Method Article

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

DOI:

10.3791/56436

⸱

December 28th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültürlü kemirgen beyin dilimler neurons ve glia birçok normal vivo içinde etkileşimlerinin tutar bir ortamda hücresel ve moleküler davranışını eğitim için yararlı olur. Transgenik fare hatları çeşitli veya viral vektörler kullanımı fluorescently tagged proteinler veya vahşi türü beyin dilimleri gazetecilere ifade için elde edilen dilimleri Floresans mikroskobu ile yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin verir. Beyin dilim dilim kültür gerçekleştirme olanağı ile birleştirerek, görüntüleme için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, ancak uzun süreler boyunca canlı dilimleri belirli hücreleri tekrarlayan yüksek çözünürlüklü görüntüleme sorunlarını yarattığı. Bu en iyi kapalı bir sistem kullanıcıları korumak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için yapılır beri viral vektörler için eksojen proteinlerin ifadesi kullanıldığında bu özellikle doğrudur. Kapalı bir sistemde birçok hafta boyunca dilimleri tekrarlayan yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin basit silindir tüp beyin dilim kültür yöntemine yapılan değişiklikleri rapor edilir. Photoetched coverslips dilimleri kültürü çalışmalarının hızla ve kesin zaman önce ve sonra farklı tedaviler içinde aynı alan görüntü için sahne yeniden konumlandırmak için indirgeme işaretleri kullanımına izin verir. Örnekler, belirli nöronal boyama ve değişiklikleri Hipokampal dilim mimarisinde gözlemlemek için ifade, viral aracılı nöronal deyim floresan proteinlerin ve cofilin patoloji gelişimi ile birlikte bu yöntemin kullanılması için gösterilir, hangi daha önce yanıt olarak amiloid-β (Aβ) peptid reaksiyonlar ile dilim tedavisi Alzheimer hastalığı (Ah) oluşur içinde gözlendi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil kemirgen beyin bölgelerinden Disosiye nöronların uyaranlara yanıt-e doğru hastalık derecesinde gözlemlemek için araştırmacılar tarafından kullanılan önemli bir araç karıştığı kültürdür. Ancak, bu tür çalışmalar nöronlar sadece 2D ve onların gliyal destek sistemi olmadan görüntülemenin dezavantajı var. Ayrıca, içinde hangi o çok yüksek yoğunluklu (640 nöronlar/mm2 veya yüzey alanı yaklaşık % 16) şartları altında yetiştirilen sürece bir dendrite veya axon rasgele akıbet için daha kısa bir mesafe--dan onun hücre gövdesinden Hipokampal takip etmek imkansız hale nöronal canlılık 4 haftadan1yaşa bağlı patolojiler genişletilmiş çalışmaları için Disosiye kültürler kullanımını sınırlama, önemli ölçüde azalır. Kemirgen beyin hazırlanan dilimleri kültür hafta veya ay için bir organize hücre mimarisi ve canlılığı tutarak bu sınırlamalar üstesinden cazip bir seçenektir. Dilim kültür kemirgen beynin birçok farklı bölgeleri korumak için koşullar açıklanan2olmuştur.

İki ana yöntem yaygın beyin dilimleri uzun vadeli kültürü için kullanılan: Hava-sıvı arayüzey3 membranlar üzerinde kültür veya coverslips kapalı tüpler üzerinde kültür izin havalandırma4sağlamak için silindir kuluçka makinesine döndürmek için. Membranlar kültürlü dilimleri bir dik mikroskop ve su daldırma hedefleri5kullanarak yüksek çözünürlüklü Floresans mikroskobu ile doğrudan yansıması. Alternatif olarak, membranlar kültürlü dilimleri dendritik dikenleri bir ters mikroskop6kullanarak iyi çözünürlük elde etmek için cam alt yemekleri transfer edildi. Ancak, her iki yöntem membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri görüntüleme orta herhangi bir değişiklik yapılması ve antifungal ve/veya antibiyotik kirlenme5,6azaltmak veya önlemek için kullandığınız açık sistemlerdir. Mükemmel morfoloji ve hayatta kalma bir membran hava-orta arayüzüne dilimleri korumak, ama deneme sadece küçük hücre grupları takip ediyor sürece yüksek büyütmede tekrarlayan görüntüleme sırasında kesin konumlara dönen son derece zordur Floresan bir işaretleyici ifade ediyorum. Membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri viral aracılı ile ifade transgenes5,6kullanılmıştır, ancak, Biyogüvenlik protokolleri bir kapalı kültür sistemi için kullanılan bazı viral vektörler için istihdam gerekebilir Fluorescently ifade proteinler ve hücre fizyolojisi gazetecilere etiketledi. Ayrıca, daldırma hedefleri dekontaminasyon kültür5' te takip edilecektir örnek arasında gerektirir. Bir büyük uygulama membran arabirimi kültürlerin Elektrofizyoloji seferinde Puan7ile yüksek çözünürlüklü görüntülemede birleştiriyor.

