Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

17.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56441

⸱

12 Nisan 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Özet

Moleküler genetik araştırmalar onun müthiş araçlar nedeniyle Arabidopsis thaliana bitki Biyoloji ve başta bitki üreme biyolojisi en önemli modeli türlerinden biridir. Ancak, bitki morfolojik, anatomik ve ultrastructural analizler geleneksel olarak zaman alıcı gömme ve yordamlar parlak alan, tarama ve elektron mikroskopi kesit olarak içerir. Confocal floresan mikroskopisi, state-of--art 3-b bilgisayar destekli Mikroskopik analizler ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılmak üzere moleküler teknikleri sürekli arıtma son ilerleme için artan bir talep yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri geliştirmek. Bu iletişim kuralı ' biz düzgün Arabidopsis çiçek ve siliques, temizleme teknikleri, temel anatomi tekniklerini tanımlamak ve bazı boyama işlemleri için bütün yapılar gözlemleri montaj.

Giriş

Çiçekler arasında en önemli organları kapalı tohumlular tanımlıyoruz. Çiçekli bitkiler ortaya çıktı bazı 90-130 milyon yıl önce1ve çeşitlendirilmiş hızlı rapid görünüşleri Charles Darwin2tarafından bir "iğrenç gizem" nitelendirildi. Bitki araştırmacılar çıkarlarını çiçek geliştirme çeşitlidir. Bir bütün veya belirli anatomik, yapısal ve işlevsel özellikleri çiçekler3,4,5,6 evrimi çiçek evrimsel kökeni anlamayla ilgili biraz araştırma odaklı . Çiçek formu ve yapısı, hem de onlara, güvenerek cinsel ve eşeysiz üremenin biçimi yüksek değişim son derece karmaşık bir yapı çiçek olun. Çiçek organlarını, genetik ve moleküler İncelemeler7ile kombine edilebilir ışık ve elektron microscopical teknikleri kullanarak anatomi ve yapısal özelliklerini tanımlamak için çeşitli çabalar yol açmıştır. Ayrıca, kaynak, meyve ve tohum, çiçek büyük önem insan ve hayvan beslenmesi için vardır. Bu nedenle, çiçek ve meyve geliştirme karakterizasyonu uygulamalı araştırma, gıda güvenliği için bir artan insan nüfusu ve ekolojik koruma stratejileri değişen çevre8 altında da dahil olmak üzere birçok etkileri vardır , 9 , 10.

Arabidopsis geliştirmede çiçek çiçek indüksiyon ve önümüzdeki (çiçek grubu) meristem için bitkisel meristem dönüşüm başlar. Çiçek primordia yanal önümüzdeki meristem11Açıl başlatılır. Çiçek organ primordia giderek çiçek ortasına dışarıdan konsantrik gözlemleyebileceğiniz form ve sonunda sepals, yaprakları, stamens ve carpels7geliştirmek. Çiçek Bu organların farklı besin, koruyucu ve fonksiyonel (örneğin, tozlayıcı cazibe) yerine farklı bitki türü, erkek ve dişi gametophytes, sırasıyla12 gelişimi sürdürülmesi cinsel organları ile rolleri , 13. gametophytes, buna karşılık, her bir çift erkek (sperm) ayırt etmek ve kadın gametler (yumurta ve merkezi hücre), üzerine birleştirmek çift döllenme nesil, zigot ve birincil endosperm oluşturmak için bir terminal doku destekleyen embriyo14,15geliştirilmesi. Meyve ve tohum geliştirme desteği büyüme, olgunlaşma ve embriyo ve sonunda, onun dağılma korunması. Kapsamlı bir araştırma modeli tür Arabidopsis7,16,17, özellikle farklı bitki türleri çiçek ve embriyo geliştirilmesinde karakterize etmek için yapıldı.

