Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

8.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56421

⸱

31 Ocak 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Bu makalede

Özet

Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.

Özet

Tüberküloz (TB) ciddi bir bulaşıcı hastalık ve biricik elde edilebilir aşı M. bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) çocuk şiddetli TB menenjit ve Dissemine TB bazı türlerinin karşı koruma için güvenli ve etkili ama başaramamak-e doğru korumak olduğunu Akciğer TB karşı hangi hastalığın en yaygın biçimidir. Şu anda BCG geliştirmek için umut verici stratejileri ya dönüştürmenin immunodominant M. tuberculosis (Mtb)kodlama genlerimizle itimat-belirli antijenleri ve/veya tamamlayıcı antijen teşvik etkenler kodlama genler ile hücreleri sunulması. Bu yaklaşımlara büyük sınırlamalar düşük verimlilik, düşük istikrar ve güvenliğini ifade vektörel çizimler belirsiz düzeyini içerir. Bu çalışmada, BCG uluslara bakteri, tercihan--dan dönüştürme yüzeyinde ilgi eksojen proteinler ile ilgili genlerin kodlama Plasmid'ler ile oluşur aşı geliştirme için alternatif bir yaklaşım sunuyoruz. İlk olarak, proteinler ilgi erime içinde standart E. coli monomeric avidin ile ifade edilir ifade sistemleri ve biotinylated BCG yüzeyine süslemek için kullandı. Hayvan deneyleri BCG yüzey yedek ovalbumin antijen ile dekore edilmiş kullanarak değiştirilmiş bakteri tamamen immunojenik ve belirli T hücre yanıt ikna yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Tamamen, kesinlikle burada sunulan veri uluslara zahmetli geleneksel yaklaşım eksojen nükleik asitler ile değiştirir geçerli BCG aşısı yeniden şekillendirilmesi için bir roman ve verimli yöntem destekler.

Giriş

Çeşitli stratejileri geçerli TB aşı BCG protein adjuvan sistemleri, viral vektörlü teknolojileri, zayıflatılmış canlı M.tb suşları ve genetiği değiştirilmiş BCG suşları, ya genlerinin tanıtmak için de dahil olmak üzere, eski yerine koymak için önerilen yeterince enfeksiyon1 ya da Mtbsırasında gösterilir değil BCG antijenleri aşırı ifade-belirli antijenleri BCG2' mevcut değil. Genetik mühendisliği, ancak, birçok engeller Emanet, zaman alan işlem ve düşük verimlilik ifade vektörel çizimler4,5belirsiz düzey de dahil olmak üzere karşı karşıya. BCG iyileştirilmesi açısından, alternatif bir yaklaşım immünojenisite belirsiz genetik değişiklikler için gerek kalmadan geliştirmek için gereklidir.

Bu çalışmada, biotin tanınmış yüksek afinite avidin etkileşim dayanır BCG hücre yüzeyi ilgi rekombinant proteinlerin görüntü için yeni bir strateji tanıtmak. Bu yaklaşım hızlı ve tekrarlanabilir eki rekombinant avidin füzyon proteinlerin biotinylated maksimal iyileştirme onun etkinliğinin onun mükemmel emniyet koruyarak ulaşmak için BCG geniş işlemler kolaylaştırır BCG yüzeyi sağlar kayıt, kullanım yılda gözlenen.