Silindir tüp yöntemi ile coverslips plastik tüp içinde herhangi bir Elektrofizyoloji veya yüksek çözünürlüklü görüntü coverslip kaldırmadan izin vermez. Böylece, bu yöntem en sık hangi8sonrası fiksasyon gözlemler yapılmış olan uzun vadeli çalışmalar için uygulanmıştır. Burada açıklanan roller tüp kültür tekniği kullanır ama hkr kültürleri kadar uzun süre yansıması coverslips dilimleri ile delinmiş-out tüplerin üzerinde tutulan bir yöntemdir. Kapalı sistem görüntüleme için orta hiçbir değişiklik gerektirir ve photoetched coverslips günler ya da haftalar, sonra yüksek büyütmede daha önce görüntüsü hassas alanları görüntüleme izin indirgeme işaretleri sağlamak için kullanır.

Kemirgen hipokampüs, hafıza ve öğrenme dahil bir büyük beyin bölgesi değişiklikleri incelemek için bu yöntemi uygulamak. Kemirgen Hipokampus kez kognitif bozukluk9, reklam ortaya gibi gelişimi sırasında gözlenen patolojik veya yaşa bağlı değişiklikler için bir model olarak incelenmiştir. Bizim yöntemi AD8karakteristik olan tek bir dilim içinde Aβ peptidler, artışlar gibi çevresel değişiklikler zamanla geliştirmek patolojik değişiklikleri incelemek için özellikle uygundur. İnsan ve kemirgen reklam beyin ile ilişkili bir patoloji cofilin-aktin toplamları varlığı ve çubuklar, içinde cofilin ve aktin filamentleri ikinci içeren demetleri bir 1:1 molar oranı10,11', 12. çubuklar gözlemlenmiştir sabit dilimleri Aβ tedavi aşağıdaki farenin Hipokampus yanı sıra cofilin-GFP hipoksi8' e tabi ifade bir canlı kemirgen beyin dilim içinde ve onlar için bir reklam gördüm sinaptik disfonksiyon katkıda bulunabilir ve inme. Burada zaman ders ve dağıtım içinde ifade edilen eksojen chimeric floresan proteinler farklı virüsler tarafından tanıtılan dilim gözlemlemek için bu yeni kodlamayla yöntemi kullanın. Biz o zaman cofilin çubuk ve çözünür Aβ reaksiyonlar (Aβo) ile tedaviye yanıt Hipokampal dilimleri toplama patolojisi gelişimini takip etmek bir cofilin muhabir yapı nöronal belirli ifade kullanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan kullanımı hayvan bakım ve kullanma yönergeleri, Colorado State Üniversitesi onaylı üreme ve uygun hayvan kullanım iletişim kuralları takip eder.

Not: Aşağıdaki protokol uzun süreli inkübasyon ve Hipokampal dilimleri aralıklı görüntüleme için hazırlık ve kültür yöntemi açıklar. Tek bir Hipokampal dilim plazma pıhtı kullanarak bir özel olarak hazırlanan photoetched coverslip bağlı olduğu ve daha sonra coverslips bir silindir kuluçka makinesine korunur delinmiş-out silindir tüp düz tarafı üzerine mühürlü. Plazma pıhtı plasmin floresan protein ifade ve yüksek çözünürlükte görüntüleme için viral enfeksiyon önce ile çözülür. Bir floresan nöronal hayati boya nöronlar dilimleri içinde görüntü için kullanılır.

1. silindir tüp raf hazırlanması

  1. Şekil 1içindeA gösterilen şablonu kullan ölçek çubuğunda gösterilen boyutları için basılmış. Bir çivi ile küçük delikler (para cezası nokta kalem için yeterince büyük) delikleri merkezli şablon yumruk.
  2. Şablon 15 cm doku kültürü çanak (14 cm anma çapı) altta ayarlayın ve delikleri konumunu işaretleyin. İkinci bir tabak üzerinde bu işlemi yineleyin.
  3. Plastik üzerinde kullanılmak üzere tasarlanmış matkap ile altı 1.5 cm çapında altıgen bir dizi (4,8 cm Merkezden-merkeze) delik merkezleri çanak kenarından 2,5 cm olarak her yemeğin üzerinde delik. Üç (3 mm çapında) equidistantly Resim 1içindeAgösterildiği gibi daha büyük delikler ikisinin arasına yerleştirilen kenarından 12 mm delik.
  4. Her yemeğin dipleri ile bir 2,5 inç uzun makine vida (3/16 inç çapında) düz bir yıkayıcı bir ikinci düz çamaşır makinesi tarafından bir parça takip küçük delikler aracılığı ile yer, karşı karşıya polietilen boru (spacer, 4.7 cm), başka bir düz rondela , ikinci doku kültürü çanak, başka bir düz RONDELA, kilitleme bir çamaşır makinesi ve bir deli.
  5. 1.4 diğer iki makine vidaları ve tüm makine vidaları yerde olana sadece gevşek sıkma arasındaki adımları yineleyin. Sonra güvenli bir şekilde fındık sıkın.
  6. Son silindir tüp raf almak için alt çanak deliklere grommets (5/16 inç kalınlığında, 5/8 inç delik çapı) iş (şekil 1B; yerde iki tüp ile gösterilen). Bir etiket benzersiz bir sayı ile her raf yerleştirin.