Çiçek gelişiminin erken Mikroskopik analizler zaman alıcı örnek işleme ve gözlem teknikleri, parafin veya reçine katıştırma ve kesit, gibi ışık ya da elektron mikroskobu ile birlikte dayalı idi. Bu geleneksel mikroskobik teknikler kez mutantlar, RNA Yerelleştirme in situ hibridizasyon tarafından veya IMMUNO-algılama proteinlerin microscopical analizleri gibi moleküler genetik araştırmalar ile birlikte kullanılmaya başlanmıştır. State-of--art 3 boyutlu bilgisayar destekli görüntü analizleri ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılabilir moleküler yöntemler sürekli arıtma geniş alanlı ve confocal floresan mikroskopi son ilerleme için bir ihtiyaç yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri kantitatif analizleri için tercihen mükellef bulunmaktadır. Son yıllarda, önemli bütün Dağı hayvan numune Temizleme teknikleri geliştirme konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Onlar render örnek şeffaf Sulu üre veya şeker tabanlı reaktifler (örneğin, ölçek, SeeDB, kübik) kullanarak18,19,20, veya seçici (SDS deterjan kullanarak) lipidler sonra kaldırarak örnekleri istikrarlı hydrogels katıştırma; lipidler kaldırılması olabilir pasif Difüzyon tarafından elde (örneğin, değiştirilmiş NETLİK protokolü21, PAKTI-PARS-jantlar22) veya aktif Elektroforez (orijinal NETLİK protokolü23 ve hareket-PRESTO24). Bu hızlı ilerleme tarafından teşvik, türetilmiş bazı teknikler de bitkiler kullanmak için ortaya çıkıyor.

Bu yöntemleri kağıt model Arabidopsisüzerinde duruldu, biz için prosedür çiçek tomurcukları, çiçek ve genç siliques uygun diseksiyon ve tüm montaj örnekleri çeşitli boyama için takas ve gözlem yordamları kullanarak tarif Klasik veya son SDS-esaslı temizleme yöntemi. Nişasta, callose ve Kromatin boyama örnekleri verilmiştir. Her ne kadar bu yordamları daha fazla geliştirmeleri ve diğer türler ile kullanıldığında uyarlamalar ihtiyacınız, onlar için daha fazla araştırma birçok araştırma projelerinin başlangıç noktası olan bu basit ama kritik yöntemlere sahne umuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. çiçek ve Silique fiksasyon

  1. Hasat çiçekler ve bitkiler siliques ilk çiçek açılışında senkronize.
    Not: Burada kullanılan deneysel koşullar altında yaklaşık 21 gün sonra Murashige ve Skoog (MS) plakalar üzerinden ekimi için toprak çiçekli bitkiler başlatın. Tohumları 4 ° C'de 3-4 gündür tabakalı ve germinated/MS plakaları 22 ° C/16 h ışık ve 18 ° C/8 h karanlık 8-10 gün önce besin açısından zengin toprak (şekil 1) aynı koşullarda muhafaza tencere fide dikim, yetiştirilen. Özel araştırma amaçta çoğaltır sayısını bağlıdır, ancak en az 5 çiçek (bitkilerden 5 bireysel) her tedavi için önerilir. Çiçekler deneysel birimi ise 10 çiçek REPLICATE başına en az önerilir.
  2. Çiçek veya küçük makas (örneğin, tırnak makası) kullanarak çiçek (şekil 1E-H) kesme ve onları hemen bir microcentrifuge tüp (için tek önümüzdeki/çiçek fiksasyon) veya (için toplu tespitlerin) konik tüp yerleştirin taze içeren yapılan Carnoy'nın, metanol/Asetik asit veya FPA50 Fiksajlar (uygulamaya bağlı olarak, aşağıya bakınız) buz üzerinde.
    Not: Örnekleri tamamen sabitleştirici ve sular altında.
  3. Mendil sabitleştirici 4 ° C'de bir gecede 4 h içinde bırak
    Not: Vakum infiltrasyon doku sabitleştirici penetrasyon kadar hızlandırmak için kullanılabilir, ancak bu doku yapısını koruyarak için zararlı olabilir. Yazarlar vakum infiltrasyon uygulamak değil.
  4. Sabitleştirici kaldırmak, örnekleri karşılamak için yeterli % 70 etanol eklemek ve onları 4 ° c en az 24 saat için dönmek; örnekleri Bu çözümde sonsuza kadar kalabilirsin. Etanol kaldırdıktan sonra hemen bir sonraki adıma geçin; diseksiyon veya SDS takas.