Biotin için avidin ilgi son derece yüksektir (Kd 10−15 M =) ve bir kez kurulan, biotin avidin karmaşık çok kararlı ve yalnızca koşullar6denaturing altında bozulmuş. Ancak, bu tür bir gen transferi yöntemi alternatif olarak hizmet için etkileşim için uzun vadeli ama geri döndürülebilir ekran rekombinant proteinlerin gereklidir. Böylece, biz burada bir düşük benzeşme monomeric avidin tanıttı (Kd 10−7 M =) protein tersinir sürümü götürür yüzey hücreleri sunulması antijen içinde bir kez yutulur BCG dekore edilmiştir. Kavramının bir kanıtı olarak sağlamak için bu yöntem ovalbumin (OVA)7,8' den türetilmiş bir vekil antijen karşılık gelen bir monomeric avidin chimeric protein kullanarak test ettik. BCG hücre yüzeyine kolayca ve hızla monomeric avidin füzyon proteinler ile dekore edilebilir olduğunu ve bu bağlama BCG yüzeye istikrarlı ve bakteriyel büyüme ve hayatta kalma tespit değişiklikler olmadan tekrarlanabilir sonuçlar gösterdi. Ayrıca, monomeric avidin OVA (AviOVA) ile erimiş süslenmiş BCG BCG tarafından indüklenen için benzer bir bağışıklık yanıtı tetikleyebilir genetik olarak aynı antijen ifade bulduk vitro ve içinde vivo. Bu teknoloji bakteri yüzeyindeki ilgi proteinlerin geri döndürülebilir ekran bu nedenle geleneksel gen transferi yaklaşımlar etkili bir yerini ve BCG geniş işlemler ve daha fazla aşı uygulamaları için bir platform sağlayabilir geliştirme.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bütün hayvanlar hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca muhafaza. Deneyler hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kuralları Kanada Konseyi göre gerçekleştirilen. Hayvan güvence refah A11-0247 sayıdır.

1. nesil Monomeric Avidin füzyon protein plazmid ifade

  1. Alt monomeric avidin sıra12 pDEST17 plazmid 133 için karşılık gelen "CTC" ve "Tanrııı" siteler arasında içine clone-134bp. (Yani, 6-histag ve pDEST17 Attr1 rekombinasyon sitesi arasında) p17-AVI elde etmek için.
    Not: Monomeric avidin DNA dizisi aşağıda gösterilmiştir. Monomeric avidin elde etmek için vahşi tipi Avidin içinde sunulan üç mutasyonlar kalın karakter gösterilir.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Tasarım OVA polipeptid757-1035 için karşılık gelen AttB1 ve B2 Attsiteleri ile çevrili astar (ı-Ab- ve H-2_Kb-sınırlı epitopları) DNA dizisi. Astar sıraları şunlardır: Attb1-OVA
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT ve Attb2-OVA
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 ve Attb2 dizileri kalın olan).
    1. PCR yükseltmek OVA polipeptit757-1035 DNA dizisi ile pUC57-OVA plazmid şablon olarak kullanıp yukarıda astar.
    2. PCR ürünleri pDONR-221 pDONR-OVA elde etmek için bir siteye özel vitro Rekombinasyon tepkimesi (örneğin, BP Clonase) aracılığıyla içine kopyalayın.
  3. Faiz gen LR Clonase reaksiyon p17-AVI-OVA elde etmek için kullanarak p17-AVI içine aktarın.
    Not: kan basıncı ve LR rekombinasyon klonlama ayrıntıları için üreticinin el kitabına bakın.

2. monomeric Avidin füzyon Protein ifade, arıtma ve Refolding

  1. E. coli BL21 p17-AVI-OVA plazmid dönüştürmek ve E. coli BL21 kültür IPTG (0,1 M) ile 37 ° C'de 3 h için 250 mL teşvik
  2. Bakteri ve dahil organları Solubilization lizis
    1. Santrifüjü 4000 g x ve 4 ° C'de 30 dk tarafından indüklenen BL21 kültür 250 mL cips
    2. Granül lizis arabellek 10 ml toplamak (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M guanidin-HCL, pH 1,5-2,5) ve 95 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Gecede, oda sıcaklığında bir rotator üzerinde kuluçkaya.
    3. 15.000 x g ve 4 ° C ve toplamak süpernatant, 30 dk santrifüj kapasitesi.
  3. AVI-OVA Ni-NTA sütunları kullanarak süpernatant (çözündürüldükten dahil organları kesir) üzerinden arındırmak.
    1. Dahil organları 1:2 ile lizis arabellek sulandırmak.
    2. Ni-NTA reçine kültür kaynaklı dahil organlarının 250 mL başına 4 mL kullanın.
    3. 3 x 10 mL lizis arabelleği (pH 7,0) ile yıkayın.
    4. 10 mL elüsyon arabelleği (lizis tampon pH 7,0 ile 250 mM imidazole) ile elute.
  4. Eluted protein kademeli seyreltme (1:10) tarafından refold ve hızlı vortexing Tris arabelleği (pH 7.5) içeren 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM ara 80, 500 mM arginin ve 200 mM NaCl, oda sıcaklığında 30 dakika.
  5. De-tuz ve arabellek Satım Tris arabellek protein PBS protein yoğunlaştırıcıları göre üreticinin iletişim kuralları ile refolded.
  6. Santrifüjü 3.500 x g ve 4 ° C'de 30 dk için toplamları kaldırmak ve aliquots çözünür protein-20 ° C'de depolayın