2. silindir tüpleri ve Coverslips hazırlanması

  1. Silindir tüpler delik delme için jig yapma
    1. 1,5 cm 8 cm derin delik bir 2 x 4 x 5,5 inç ahşap blok böyle bir açıyla Merkezi tarafındaki silindir düz tarafı tüp takıldığında blok ile neredeyse paralel (Şekil 2A).
    2. Yuvarlak ahşap dosya kullanarak hem genişletmek ve konik tüp ekleme izin için delik delik büyütme (silindir boru çapı kap sonuna yakın biraz daha büyük) (Şekil 2B).
    3. Bir 1,5 cm Çap dikey, blok, tarafındaki 5.5 cm delik açıp yan delik (Şekil 2C) üzerinde ortalanmış.
    4. Yan delik yeterince konik zaman dilimi için delik ortalamak ve işaretli noktanın ortalanmış şekilde 1,5 cm dikey delik tüpü yerleştirin için istenilen noktada işaretlenmiş bir silindir tüp takın.
    5. Tüpü çıkarması ve tüp sonuna nokta mesafe ölçmek. Bu mesafeden jig delik ortasına işaretlemek ve doğru bir şekilde ( Şekil 2Cok) sondaj için tüp konumlandırmak için bir durağı sağlamak için bir çivi yerleştirin.
    6. Bir demir testeresi floş yaralanma önlemek için ahşap blok yüzeyli tırnak kesmek için kullanın.
    7. Varsa bir matkap basın izin Yuvaları (Şekil 2D siyah ok) demirlemiş jig dibinde bahar klip ekleyin. Aksi takdirde, C-kelepçeler jig matkap basın üzerine güvenli tutmak için kullanın.
  2. Jig kullanarak yukarıda açıklanan tutun ve (Şekil 2A) kadar düz tarafı ile düz yüzlü 11 cm plastik kültür tüp getirin, 6 mm çapında delik Merkezi alt 1.0 cm ile ve tüp iki taraf arasında ortalanmış.
    Not: plastik için tasarlanmış bir matkap kullanılmalıdır.
  3. Döner bir çapak alma aracı ile delik (Şekil 2E) kenarlarını düzeltmek ve iç 4 grooves yapmak kenar deliğin (Şekil 2E, iç metin) delik sırasında rotasyon boşaltma kolaylaştırmak için.
  4. Bir 12 mm delik yumruk, 12 mm çapında yuvarlak yüzey--dan non-toksik çift taraflı yapıştırıcı silikon plastik çarşaf kes. Bir standart bir kağıt bir delik (6 mm çap) kullanarak, her diskin ortasında bir delik açın.
  5. % 70 etanol ile açılmış tüpler durulama, hava onları biyolojik Emanet dolabı, Kuru ve tüpler ve delikli yapışkanlı diskler için biyolojik güvenlik kabin UV lambası (30 W 70 cm ortalama mesafe) altında 40 dk sterilize.
  6. Böylece tüm maruz yüzeylerde sterilize tüpler ve diskler 20 dk sonra yeniden konumlandırın. Steril koşullarda yapışkanlı bir diskten yedekleniyor beyaz akasındaki ve silikon kauçuk bir tüp delik (Şekil 2F) hizalama dışına yapıştırmayın.
    Dikkat: UV Işınlarına maruz kalma önlemek için göz koruma giymek ve kabine UV lambası açmadan önce kapatın.
  7. 12 mm çap photoetched (100 numaralı Merkezi 1 mm kareler) Alman cam coverslips temiz. Coverslips yavaşça Forseps ile tutun ve mutlak etanol suyu mutlak etanol tarafından tekrar, takip, takip, daldırma ve son olarak etanol yakmak için bir alev coverslips daldırma. Soğuması coverslips sağlar.
  8. Coverslips Forseps ile tutarak, %2 3-aminopropyltriethoxysilane aseton içinde içine daldırma için 10 s. durulama ultrasaf su ile coverslips ve hava kuru izin.
  9. Coverslips steril filtre kağıdı biyolojik bir güvenlik içinde kabine ayarla ve UV ışık açın. Coverslips 20 dk için her iki tarafında ortaya çıkarmak.
    Dikkat: UV Işınlarına maruz kalma önlemek için göz koruma giymek ve kabine UV lambası açmadan önce kapatın.

