürünleri arasında 100 ve 200 bp. kurtarmak için kullanım Boyut seçim boncuk boncuk ile dahil Protokolü izleyin.
    3. Yarı-saç tokaları sıralamak için sıralama kitaplığı hazırlayın. Ekran başına en az 50 milyon okuma oluşturmak. Sıralama kiti ve tesisler için uygun iletişim kuralı izleyin.
      Not: ekran başına 50 milyon okuma sağlar 1000-fold her shRNA kütüphanede gösterimi ve yeterli gösterimini sağlayan yaklaşık 10 kat kapsama (her shRNA 100-fold gösterimi yürütülen) her bağımsız enfeksiyon Her enfeksiyon olay.
    4. Mükemmel maçlar sıralarıyla sayar bir Perl komut dosyası kullanarak her shRNA numaralandırır. Daha fazla çözümleme için disindan havuzunda en az 10 okuma vardı shRNAs açmadı. Oranları için ön sonrası sayar ve yanlış bulma oranı (FDR) 1000 permütasyon temelinde belirlemek gibi enrichments hesaplama. ShRNAs ile tarafından hedef genlerin açmadı < %5 olarak FDR "hits" daha fazla test için.

3. tanımlanan tokalar ("sayısı") doğrulanıyor

  1. Belgili tanımlık perde içinde tanımlanan shRNAs içeren ambalaj lentiviruses
    1. 10 cm tabak tabak başına tohum 8 x 106 293 FT hücre.
    2. Ertesi gün, antibiyotik-Alerjik DMEM-10 plaka başına 9 mL ile ortamı değiştirin; transfection önce bu 30 dakika var.
    3. 30 dakika aralığında iki karışımları transfection için hazırlayın:
      1. Mix 1 hazırlamak (plaka/shRNA; shRNAs toplam sayısına göre ölçek): en iyi en az temel medya 0.5 ml 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) 10 µL. Pipetting tarafından mix ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      2. Mix 2 (shRNA) hazırlamak: paketlenmiş shRNA vektör 4 µg, 1,5 µg VSV-G zarf vektör (pMD2.G) ve ambalaj vektörünün (psPAX2), 2,5 µg karışık en iyi en az temel medya 0.5 mL.
        Not: Ambalaj sonraki enfeksiyonları bir negatif kontrol kullanmak için boş bir lentiviral vektör dahil.
    4. Mix 1 0.5 mL mix 2 her aliquot için ekleyin ve karışımı yavaşça pipetting tarafından. 20 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
    5. Adım 3.1.2 dropwise bir moda her plaka üzerine karışımı uygulamak; karışımı yavaşça için plaka girdap.
    6. Ertesi gün, taze DMEM-10 5 mL ile ortamı değiştirin.
    7. 48 saat sonra ilk transfection, süpernatant toplamak ve 0,22 µm filtre üzerinden çalıştırmak. Kurtarma maksimize etmek için DMEM-10 filtresiyle önceden ıslak.
    8. Aliquot filtre uygulanmış süpernatant içine tutarları 6-şey plaka de hastalık için ideal.
    9. Aliquots daha sonra kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak veya hemen iletim ile devam.
  2. İletim ve luciferase muhabir etkinleştirme ve vahşi-türü MeCP2 geni Xi üzerinde reaktivasyonu için bireysel saç tokaları test.
    1. Sabah, 1 x 105 XI hücreler/iyi 6 iyi plakalar üzerine plaka.
    2. Öğleden sonra tabakları ile 2 mL taze DMEM-10 lentiviral süpernatant ve 5-10 µg/mL polybrene içeren medyayı değiştirerek bulaştırmak. Bir denetimi bir boş lentiviral vector öğesinden üretilen de viral süpernatant bulaştırmak.
    3. Ertesi gün, DMEM-10 içeren 1 mg/mL puromisindir 2 mL ile ortamı değiştirin. Kültür dört gündür.
    4. Taze DMEM-10 ile 2 mL ortamı değiştirin ve 48-72 h kurtarma için izin verir.
    5. 150 µL % 0.05 tripsin-EDTA hücrelerle seferber. 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 ile 1,5 mL gidermek. Hücreleri 15 ml konik boru ve santrifüj 500 x g de oda sıcaklığında 10 dakika aktarın.
    6. Medyayı çıkarın ve luciferase tahlil Seti'nde sağlanan 100 µL lizis arabellek hücrelerde resuspend. Oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya. Lysates bir beyaz 96-şey plaka ve kit ile birlikte iletişim kuralını kullanarak luciferase etkinlik için tahlil aktarın. XA hücreleri olumlu bir kontrol ve bir negatif kontrol olarak boş bir lentiviral vektörü ile enfekte XI hücreler kullanın.
      Not: önce tahlil Floresan ışık beyaz tabaklar kullanılmasını önlemek; Bu arka plan azaltmak ve tahlil duyarlılığı artırmak. Tahlil Seti'nde sağlanan iletişim kuralı karanlıkta mümkün olduğunda gerçekleştirilen en etkili olabilir bulundu.
    7. Saç tokası active x kromozomu üzerinde bir etkisi MeCP2 ifade düzeyinde olduğu olup olmadığını belirlemek için RNA tranduced XI hücrelerden yalıtmak ve kantitatif PCR ile sadece vahşi türü MeCP2 (F: yükseltmek için tasarlanmış primerler kullanılarak MeCP2 mRNA düzeyini ölçmek 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. İsteğe bağlı: Hücreleri puromisindir seçimden iyileşti sonra 0.2 µM son bir konsantrasyon için 5-AZA ekleyerek tahlil duyarlılığını artırmak. 72 h için hücreleri ezelî eski yerine koymak medya kültür ve ticari luciferase tahlil seti kullanarak luciferase etkinlik için tahlil.
    9. Sessiz vahşi tipi MeCP2 reaktivasyonu ölçün. Xi, vahşi türüne MeCP2 bireysel tokalar, Protokolü 3.2.1 adımları içeren vektör ile liman Xa hücreleri enfekte. -3.2.4. RNA hücrelerden yalıtmak ve kantitatif PCR ile sadece vahşi türü MeCP2 yükseltmek için tasarlanmış primerler kullanılarak MeCP2 mRNA düzeyini ölçmek (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare tendon fibroblastlar hasat--dan bir daha önce açıklananMeCP2-LUC-HR/X XMeCP2 dişi fare, E6 ve E7 oncogenes HPV-16 virus7, üzerinden retroviral iletim tarafından ölümsüzleştirilmiş sınırlayıcı dilüsyonu kullanılarak kopyalanmış ve test luciferase etkinliği ve ifade vahşi tipi MeCP2 protein (şekil 1A ve 1B). Luciferase aktivite sağlam muhabir Xa üzerinde olsaydı ve Xi Eğer üzerinde tespit edilemez; Yerel MeCP2 ifade karşılıklı bir desen sergiledi. Bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bizim son6çalışma, biz bir fare hücre kültürünü luciferase ile oluşturulan ve hygromycin direnç genleri MeCP2 Xi üzerinde erimiş ve bir kütüphane ile transduced > shRNAs 60.000 hedefleme > 25.000 gen. 30 genler olan knock-down haiz sağkalım avantajı hygromycin B seçimi altında MeCP2 ve x kromozomu susturmak kontrol içindeki rollerine düşündüren bulduk. Bu sonuçlar bireysel saç tokaları ile bildirilen hücre kültürünü transducing ve sessiz luciferase muhabir reaktivasyonu değerlend...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. Leko Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi bir çalışan olarak bu makalesine katkıda bulunmuştur.  Görüşler kendi ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri ya da Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini yansıtmaz