3. Biotinylation BCG hücre yüzey

  1. BCG Middlebrook 7 H içinde büyümek 9 suyu 10 ile % OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözüm) ve %0,05 37 ° C kadar OD 50 RPM bir shaker platformda Tween 80 = 0,5-1.
    Not: BCG Biyogüvenlik seviye 2 patojen ve BCG ile ilgili tüm deneylerin bir biyogüvenlik uygun kişisel koruyucu ekipman ile kabine içinde yapılmalıdır.
  2. 109 BCG 3 kat 500 µL buz gibi endotoksin ücretsiz PBS artı % 0,1 Tween80 (PBST) (pH 8.0) ile yıkayın. BCG Pelet steril endotoksin ücretsiz PBS askıya alma.
  3. Kullanımdan hemen önce 1 mL steril süzülmüş su 10 mM Sulfo-NHS SS biotin hazırlayın.
    1. 1 mL 0.5 mm Sulfo-NHS SS biotin, oda sıcaklığında 30 dakika ile bakteri kuluçkaya.
  4. 3 kez ile sigara tepki biotinylation reaktif kaldırmak için buzlu soğuk PBST 500 µL etiketli bakteri yıkayın.
    1. Pelet 1 mL PBST yeniden askıya alma.
  5. Biotinylation etkinliğini değerlendirmek için 20 dakika oda sıcaklığında 108 biotinylated BCG Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) ile leke.
    1. 1 mL % 2 lekeli bakteri kuluçkaya PFA oda sıcaklığında 20 dakika ve biotinylation düzeyde Akış Sitometresi Analizi ile inceleyin.

4. Biotinylated mikobakteriler fenotip: büyüme ve hayatta kalma

  1. BCG suşları Middlebrook 7 H içinde büyümek 9 suyu 10 ile % OADC (oleik asit, albümin ve dekstroz çözüm) ve %0,05 37 ° C 50 RPM bir shaker platformda Tween 80.
    1. Bakteriyel kültür optik yoğunluk (OD600) 8 günlük süre içinde kaydedin.
  2. BCG-Luc (yukarıda açıklanan9) makrofajlar içinde bakteri yaşama algılamak için kullanır.
    1. RAW264.7 hücre biotinylated BCG-Luc (MOI 10:1) ile enfekte veya tedavi edilmezse BCG-Luc (kontrol) ve zaman dilimi üzerinde 48 h 37 ° C'de inkübe.
    2. Hücre monolayers yıkama ve % 0,025 SDS ile alınan bakteriler serbest bırakmak için koşullar.
    3. Tedbir bioluminescence üretim Luciferase tahlil sistemi ve luminometer.
      Not: Işıldama sinyal bakteriyel canlılığı göstergesidir. Lütfen üreticinin kullanım kılavuzu luciferase testin bakın.

5. Biotinylated BCG yüzeye Monomeric Avidin-füzyon proteinin bağlama

  1. 5 x 108 biotinylated BCG shaker platformda oda sıcaklığında 1 h için AVI-protein (PBS-T finalde 10 μg/mL) ile karıştırın.
  2. 3 kez ile buzlu soğuk PBST ve leke tavşan Anti-avidin antikor (Ab) (1: 100 seyreltme, yukarıda açıklanan10) oda sıcaklığında 20 dakika ve sonra FITC ile 500 µL yıkama bakteri keçi Anti-tavşan IgG Ab aynı koşullarda Birleşik.
  3. 3 kez ile PBST 500 µL bakteri yıkama ve yüzey dekorasyon ölçüde değerlendirmek için Akış Sitometresi tarafından analiz.