3. Hipokampal dilim hazırlık

  1. Diseksiyon başlamadan önce iki ucu keskin jilet yarısı için doku helikopter hazırlayın. Bıçakları dikkatlice parmak ile boyuna katlayın ve ikiye oturtun.
  2. Bıçak yarım bir pamuklu çubukla temizlemek, mutlak etanol durulama tarafından takip ve kurutma hava kullanarak aseton ile yıkayın.
Yarım bir bıçak doku helikoptere montaj önce % 70 etanol ile durulama tarafından sterilize et.
  • Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri takip; isoflurane anestezi sonra işten çıkarma tarafından 4-7 gün eski fare ya da sıçan yavrusu ötenazi ve makas veya Giyotin ile baş kaldırmak.
    Not: Beyin dilim kültür fare ya da sıçan zorlanma veya genotip bağımsız iletişim kuralıdır. Birçok transgenik fare satırları farklı genetik kökenli kullanılmaktadır.
  • % 70 etanol ile baş durulayın ve bir 60 mm Petri kabına yerleştirin. Beyin dilim rulo tüp üzerine son montajı kadar tüm aşağıdaki adımları bir laminar akış hood kısırlık korumak için gerçekleştirilir.
  • #21 cerrahi bıçak kullanmadan, cilt ve kafatası ile sagittal kesme olun. #5 Dumont Forseps ile kabuğu cilt ve kafatası beyin ortaya çıkarmak için geri.
  • Kapalı Forseps ile hafifçe tüm beyin serbest bırakmak o arkasında beyincik beyin sapı ile Forseps ile pinching tarafından alay. Beyin 4 ° C Gey'nın dengeli tuz Solution/0.5% glikoz (GBSS/glikoz) içeren bir steril 60 mm tabak yerleştirin.
  • Beyin (şekil 3A) görselleştirmek için bir diseksiyon mikroskop kullanarak, beyin dorsal tarafta yerleştirin ve beyin ve beyincik üçüncü açık (şekil 3B) cerrahi bir bıçakla kesti.
    1. Forseps ile istikrar için Petri kabına tarafına ventral yan ve kesilmiş beyin arka tarafa tutun. Yavaşça uzak meninkslerde sagittal orta hat çevresinde alay etmeyi ve ince uçlu Dumont #5 forseps (şekil 3C, kesik çizgili Daire) kullanarak orta dokuyu.
    2. Açık (şekil 3C, kesik çizgiler) yaymaya beyin kenarı boyunca iki kesim yapmak. Beyin dorsal yüzü aşağı ve yaymak açık yerleştirilir, Hipokampal fissür görünür olmalıdır (şekil 3D, ok).
    3. Formanın açık beyin polychlorotrifluoroethylene plastik film bir parça için transfer ve bir doku helikopter sahnede Dilimleme için konumlandırın. GBSS/glikoz bıçakla ıslak ve Hipokampus ~ 300 µm kalınlığında dilimler halinde doğrayın.
    4. Transfer pipet ile plastik film kapalı dilimlenmiş beyin GBSS/glikoz (şekil 3E) içeren bir taze 60 mm çanak içine sifonu çek. Nazikçe kapalı çimdik ve uzak, ince uçlu forseps, kalan meninkslerde ve (şekil 3G, H) dilimleri diğer sigara Hipokampal dokudan (şekil 3F) ile alay.