2. Stereomicroscope altında diseksiyon

  1. Yerine % 70 etanol küçük bir petri destek yerleştirilmiş bir saat maker's cam taze yapılmış.
  2. Yer önümüzdeki/çiçek/silique bu taze sabitleştirici yaptı ve bir iğne ile forseps ve bir şırınga kullanarak stereomicroscope altında incelemek.
    1. Bir saat maker's cam veya çiçeklenme diseksiyon ve olgun çiçek (sepals, yaprakları ve bu aşamada disseke ercik can çiçek organlarını parçalıyor (önerilen) etanol ile tamamen kapalı olmak örnekleri sağlar benzer aygıtı ) örnekleri kurumasını önlemek için.
  3. Siliques ve slayt üzerindeki küçük çiçek tomurcukları aşağıda açıklandığı gibi incelemek.
    1. Saat maker's cam önceden işlenmiş örnekleri ile bir kenara bırakıp normal bir slayt için son diseksiyon kullanın.
    2. Örnek ilgi slayta geçin ve taze % 70 etanol 10 µL ekleyin. Hızla son diseksiyon üzerinde çalışmak ve etanol, 10 µL örnek olmadan aşırı sıvı nemli tutmak gerekirse ekleyin.
    3. Polen taneleri stamens--dan serbest bırakmak için bkz: adım 5.1. Carpels ve ovules dissekan için Şekil 2' de açıklanan yordamı izleyin. Bu işlem gelişimi karpel yeşil siliques gelişimi aşaması dahil olmak üzere, tüm aşamaları için geçerlidir.
      Not: Eğer örnekleri hareket yeterli etanol etkilenmişimdir etanol eklemeyin; çok küçük örnekleri dissekan içinde en az bir miktar sıvı daha kolay olur. Her zaman sadece faiz (sepals, yaprakları, stamens, carpels, ovules, tohum veya polen taneleri) organlarının slayt üzerinde tutun. Bu yordam slayt arasındaki coverslip, muayene, bir daha yüksek homojenliği ve böylece verimliliği mikroskobik muayene (daha yüksek sayıda hedef örnekler için sonuçlanan altında organ kalınlığı karşılık gelen bir üniforma kalınlığı sağlayacak aynı odak düzlemi içinde).
  4. Küçük bir Bloting kağıt parçası emer ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Hızlı bir şekilde örnek kurur önce sonraki adıma (Bölüm 3, 4 veya 6) geçin.

3. kloral hidrat tabanlı takas ve kombine takas boyama

Not: En iyi sonuç için takas kloral hidrat tabanlı malzeme sabit FPA50 ile elde edilir.

  1. Çözüm açıklığın yer 20 µL (kloral hidrat/gliserol, değiştirilmiş Hoyer'ın orta, Herr'ın 4½ veya Bay'nın IKI-4½ çözümleri) numune taşıyan slayt üzerinde. Şırınga bir çift hypodermal iğne ile kullanarak aralarındaki boşluğu azaltmak ve o saygısız gerektiği gibi örnekler getirin nerede faiz organı yüzleri aşağıya doğru. Kalan herhangi bir hava kabarcığı iğne kullanarak kaldırın.
  2. Bir coverslip yana doğru alt ve yavaşça, yavaşça basarak yerleştirin ve takas çözüm arasındaki boşluğu doldurur kadar bekleyin. En az kliring çözüm, gerekirse coverslip altında tüm boşluğu doldurmak için ekleyin.
  3. Slayt yer bir slayt tutucu ve duman başlık altında bırakın. Mikroskobik gözlemler sonra en az 4 h ve aşağıdaki 4 – 5 gün boyunca devam edin.