6. mikobakteriler lyophilization

  1. Biotinylate göre adım 3.1-3.4 ve kat biotinylated bakteri ile bakteri AVI-OVA adım 5.1 göre.
  2. Aliquot biotinylated ve kaplamalı bakteri (108), yıkama ile PBS ve 0.5 mL lyophilization medyada yeniden askıya alma (% 25 Sauton orta, % 75 H2O ve % 1.5 Na-Glutamat).
  3. Cam Şişeler için bakteri transfer ve gecede-80 ° C dondurucuda dondurma.
  4. Dolu ve dondurulmuş cam şişeleri için 24 saat bir donma kurutma makinesi kullanarak lyophilize.
  5. Kurutulmuş örnekleri, oda sıcaklığında saklamak ve gerektiğinde PBS sulandırmak.
  6. Biotinylation ve istikrar kaplama yüzeyi değerlendirmek için 3.5 arasındaki adımları yineleyin.

7. fagositoz tahlil

  1. 10 cm çapında kültür yemekleri DMEM orta içeren % 5 FCS, % 1'i her L-glutamine, HEPES, non-gerekli amino asitler ve penisilin ve streptomisin ham 264.7 makrofaj hücreleri % 70-80 confluency kadar büyür.
  2. 2 x 106 ham 264.7 makrofaj hücreleri bir 6-şey plaka tohum. Hücreleri gecede 37 ° C ve % 5 CO2' de bağlı kalmak izin verir.
  3. DsRed BCG oluşturmak (yukarıda açıklanan9) AVI-OVA ile (DsRed BCG-AVI-OVA) adımları 3.1-3,4 ve 5. 1 göre dekore edilmiş.
  4. DsRed BCG-AVI-OVA veya tedavi edilmemiş DsRed BCG MOI 20:1 37 ° C'de 24 h için ham hücreleri enfekte
  5. Hücreleri üç kez yıkama ve kısmen müstakil bakteri kaldırmak için 10 dk 37 ° C'de % 0.25 tripsin 1 mL kullanarak trypsinize.
  6. %2.5 düzeltmek PFA PBS için oda sıcaklığında 20 dakika içinde.
  7. 3 x PBS ile yıkama ve Akış Sitometresi tarafından analiz.

8. hücre içi OVA kaçakçılığı Biotinylated BCG makrofajlar içinde dekore edilmiş

  1. Floresans mikroskobu
    1. 3 x 105 çiğ 264.7 makrofaj hücreleri coverslips 24-şey plaka üzerinde tohum. Hücreleri gecede 37 ° C ve % 5 CO2' de bağlı kalmak izin verir.
    2. Makrofaj hücreleri mikobakteriler (MOI 10:1) bakım medya olmadan antibiyotik 37 ° C ve 4-24 h için % 5 CO2 ile enfekte.
    3. Hücreleri yıkama ve yüzey ekli, Sigara yutulur bakteri olduğu gibi adım 7.5 kaldırmak için trypsinize.
    4. Düzeltme enfekte hücrelerde % 2.5 PBS ile 3 yıkar PFA PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde izledi.
    5. Engelleme/permeabilization arabellek hücrelerde permeabilize (% 0,1 Triton X-100, PBS % 3 BSA) oda sıcaklığında 20 dakika.
      1. Kullanım spesifik antikor ilgi (örneğin, Anti-avidin Ab tavşan) oda sıcaklığında 20 dk için arabellek permeabilization 10 μg/mL devam 20 dk için ikincil antikor (örneğin, FITC-keçi Anti-tavşan IgG) tarafından.
    6. Yıkama su ve sulu montaj orta floresan photobleaching en aza indirmek için 10 μL slaytlarda bağlama ile bir kez PBS ile 3 x hücreleri.
    7. Slayt 63 x ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital confocal mikroskobu tarafından incelemek / 1.4 planı-Apochromat amaç. Kayıt görüntüleri kullanarak bir dijital fotoğraf makinesi için belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı birleştiğinde.
  2. Immunogold boyama ve elektron mikroskobu
    1. 2 x 106 ham 264.7 makrofaj hücreleri 6-şey tabak içinde tohum.
    2. %4 ile enfekte BCG makrofajlar düzeltmek PFA oda sıcaklığında 4 h için.
    3. Örnekleri iki kez PBS ile yıkayın.
    4. % 4 düşük erime noktası özel örnekleri katıştır ve % 70 etanol kurutmak.
    5. Akrilik Reçine için örnekler aktarmak ve 50 ° C'de polimerize
    6. 60 nm bölümleri ile bir microtome kesmek ve bölümler nikel Izgaralar üzerinde toplamak.
    7. Etiket örnekleri 10 μg/mL avidin antikor için 1 h, oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçka çözüm (PBS ve % 0.1 BSA) ile ve sonra yıkayın kuluçka çözüm altın Birleşik F(ab')2 ultra-küçük keçi-anti-tavşan ile Oda 1 h için IgG (1/20) Kuluçka çözüm sıcaklığında.
    8. Distile su bölümlerde yıkama, % 2 oxazolidin leke, yine, hava kuru yıkama ve elektron mikroskobu ile inceleyin.