    • 4. kaplama dilimleri

    1. Dilimleri aldıktan sonra tavuk plazma 2 µL hazır coverslip photoetched tarafında ortasına yerleştirin. Biraz bir 3-4 mm çap nokta elde etmek için plazma yayıldı.
      Not: Photoetched yan coverslip böyle rakamlar doğru odaklı bir diseksiyon mikroskop görüntülendiğinde en iyi tarafı.
    2. 1 beyin dilim bir steril dar uçlu spatula (şekil 4A) ile plazma noktanın üzerine (şekil 4B) aktarın. GBSS/glikoz dilimden kaldırma sırasında spatula ucunda dilimi tutmak için kapalı forseps kullanın.
    3. Plazma coverslip ve kapalı Forseps ile spot için spatula dokunmatik, dilim coverslip üzerine bas.
    4. Mix 2.5 µL plazma Trombin ayrı tüp içinde 2.5 µL ile. Hızlı bir şekilde bu karışımın içinde ve çevrede belgili tanımlık dilim ve damlalıklı yukarı ve aşağı 2,5 µL yavaşça karıştırarak (şekil 4B) yerleştirin.
      Not: bunu hızlı bir şekilde yapmanız gerekir bu yüzden plazma içinde 10-15 s, pıhtısı. Dilim yapışma bir sorun ise, 5 µL plazma 5 µL Trombin ile karıştırın ve dilim dilim düz coverslip üzerinde yatıyor böylece karıştırma sonra bazı kaldırma, 4-5 µL kullanın.
    5. Daha önce bir silindir tüp yapıştırılmış silikon kauçuk yapıştırıcı maruz tarafındaki kapsayan şeffaf plastik çıkarın ve coverslip ile beyin dilim dilim delik (şekil 4C) içinde hizalama yapıştırıcı üzerine yerleştirin.
    6. Yapışma sağlamak için yumuşak, coverslip ile eşit olarak coverslip aşağı tuşuna basıp biyolojik Emanet dolabı aktarma sırasında yaklaşık 1 dakika tutan başparmak için bile basınç uygulayın.
    7. Bir biyolojik Emanet dolabı, tam Neurobasal bir kültür ortamının (Tablo reçetesi) 0.8 mL her tüp (şekil 4D) ekleyin.
    8. Güvenli bir şekilde bir kelepçe tarafından düzenlenen bir steril pamuk tıkalı Pasteur pipet ile % 5 CO2/95% hava karışımının akışı. Silindir tüp gaz karışımı ile Temizleme ve pipet üzerinden çekilmiş gibi hızla tüp kap.
    9. Dilim numarasını ile tüplere etiket ve numara raf. Tüpler geometrik olarak dengeli sağlanması bir silindir raf yerleştirin. Tüpler tek sayıda ise, tüpler dengelemek için ekleyin.
    10. Silindir raf hakkında dönüm Silindirler ile 35 ° C silindir kuluçka makinesine rafları koyun 10-13 RPH (şekil 4E). Tüpler alt orta tutmak için tilt kuluçka makinesi geri yaklaşık 5° onun açık bir tahta üzerinde yükselterek.
    11. Dilim tedaviler ve gözlem tarihleri tüm bilgi kaydetmek için kullanılan bir elektronik tablo üzerine dilim ve tüp numarası girin.
    12. Üzerinde yaklaşık olarak kültür, 6 günde her tüpün 1 µL (0,002 U) aktif plasmin ekleyin.
    13. Pıhtı tamamen erimesi sonra (genellikle birkaç saat içinde), orta kaldırmak ve plasmin olmadan taze orta yerine. Gerekirse, dilimleri gecede plasmin ile inkübe ve orta ertesi gün değişti.
    14. Dilimleri genellikle en az 7-10 gün önce deneyler kullanımda inkübe. Orta Aspire edin ve günde 3 veya 4, 7 gün ve 7 günde bundan sonra üzerinde tekrar değiştirin.

    5. Transgene ifade için Viral vektörler hazırlanması

    Not: Transgenes dilim kültürlerin nöronlar içinde ifade ya beyin gelen genetiği kemirgenler veya transgene tanıtımı rekombinant çoğaltma eksik virüs enfeksiyonu elde edilir.Adenovirüse bakın (AV), adeno ilişkili virüs (AAV) ve rekombinant lentivirus vektörler tüm bizim Hipokampal dilim kültürlerde farklı floresan protein chimeras beyin dilimleri içinde ifade kullanılmıştır.

    1. Çoğaltma eksik AV RNA yöntemlerine göre ilgi ifade etmek için başka bir bölümünde13,14hazırlayın. Titresi virüsler bulaşıcı U/mL virally ifade bir protein bir antikor kullanarak seri seyreltme yöntemiyle için açıklanan14. Cofilin toplamları ve cofilin-aktin çubuk oluşumu, cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plazmid #51279)16kullanmak gözlemlemek için.
      Not: Sitomegalovirüs organizatörü birçok hücre türleri13seviyelerinde yüksek ifade sürüş için yararlıdır, ancak synapsin 1 organizatörü nöronal belirli ifade15için mükemmel bir seçim olduğunu.
    2. AAV aktarımını co transfection tarafından viral E1 gene, yukarıda açıklanan17olarak,18tedarik HEK293 ambalaj hücrelere faiz gen içeren Plazmid ve rep/kapak plazmid ile veya olmadan yardımcı plazmid hazırlayın.
      Not: Rekombinant AAV da konak hücre genomu19içine hedeflenen ekleme için yapılabilir. Transfer plazmid için içine bir synapsin organizatörü içeren AAV plazmid aşağı kalsiyum sensör GCaMP5G20klonlanmış bir etiketle C-terminal mRFP1 floresan protein (plazmid #50856) insan cofilin 1 kullanın. P2A kendi kendine sıyırmada peptit dizisi kodlama DNA parçası PCR GCaMP5G ve cofilin-RFP arasında tarafından ifade bir tek AAV transkript21her iki proteinlerin sağlamak için transfer plazmid hazırlanması sırasında eklenir.
    3. Rekombinant lentivirus vektörler gen veya viral gag, pol, devir ve vsv-g genler üzerine böler karışımı ambalaj bir üçüncü kuşak lentivirus birlikte faiz ve entegrasyon sinyallerin cDNA içeren transfer plazmid co transfection hazırlayın üç ayrı plazmid22,23.
    4. Transfer plazmid için tek bir adım sistem24 klonlama synapsin organizatörü ve cofilin-R21Q-mRFP cDNA (dan plazmid #51279) pLKO.1-GFP (plazmid #30323) synapsin organizatörü ve cofilin-R21Q-mRFP hPGK eski yerine koymak ile içine düzenlemek için kullanın organizatörü ve GFP cDNA, anılan sıraya göre.
    5. Son plazmid HEK293T hücrelere yukarıda açıklanan23Kalsiyum fosfat tarafından transfect.
    6. Orta dört 10 cm yemeklerini toplamak, 150 K-kesme santrifüj yoğunlaştırıcıları kullanarak 500 µL konsantre ve sonra buz gibi hızlı sıvı azot içinde küçük aliquots son lentivirus-80 ° C'de depolamak. Hücreleri bulaşmasını için bir aliquot sadece bir kez çözülme.
    7. Ampirik olarak ifade transgenes enfeksiyon sonra virüs çeşitli birimler ile takip etmek bir dizi farklı dilim kültürler ayarlayarak istenen ifade derecesi elde etmek her virüs türü hacmi hazırlanan belirlemek.
      Not: Genellikle 1-10 µL şunun dilim kullanılır.