4. kombine boyama Alexander ve nedir Herr'ın 4½ takas

Not: Özgün Alexander Protokolü boyama önce polen taneleri slayt üzerinde bırakmadan üzerinde dayanır. Bir verimli ve daha bilgilendirici, modifiye boyama ve yordam temizlemek olduğunu olgun ama dehiscent sigara nedir içinde olgun polen taneleri boyama Alexander.

  1. Dehiscent jwiles ile açmak üzere olduğunuz taze hasat çiçek tomurcukları seçin.
    Not: Alexander boyama olgun polen taneleri için tasarlanmıştır ve verimli bir şekilde olgunlaşmamış polen taneleri leke değil çünkü genç çiçek tomurcukları yapmayız. En az 5 çiçek başına hasat farklı bitki ve çiçek tedavi önerilir.
  2. 96-şey plaka bir çiçek tomurcuğu daldırın için yeterli Alexander'ın solüsyonu ile hazırlayın. Sepals ve yaprakları kaldırarak jwiles ortaya çıkarmak ve onları Alexander'ın çözümde bırakın. Örnek 1-3 h duman başlık altında tutun.
  3. Alexander'ın çözüm Herr'ın 4½ çözüm ile değiştirin ve geri bir gecede kuluçka için duman başlık altında çok iyi tabak yerleştirin.
  4. Forseps kullanarak, yeni bir slayt üzerine temizlenmiş çiçek tomurcukları yavaşça hareket. Alexander'ın çözüm bazı etkilenmişimdir oluşabilir beri Bloting kağıt kadar takas çözüm mümkün olduğunca kaldırmak için kullanın.
  5. Stamens incelemek ve tüm diğer dokulara kaldırın. 3-Herr'ın 4½ çözüm kullanımı bölümündeki adımları izleyin.

5. kaldırma Exine polen taneleri

Not: Carnoy'nın sabitleştirici DAPI boyama için kullanmanızı öneririz.

  1. 1 ve 2 bölümlerinde açıklandığı fiksasyon ve diseksiyon yordamları izleyin. Artık, bir slaytta yer alan en az miktarda % 70 etanol içinde birçok stamens birine olması gerekir.
  2. Aşırı etanol kaldırmak için Bloting kağıt kullanıp 5 – 10 µL DAPI çözüm ekleyebilirsiniz. Birkaç tane şırınga iğneleri ile kullanarak, polen taneleri içinde çözüm (örneğin, ercik ve diğer polen taneleri serbest bırakmak için hareketsiz için bir şırınga kullanılması) az bu miktarda serbest bırakın. Çözüm kurur, DAPI başka bir 5 µL ekleyin.
  3. Sadece polen taneleri slayt ve coverslip arasında kaldı böyle ercik tüm enkaz kaldırma önemli bir adım olduğunu.
  4. Bir coverslip yana düşürerek numune taşıyan slayt üzerinde yerleştirin ve DAPI çözüm boşluğu doldurmak için gereken en az miktarda ekleyebilirsiniz. Coverslip üzerinde bir işaret parmağı yerleştirin ve çok ezici olmadan çok yapmak hızlı, sağlam ve kısa hareket kayar.
    Not: gerekli kuvvet ve sürgülü hareket genliği ölçmek için bu adımı birkaç kez, sonuçlar her zaman mikroskop altında kontrol icra edilebilir.
  5. Gerekirse DAPI çözüm ekleyin ve 15 dakika 4 ° C'de karanlık nemli bir kutu içinde Slayt 1 h. örnekleri geniş alanlı floresan veya 24 h içinde confocal mikroskobu altında izlemeye devam etmek için deneyin bu yordamı daha fazla olup olmadığını kontrol etmek için takas SDS ile birleştirmek için yer geliştirmek ments elde edilebilir.

6. Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Temizleme

Not: Bağlı olarak çözümlenmesi için çiçek organ ve çok yumuşak ve küçük örnekleri incelemek için araştırmacı becerileri, SDS tedavi (için deneyimli araştırmacılar) ya da daha önce yapılabilir veya diseksiyon adım sonra (daha az deneyimli için araştırmacılar) metanol Asetik asit malzeme sabit.