9. hayvan bağışıklama ve Organ işlemi

Not: Tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yapılmalıdır.

  1. Pass biotinylated ve protein kaplı bakteri 271/2G iğne ile 10 kat tek hücre süspansiyon yapmak.
  2. 1 x 106 bakterilerde endotoksin-Alerjik PBS 100 μL al ve bir kadın C57BL/6 fareler (ı-Ab, H - 2 Kb, 5-6 haftalık) subkutan boyun scruff bağışıklık.
    1. Denetim fare PBS yalnız 100 μL ile enjekte.
  3. Servikal çıkığı tarafından takip CO2 Solunduğunda aşılı fareler 20 gün sonrası aşılama ötenazi.
    1. Dalak yalıtmak ve RPMI medya içine aktarın.
  4. Dalak 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL şırınga pompası ile püre.
    1. RPMI 5 mL ile yıkayın. Santrifüj (800 x g, 3 dk) bir tek hücre süspansiyon yalıtmak için.
    2. RBC ile fare biotin pozitif seçim teçhizat biotin-Ter119/Erythroid hücreleri Ab ile tüketmek.
    3. Santrifüj ve yeniden askıya hücrelerinde (% 10 FCS, %1 L-glutamine, % 1 penisilin, % 1 streptomisin ve 50 μm kalınlığında 2-ME) tam RPMI 10 mL.

10. ı-Ab tetramer antijen spesifik CD4 frekansları+ T hücreleri ve hücre içi sitokin boyama belirlemek Frekanslar, antijen spesifik T hücreleri serbest sitokinler hayvanlarda aşı için karar vermek için boyama