    6. dilim tedaviler

    1. Dilimleri ile virüs bulaşmasını
      1. Biyolojik Güvenlik düzeyi için vektör uygun virüs çalışmak için onaylanmış bir biyolojik güvenlik kabin çalışarak, bir aliquot (genellikle 1-10 µL) şunun tam orta 0.8 mL ile karıştırın.
      2. Steril bir Pasteur pipet çamaşır suyu içeren bir koleksiyon tuzağa kullanma dilim ortamından Aspire edin. İkincil bir tuzak her zaman ilk tuzak ve vakum kaynak arasında kullanılır.
      3. Virüs içeren aliquot yukarıda hazırlanan bu orta yerine, kültür tüpleri bir raf için dönün ve kuluçka makinesine koyun.
      4. 2-5 gün virüs biyolojik güvenlik kabin dilimlerle kuluçka sonra steril transfer pipet ile virüs içeren orta çıkarın ve virüs öldürmek için onaylanmış bir antiviral ajan içeren bir şişe içine yerleştirin.
    2. Nöronların hayati boya boyama
      1. Hazırlamak ve floresan nöronal hayati boya25 aliquots aliquots sıvı azot 100 µM bir konsantrasyon, hızlı dondurma 4 µL depolayabilirsiniz ve bunlar-20 ° C'de depolayın Donma/boya birden çok kez çözülme değil.
      2. Floresans mikroskobu tarafından nöronlar görselleştirme için etiket, bir aliquot nöronal hayati boya, buzlarını ve tam Neurobasal ortamda 4 ml seyreltik (son boya konsantrasyonu olduğunu 100 nM).
      3. Orta dilimleri kaldırmak aspirasyon (veya ortam virüs içeriyorsa bir transfer pipet ile) ve eski yerine koymak o ile 0.8 mL 100 nM nöronal hayati boya içeren orta. Dilimleri silindir aparatı kuluçka dönün.
      4. 2 h için dilimleri kuluçka sonra boya içeren orta Aspire edin ve 0.8 mL biyolojik güvenlik kabin taze tam orta yerine.
        Not: hayati boya dilimlerle nöronlarda etiketlerine göre kuluçka birkaç saat gerektirir. İlk görüntüler genellikle boya tedaviden sonra 24 h alınır. Nöronlar özel olarak etiketlenir olsa daha iyi nöronal görüntüleme vermek için 2-3 gün içinde düşüşler arka plan floresan. Hayati boya yoğunluğu 72 h sonra azalır.
      5. Zaman içinde dilim Morfoloji değişiklikleri takip etmek, her 7 günde dilimleri etiketlemek.