  1. Bir saat maker's cam, içbükey bir slayt veya bir microcentrifuge tüp disseke veya sigara disseke örneklerinde % 1 SDS ve oda sıcaklığında gecede 0.2 N NaOH çözüm kuluçkaya için kullanın.
  2. Çünkü örnek çok yumuşak ve şeffaf bir görünüme sahip bakım ile başa. Birkaç kez su ile durulayın.
    Not: Kalıntıları SDS çözüm için yağış ekleyerek boyama çözüm, örneğin, anilin mavi neden olabilir.
  3. Sigara disseke örnekleri için Bölüm 2, % 70 etanol yerine su kullanarak açıklanan diseksiyon yordamı izleyin. İstenen doku anatomi sonra herhangi bir kalıntıları ve enkaz ve aşırı su bir Bloting kağıt kaldırmak sonra 20-40 µL boyama çözüm ekleyin ve 6.5 adımla devam edin.
  4. Disseke örnekleri, dikkatle örnek çamaşır çözümden taşıyın ve temiz bir slayt yerleştirin ve 20-40 µL boyama çözüm ekleyin.
  5. Yavaşça bir coverslip yana düşürerek slayt üzerinde yerleştirin. Hazırlık squash değil için dikkat ediniz. Doku çok yumuşak ise, öyle ki coverslip örnek ezmek değil herhangi onun köşe (örneğin, teyp veya kırık bir coverslip), coverslip ve slayt arasında ayırıcı olarak ince yer bir odası gibi coverslip ve slayt mesafesi.
  6. Tüm slaytlar yer nemli bir kutu içinde alüminyum folyo ile kapatın ve en az 1 h. widefield floresan veya 24 saat içinde confocal mikroskobu kullanarak numune izlemeye devam etmek için 4 ° C'de yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Arabidopsis bir corymb (şekil 1) biseksüel tanzimi ile çiçek taşıyan Brassicacea ailesine ait. Her çiçek dört sepals, dört yaprakları, altı stamens (dört uzun lafın kısası iki) ve dört konsantrik gözlemleyebileceğiniz25,26yılında düzenlenmiş iki doğuştan erimiş carpels (şekil 1F-H) oluşan bir syncarpous gynoecium var. Arabidopsis tenuinu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Birçok çiçek tomurcukları Arabidopsistüm çiçek gelişim aşamalarında, kapsayan, tek bir önümüzdeki içinde varlığını bir tedavi ya da bir gelişimsel özelliği bir etkisi karakterize yönelik çalışmalar için eşsiz bir fırsat sunuyor aynı anda farklı gelişimin çiçek arasında. Farklı bireysel bitkiler arasında iyi bir referans noktası ana önümüzdeki ilk çiçek açıyor. Bitkiler çiçekli eşitlenir şekilde tedavi edilir (örneğin, 3-4 gün stratifikasyon 4 ° C'de en üst düzeye çıkarır zaman uyumlu tohum çimlenme ve d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Zürih Üniversitesi tarafından bir IEF Marie Curie Grant desteklenmiştir (Hayır verin. A.H. TransEpigen-254797), Avrupa Araştırma Konseyi gelişmiş verilmesi (Hayır verin. MEDEA-250358 U.G. için) ve bir araştırma ve teknoloji geliştirme projesi (grant MecanX U.G. için) SystemsX.ch, İsviçreli girişimi sistemleri Biyoloji.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler ve Malzemeler< / güçlü >
EtanolScharlauET00102500
Asetik Asit UygulamasıA3686,2500% 100 Moleküler biyoloji sınıfı
Buzul Asetik AsitSigma-Aldrich320099Moleküler Biyoloji Sınıfı
MetanolScharlauME03062500
FormaldehitÇözeltisi Sigma-AldrichF1635
Propiyonik asitSigma-Aldrich81910-250 ml