  1. Tetramer boyama
    1. Splenocytes kontrol ve aşılı fareler (~ 20 x 106 hücreler) PE Birleşik ı-Abile leke-OVA323-339 tetramers (1/12,5 seyreltme) bağlama arabellek (PBS % 2 FCS ve %0,1 NaN3ile) 37 ° C'de 1 h için.
    2. AF647 CD4 Ab (1:25) ve (ölü hücreleri bulmak için) 7-AAD splenocytes oda sıcaklığında 20 dakika için ekleyin.
    3. Örnekleri Akış Sitometresi tarafından analiz.
    4. 500.000 etkinliklere tetramer olumlu olayları sıklığını belirlemek için CD4 pozitif elde etmek.
      Not: Toplam splenocytes SSC/FSC dot blot tarafından canlı hücreleri tarafından 7-AAD olumlu olaylar dışlanması ve CD4 alt kümeleri AF647 olumlu olaylar çoğunluğuna tarafından tanımlanır.
  2. T hücreleri serbest antijen belirli hücre içi sitokin sıklığı
    1. Transfer yaklaşık 1 × 107 splenocytes içine altı-şey plakaları veya rekombinant OVA olmadan tam RPMI ortamda 4 mL (10 µg/mL) ve 16 h için kuluçkaya.
    2. Ek bir 5 h için Brefeldin A (1:1, 000) ile hücreleri tedavi.
    3. Yıkama ile PBS ve hücre içi sitokin aşağıdaki gibi boyama tabi:
      1. PE-CD8 veya PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 bağlama arabellek) ile hücre örneklerinde oda sıcaklığında 30 dakika leke.
      2. %4 oranında tamir PFA, oda sıcaklığında 20 dakika.
      3. Permeabilization çözüm, kullanarak üreticinin yönergelerine göre permeabilize.
      4. Hücreleri ve AF647 Birleşik IFN γ Ab (1:50) 20 dk için etiketle oda sıcaklığında yıkayın.
      5. Hücreleri yıkayın ve Akış Sitometresi Analizi için yukarıda açıklandığı gibi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan genel yordamlar ile fizibilite BCG yüzey biotinylation ve vekil antijen OVA ile dekorasyon incelenmiştir. Sonra değiştirilmiş BCG immünojenisite oldu test içinde vivo. Bakteriyel yüzey kolayca avidin chimeric antijenleri bakteriyel fenotipleri tespit herhangi bir değişiklik olmadan hızlı ekran için biotin ile etiketli oldu. Elde edilen değiştirilmiş BCG verimli antijen sunumu hücreleri tarafından yutulur ve OVA özgü bağışıklık yanıtının farelerde tetikleyebilir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BCG yüzeyinde belirli antijenleri veya bakteri'nın immünojenisite verimli bir şekilde geliştirmek için beklenen belirli fonksiyonel özellikler eklemek için hızlı ve etkili görüntü eksojen proteinlerin için genetik olmayan bir yaklaşım bu çalışmada bildirdi. BCG hücre yüzeyine kolayca biotinylated avidin füzyon protein ile anlık yüzey dekorasyon için olabilir gösterdi. Genetik dönüşümü ve olumlu klonlar yelpazesi gerektirir iken 2-3 ay zaman lag toplam yordam içinde 2 h, gerçekleştirilebilir. Yüzey modifikasyonu Bakteriye...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Dr R Stokes BCG Pasteur zorlanma için ve A. Talal teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca GenScript gen sentezi ile yardım için teşekkür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Endotoksin İçermeyen RPMI 1640Kök Hücre Teknolojileri 36750
Sulfo-NHS SS biotinThermo Fisher 21328
FITC ile konjuge streptavidinSigma-AldrichS3762
Fikoeritrin (PE) ile konjuge I-A < sup>b< / sup>-OVA < sub> 323-339 < / sub> tetramer ve nbsp;MBL Uluslararası TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON polihistidin-Tag saflaştırma reçinesi Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 konjuge sıçan anti-fare CD4BD Bioscience 
AF647 sıçan anti-fare IFN-gBD Bioscience 
AF647 sıçan anti-fare I-A/I-EBD Bioscience 
562367 PeCy7 sıçan anti-fare CD4BD Bioscience 
PE sıçan anti-fare CD8 AbBD Bioscience 
AF 647 sıçan anti-fare H-2kbBD Bioscience562832
FITC konjuge keçi anti tavşan antikoruThermo Fisher31635
AF 647 sıçan anti-fare CD4BD Bioscience 
Ultra küçük altın konjuge keçi tavşan karşıtı IgGElektron Mikroskobu Bilimleri25100
Middlebrook 7H9 et suyuBD Teşhis Sistemleri271310
OADCBD Teşhis SistemleriB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 murin makrofaj hücre hatlarıAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu
pDEST17 plazmid İnvitrojen11803012
pUC57-OVA plazmid GenScriptSD1176
BP klonaz İnvitrojen11789020
LR klonaz İnvitrojen11791043
pDONR221 plazmidInvitrogen12536017
Ni-NTA kolonları Qiagen31014
Pierce protein yoğunlaştırıcıları Termo Balıkçı 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II epifloresan mikroskobuCarl Zeiss Inc
CCD dijital kamera Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV elektron mikroskobu FEI ŞirketiG2 200Kv 
70μ m Falcon hücre süzgeci Termo Balıkçı 87712
EasyStep fare biotin pozitif seçim kiti StemCell18556
biotin-Ter119/Ertyroid hücreleri antikoruBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm kiti BD Pharmingen554714
Bright-Glo Lusiferaz test sistemiPromegae2620
Turner Biosystem luminometre ve nbsp;PromegaTD-20/20
Leica EM UC6 mikrotom  Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 dondurarak kurutucuSavant Instruments NL 50
Wheaton boroscilicate cam şişelerWheaton  VWR 66011-675
557681557735552775561095557681 Serisi

Kaynaklar

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein EkspresyonuAk Sitometrisimm nojeniteT H cre Yan tAntijen SunumuMHC Molek lleriFagositoz Deneyi
Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.