    7. dilim görüntüleme

    1. Ters bir mikroskop görünüm dilimleri. En parlak Floresans görüntüleme, görüntüleme önce 24 h kültür orta fenol Red pH göstergesi olmadan tam Neurobasal A orta ile değiştirin.
      Not: rapor burada deneyler için dilimleri bir doğrusal kodlanmış donatılmış bir ters dönen disk confocal Floresans mikroskobu üzerinde görüntülenen x, y sahne piezo z kontrolü ve hassas bir yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi ile.
    2. Transfer silindiri tüp cihazları coverslip dik tutmak için sahne bağdaştırıcısı (şekil 5B), yerleştirilen özel yapım tüp sahibi (şekil 5A), için yansıması için dilim kültür ile tüp Amaç ve uzun aralıklarında tekrarlanan görüntüleme oturumları sırasında aynı yönde dilim korumak.
    3. Kaydırıcıyı sahne bağdaştırıcısında tüp (şekil 5B) pozisyonda tutmak için tüp karşı sıkı bas.
    35 ° C sıcaklıkta dilim görüntüleme sırasında Isıtma şeritler ve ve bu özel yapım aşamasında adaptörü (şekil 5C) inşa bir tüketicinin denetleyicisi kullanım ile sürdürmek.
    Not: Ayrıntılar tüp sahibinin sahne bağdaştırıcısı ve ısıtıcı erişilebilir: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • Düşük güç kullanarak (örn., 4 X) objektif ve parlak alan transillumination, dilimin altında photoetched ızgara desen (şekil 6A) odaklanın. İlk görüntüleme oturum için hızlı bir şekilde bulun ve nerede daha yüksek büyütme görüntüleme isteniyorsa çeşitli bölgelerin kaydedin dilimin etrafında tarama (örneğin, cornu ammonis (CA) 1, CA3, dentat gyrus (DG), vb).
  • Sahne bir bölge ilgi içeren ilk kılavuz kareye hareket ettirin. 20 X hava amaç geçin ve indirgeme bir işareti bulun (örn., kazınmış bir numarası ucu) (şekil 6B).
  • Bir daha yüksek güç objektif (40 X ya da 60 X) geçin, indirgeme mark ve sonra kaydı x ve y konumu Sahne Alanı'nın yerelleştirilmesine. X ve y uzaklıklar indirgeme Mark'tan (şekil 6B, ok) faiz yakın ve kayıt alanları bulmak için sahne alanı hareket ederler. Diğer kılavuz alanlarında istenirse yineleyin.
    Not: Bu off-set pozisyonlar indirgeme Mark tutarlı zaman dilimi görüntüsü, aynı coverslip konumunu saptayarak izin orijinal x, y indirgeme işareti değişir olsa bile ne zaman tüp veya sahne bağdaştırıcısı kaldırılır ve değiştirilir.
  • Görüntüyü Z-yığın içinde mikroskop objektif denetim veya bir piezo sahne denetimi kullanarak seçili tüm alanlara varsa yakalamak.
    Not: Görüntü uçaklar genellikle boyutu ve görüntü özellikleri çözünürlüğe bağlı olarak 2 µm için 0.5 µm aralıklarıyla elde edilir. Kaliteli 3D görüntü oluşturmak için görüntü özelliklerini edinme birden çok düzlem üzerinde genişletmek ve çok daha küçük özellikleri görmek için daha küçük aralıklar uçaklar arasında gerekli olan gerekir.
  • Her dilimin olabildiğince kısa süre Imaging toplam tutmak.
    Not: Çoğu görüntüleme oturumları burada altında 18 dk/dilim olduğunu bildirdi. Ancak, on veya daha fazla kez ve hatta bazı dilimleri görüntüsü dilimin uzun vadeli hayatta belirgin zarar vermeden tek bir oturumda 40 dk sürece.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    İndirgeme işaretleri nasıl doğru belirlemek için kullanılması gereken zaman içinde aynı alanları aynı hücrelerde reimage için biz photoetched coverslips (şekil 6A) yetiştirilen dilimleri incelenir. Nöronlar görselleştirildiği hayati bir boya ile boyama (100 nM için 2 h; sigara nöronal hücre leke değil), hangi kaybolur neurons zamanla hücreler25zarar vermeden. Biz bir indirgeme tespit etiketleme sonra bir bölge hayati b...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Burada açıklanan roller tüp yöntemi uzun vadeli kültür ve dilimlenmiş beyin dokusunun yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme olanağı sağlar. Bir dilim tekniği gibi burada montaj ve bakım dilim olduğunu. Dilim yapışma, destek Coverslip kaplama teşvik neurites akıbet ve hücre dilim dışarı geçiş güçlendirerek dilim inceltme; Böylece, bu yüzeylerde kullanımı kaçınılmalıdır. 3-aminopropyltriethoxysilane ile tedavi kadehte üzerine amino grupları ekleme dilimleri bağlılık gelişmiş, ama çok az ya da çok fazla tavuk plazma coversl...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    15 cm kültür kaplarından alt kısımlarVWR Scientific25384-326
    Yıldız Başlı Makine Vidaları (# 10-32)Ace Donanım2.5 "uzunluğunda ve 3/16" çapında
    Düz Pullar # 10ACE Donanım
    Makinesi Vida Somunları (# 10-32)ACE Donanım
    Kauçuk Rondelalar ACE Donanım5/16", kalın; 5/8", delik çapı; 1.125", OD
    Polietilen boru (5/16"; OD, 3/16"; ID)ACE Donanımı1.8 "uzunluğa kadar
    kesilmiş Kilit Yıkayıcı # 10ACE Donanım
    Matkap Presi, 5 hız Ace Hardware ProTechModel 1201
    Nunclon Delta Düz Kenarlı BorularVWR62407-076
    Matkap uçları, 3 mm, 6 mm ve 15 mm Ace DonanımDiablo freud markaPlastik kesmek için matkap uçları.
    Ahşap için matkap uçları, 1,5 cm ve 1 mmAce Hardware
    Ahşap eğe, 1/4" yuvarlakAce Harware
    Yaylı klipsler, 16 mm çıtçıt tutucuAce Hardware
    Döner Kafa Çapak Alma Aleti, 5"Ace Hardware26307
    Yapışkanlı Silikon Levha (Güvenli Conta)Grace Bio-Labs6665810,5 mm Kalınlık