Kloral hidratSigma-Aldrich15307
GliserolRoth3783.1
Arap zamkıFluka51198
Laktik asitFluka69773
FenolSigma-Aldrich77607-250MLSıvı fenol kullandık (çözeltiniz için gerekli hacmi bulmak için yoğunluğu kullanın)
Karanfilyağı Sigma-AldrichC8392-100ML
KsilenRoth4436.1
İyotFluka57665
Potasyum iyodürMerck5043
Malakit YeşilFluka63160
Fuchsin asitFluka84600
Turuncu GSigma7252
Sodyum Dodesil SülfatSigma-AldrichL3771Moleküler Biyoloji Sınıfı
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich71690
Sodyum di-Hidrojen FosfatUygulamasıA1047,1000
Sodyum fosfat dibazikSigma-AldrichS9763-1KG
Potasyum fosfatSigma-Aldrich04347
EDTAUygulamasıA2937,1000
CalcofluorSigmaF6259Floresan parlatıcı 28
AuramineChroma10120
DAPISigmaD9542toksik
Triton-X-100SigmaT8787
Anilin mavisiMerck1275
MS ortaCarolina19-57030
Besin açısından zengin substratEinheitserdeED73
Saat yapımcısının camıBelirli bir marka yok
15 ml falcon santrifüj tüpleriVWR62406-200
Dumond ForsepsOnaylı0208-5SPSF-PS
ForsepsDUMONT BIOLOGY0108-5
ŞırıngaBDBD Plastipak 3000131 ml
Hazırlık iğnesiBDBD Microlance 304000
Mikroskop slaytlarıThermo Scientific10143562CEkesik
kenarlar LamellerThermo ScientificDV40008
Nemli kutuİçinde nemli kağıt havlu ve sürgülü destekler bulunan plastik bir kutu
Adıgüçlü<>Şirket<>Katalog NumarasıYorumlar
Çözümler>
Fiksatifler
Carnoy'un (Çiftçinin) fiksatifiMutlak etanol : buzlu asetik asit, 3:1 (ml:ml)
Metanol/asetik asit fiksatif%50 (h/h) metanol, deiyonize suda %10 (h/h) buzlu asetik asit
FPA50 fiksatifFormalin, propiyonik asit, %50 etanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Temizleme çözeltileri
Kloral hidrat/gliserolKloral hidrat: gliserol: su, 8:1:2 (g:ml:ml). DIC mikroskobu ile tüm çiçek gelişim evrelerinde ve silique gelişiminde kullanılabilir. En iyi fiksatif formalin bazlı FPA50
Modifiye HoyerGum arap 7.5 g, kloral hidrat 100 g, gliserol 5 ml , su 30 ml'dir. DIC mikroskobu ile tüm çiçek gelişim evrelerinde ve silique gelişiminde kullanılabilir. En iyi fiksatif, formalin bazlı FPA50
Herr's 4 & frac12'dir; temizleme sıvısıLaktik asit, kloral hidrat, fenol kristalleri, karanfil yağı, ksilen; ağırlıkça 2:2:2:2:1. Tüm çiçek gelişim aşamaları için (özellikle ercik gelişimi için) ve DIC mikroskobu ile silique gelişimi için kullanılabilir. En iyi fiksatif, formalin bazlı FPA50
SDS / NaOH çözeltisidirSDS ve NaOH stok çözeltisini %1 SDS / 0.2 N NaOH'ye (10x seyreltme) karıştırın-seyreltin. Çiçek ve silique gelişim aşamalarının tüm aşamaları için. En iyi fiksatif metano/asetik asit fiksatifidir; Diğer iki fiksatif de kullanılabilir. Kalkoflor, auramin, DAPI ve anilin mavisi boyama çözeltisi ile birleştirilebilir.
SDS stok çözeltisi%10 (a/h) sodyum dodesil sülfat. 10 g sodyum dodesil sülfatı 80 ml deiyonize suda çözün ve deiyonize su ile 100 ml'ye kadar yapın.
NaOH stok çözeltisi2 N NaOH çözeltisi: 4 g NaOH'yi 40 ml deiyonize su içinde çözün ve deiyonize su ile 100 ml'ye kadar yapın
Kombine temizleme ve boyama çözeltileri