Teşekkürler

Ross Dickins Melbourne Üniversitesi nezaketle belgili tanımlık perde içinde kullanılan shRNA Kütüphane sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser Rett Sendromu araştırma güven (A.B. tarafından) finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
293FT Hücre HattıİnvitrojenR700-07
5-AzasitidinSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
Anti-MECP2 antikoruMillipore07-013
KollajenazSigmaC2674-1G
Corning 96 Kuyulu Katı Beyaz Polistiren MikroplakalarFisher Scientific07-200-336
Dulbecco'nun Modifiye Kartal OrtamıGibco11965-092
İfade Tutuklama mikroRNA'ya uyarlanmış Retroviral Vektör (pMSCV)Açık BiyosistemlerEAV4679
İfade Tutuklama pSM2 Retroviral shRNAmir kütüphanesiAçık BiyosistemlerRMM3796
Fetal Sığır SerumuFisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501Veya eşdeğeri
Higromisin BCalbiochem400051-1MU
Lipofektamin 2000Invitrogen11668-019
Bright-Glo Lusiferaz Test SistemiPromegaE2610Kolonilerin Taranması için Homojen
Luciferase Test SistemiPromegaE4530Bireysel Saç Tokalarını
Test Etmek İçin Homojen Olmayan TestLuminometre TopCount NXTPerkin ElmerN/AVeya benzeri luminometre
MiSeq Reaktif Kiti v2IlluminaMS-102-2001Ekipmanınızla uyumlu kiti kullanın
Opti-MEMGibco31985-070
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
pMD2.GAddgene# 12259VSV-G zarf vektörü
PolibreneSigmaTR-1003-G
PolietileniminPolibilimleri23966-1
psPAX2Addgene# 12260Ambalaj vektörü
PuromycinGibcoA11138-02
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısıGibco25300-054
Test

Kaynaklar

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341(2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

X Kromozomu naktivasyonuMeCP2 ReaktivasyonuL siferaz Raporlay cHigromisin SeleksiyonuYeni Nesil DizilemeWestern BlotLentiviral Transd ksiyonH cre K lt rFare Tendon Fibroblastlar

İlgili makaleler