    6 mm delgeçOfis Maksimum
    12 mm delgeçthepunchbunch.com
    %70 Etanol Fototeknik
    Lamel, 12 mm çapBellco Glass, Inc.1916-91012
    Bunsen Brülör
    Mutlak Etanol
    Nanosaf Su
    3-aminopropiltrietoksilaneSigma-AldrichA3648
    AsetonSigma-Aldrich179124
    # 5 Dumont ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-30
    McIlwain Doku DoğrayıcıTed Pella, Inc.10180
    Çift Kenarlı Tıraş BıçağıTed Pella, Inc.121-6
    Whatman Filtre KağıdıVWR28450-1825,8 cm çapında daireler halinde kesin
    Poli-kloro-trifloro-etilen (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-105,8 cm çapında daireler halinde kesin
    # 21 Cerrahi BıçakVWR Scientific25860-144
    # 5 Dumont ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-30
    Spatula, konik uçlu paslanmazVWR82027-518
    Gey'in Dengeli Tuz ÇözeltisiSigma-AldrichG9779 
      GlikozThermoFisher Scientific15023-021%25 (a/h) Çözelti, 0,2 mm filtre sterilize
    edilmiş Tavuk PlazmaCocalico Biologicals30-0300-5LSteril suda rehidrat, 2500 x g'de santrifüjleyin 30 dakika 4 &° C'de; C, alikotları sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve şurada saklayın: -80 derece >C.
    Trombin, Topikal (Sığır)PfizerTrombin-JMISağlanan seyrelticide 1.000 uluslararası birim / mL'de sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma alikotları ve -80 ° C'de saklayın. 250 birim / mL'de kullanın.
    Hücre Silindir SistemiBellco BiotechSciERA
    Silindirli İnkübatörFormaModel 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Kalem/Strep (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 mM GlutaminThermoFisher Scientific25030081
    GlukozThermoFisher Scientific15023-021%25 (a/h) Çözelti, 0,2 mm filtre sterilize edilmiş
    Neurobazal AThermoFisher Scientific10888-022 Tam Ortam: 48 mL Nörobazal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamin, 0.180 mL %25 Glikoz, 0.250 mL 100x kalem/strep.
    Üçüncü nesil lentivirüs ambalajıYaşam TeknolojileriK4975-00
    159 K kesme santrifüj filtreler (Centricon)EMD Millipore
    Lentiviral klonlama sistemi (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Nöronal hücre canlılık boyası (NeuO)Kök hücre teknolojileri1801Bir kez çözün ve 4 & mikro'da hızlı dondurun; L alikotlar. -20 ° C'de saklayın; C
    Ters mikroskopOlympusIX83
    Mikroskop objektifleriOlympusair: 4X, 20; yağ: 40X, 60X,
    Eğirme diski konfokal sistemYokagawaCSU22
    Mikroskop EMCCD kameraFotometriCascade II
    Doğrusal kodlu (x,y), piezo z düz üst kademeASI
    Mikroskop lazerleri ve entegrasyonuAkıllı Görüntüleme Yenilikleri
    HEK293T hücreleriAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-3216
    İnsan PlazminiSigma AldrichP18670.1 sığır serum albümininde 0.002 U/mL (0.2 mm filtre sterilize), sıvı nitrojende hızlı dondurma ve -80 ° C'de saklayın.

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
    2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
    3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
    4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
    5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
    6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
    7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
    8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
    9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
    10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
    11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
    12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
    13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
    14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
    15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
    16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).
    17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
    18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
    19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
    20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
    21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).
    22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
    23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27(2010).
    24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89(2015).
    25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
    26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
    27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
    28. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
    29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
    30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10(2011).
    31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).
    32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6(2015).
    33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Brain Slice CultureRoller Tube MethodPhotoetched CoverslipsFluorescence ImagingViral Vector ExpressionNeuronal Vital DyeConfocal MicroscopyHippocampal SlicesLong term CultureEnclosed System

    Related Articles