Herr's IKI-4½Standart bir 4½'ye; (toplam 9 g) ekleyin: 100 mg iyot, 500 mg potasyum iyodür. Bu temizleme çözeltisi, kontrastı artırmak veya nişasta dinamiklerini karakterize etmek için tüm çiçek gelişim aşamaları ve silique gelişimi için kullanılabilir. Yapısal analiz için FPA50'yi ve kantitatif nişasta analizi için Carnoy'un fiksatifini kullanın.
İskender boyamaEtanol %95 10ml, malakit yeşili (%95 EtOH içinde %1) 1 ml, fuksin asit (%ddH2O içinde %1) 5ml, turuncu G (ddH2O içinde %1) 0.5ml, fenol 5g, kloral hidrat 5g, buzlu asetik asit 2ml, gliserol 25ml. Bu temizleme / boyama tek başına veya Herr's 4½ ile kombinasyon halinde; Çözelti, olgun ve üç hücreli polen taneleri olan çiçeklerde polen düşükünü değerlendirmek için kullanılabilir. Yeni yontulmuş, sabitlenmemiş malzemede kullanılır.
< güçlü > boyama çözeltileri< / güçlü >
Calcofluor çözeltisiCalcofluor% 0.007 suda (g: ml). Başlangıçta optik parlatıcı olarak kullanılır. Hücre duvarlarında selüloz, karboksilatlı polisakkaritler ve kallozu boyamak için kullanılabilir. Polen tanesinin iç kısmını lekelemek için sıklıkla kullanılır. Her üç fiksatif de bu çözelti ile kullanılabilir.
Auramin çözeltisiAuramin suda %0.01 (g:ml). Bu lipofilik floresan boya, diğerlerinin yanı sıra tırnak etlerini, kütikülleri ve ekzini boyamak için kullanılabilir. Her üç fiksatif de bu çözelti ile kullanılabilir
Calcofluor-Auramine karışımıAuramin çözeltisi : Calcofluor çözeltisi, 3:1. Her iki çözelti ile kombine boyama için kullanılabilir. Auramine göre daha küçük bir kalkoflor oranını koruyarak diğer oranlar test edilebilir.
DAPI çözeltisiDAPI 0.4 ug / ml, 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7),% 0.1 Triton-X-100, 1 mM EDTA. Bu çözelti, erkek ve dişi mayoz bölünme sırasında kromozom yayılımlarını ve herhangi bir dokunun hücre çekirdeğini boyamak için kullanılabilir. Polen tanesi gelişimini incelemek için sıklıkla kullanılır. Carnoy ve metanol / asetik asit bu çözelti için en iyi fiksatiflerdir. FPA50 gibi formaldehit bazlı fiksatifler lekelenmeyi engelleyebilir. UV'de uyarılma ve maksimum emisyon 461 nm civarındadır.
Sodyum fosfat tamponu (0.1 M)Proton reseptörü: 0.2 M Na2HPO4, proton vericisi: 0.2 M NaH2PO4, oran proton vericisi / proton reseptörü: 1.364 (pH 7 için)
Anilin mavisi çözeltisi%0.1 (a/h) anilin mavisi, 108 mM K3PO4 (pH 11), %2 gliserol. Bu çözelti, gelişimin birçok aşamasında kalloz ve selülozu boyamak için kullanılabilir (örneğin, erkek ve dişi teradlarda kalloz birikimi, polen tüplerinde kalloz tıkaçları). UV'de uyarılma ve maksimum emisyon 455 civarındadır. Hücre içeriği boyama için kırmızı emisyon ile 514 nm'de de uyarılabilir.
güçlügüçlü,

Kaynaklar

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631(2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129(2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Arabidopsis i ek DiseksiyonuKonfokal MikroskopiKloral Hidrat BoyamaAlexander Sol syonuHerr Sol syonuSDS Sodyum HidroksitDAPI Boyamai ek Organ AnaliziPolen Tanesi ncelemesi
Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.