Yöntem makalesi

C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün nörite fonksiyonel ve Neuropathological değerlendirmeler için ikna etmek için basit bir yaklaşım

9.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56455

⸱

9 Kasım 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

Bu makalede

Özet

Bu raporu başarıyla miyelin protein kullanarak deneysel otoimmün nörite (EAN) sıfır (P0)180-199 peptid Freund'ın tam adjuvan ve boğmaca toksin ile birlikte ikna etmek için basit bir yaklaşım özetlenmektedir. Biz doğru bir şekilde işlevsel açıkları ve bu EAN meydana nevropatoloji ölçüde değerlendirirken yetenekli sofistike bir paradigma mevcut.

Özet

Deneysel otoimmün nörite (EAN) otoimmün periferik demiyelinizan hastalıklar iyi takdir bir deneysel modeldir. EAN hastalığı inflamatuar saldırının periferik sinir sistemi (PNS) bileşenlerinin doğru yönlendirmek için fare ile Nörojenik peptidler immunizing tarafından indüklenen olduğu. Son gelişmeler EAN indüksiyon miyelin protein sıfır (P0)106-125 veya P0180-199 peptidler boğmaca toksin enjeksiyonu ile birlikte adjuvan teslim kullanarak nispeten dayanıklı C57BL/6 fare çizgi etkinleştirdiniz. EAN C57BL/6 zorlanma ikna yeteneği bu fare arka plan üzerinde mevcut çok sayıda genetik araçları kullanmak için izin verir ve böylece hastalığın patogenezinde, sofistike çalışma ve sorgulama roman therapeutics mekanik eylem sağlar transgenik yaklaşımlar ile birlikte. Bu çalışmada, EAN C57BL/6 farelerde P0180-199 peptid kullanarak başarılı bir şekilde ikna etmek için basit bir yaklaşım göstermektedir. Ayrıca bu modelde, neuropathological özellikleri dizesi ile birlikte ortaya çıkan fonksiyonel açıkları değerlendirilmesi için bir protokol anahat. Böylece, insan periferik demiyelinizan neuropathies patogenezi okumaya ve miyelin onarım teşvik ve otoimmün sinir hasarına karşı korumak amacı potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemek için güçlü bir deneme modeli bu modelidir nörite.

Giriş

Periferik neuropathies genetik kökenli veya edinsel, olabilir ya da metabolik, iskemik, enflamatuar veya toksik precipitants ile elde edilen neuropathies sahip. Bu hastalıklar da yararlı aksonal ya da demyelinative kökenli olarak sınıflandırılır. En yaygın alınan periferik neuropathies olan akut inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (AIDP, GBS Guillain-Barré Sendromu olarak da bilinir) demiyelinizan ve kronik inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (CIDP)1, 2 , 3 , 4; her ikisi de pathogenetically neden demiyelinizasyon periferik sinirlerin miyelin kılıf karşı yönettiği bir otoimmün reaksiyon ile karakterizedir. Bu hastalıklarda aktive T hücreleri kan sinir bariyerini çapraz ve PNS içinde bir bağışıklık reaksiyon oluşturur. O zaman makrofajlar içinde sinir aktivasyonu demiyelinizasyon fagositik saldırı üzerinden doğrudan veya dolaylı olarak felç ve duyusal disfonksiyon5gibi klinik Engelli sonuçlanan salgılanan inflamatuar aracılar üzerinden neden olur. Demyelinated akson demiyelinizasyon takip remyelinated yeteneği korumak, ancak remyelination kez ertelendiği veya eksik, geri dönüşümsüz hasara için çıplak aksonlar duyarlılık içinde kaynaklanan kalıcı klinik en önemli nedeni olduğu sakatlık. Şu anda, en etkili tedavi immunomodulatory, ama onların yeterlik rağmen birçok durumda kurtarma genellikle yavaş ve ~ % 25 hastaların önemli ölçüde azaltmak onların yaşam kalitesi6artık işlevsel açıkları yaşayacaksınız, 7.

EAN, değerli yorumlara Patogenez ve roman terapötik ajanlar4değerlendirmek için bir araç sağlamıştır periferik nöropati demiyelinizan yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelidir. Bu model tavşanlar gibi farklı türlerin indüklenen sıçanlar, fareler ve eskiden şiling şimdi pigs ve bağışıklama Nörojenik antijenleri ile tarafından indüklenen. Ancak, sonuçta başarılı EAN indüksiyon gerçekleşmesi hastalığı için uygun bir bağışıklık yanıtı bağlıdır. Tür (ve arası species/zorlanma) varyasyonları bağışıklık fonksiyonu göz önüne alındığında, Çoklu kombinasyonları antijenleri ve adjuvan başarıyla EAN ikna etmek için geliştirilmiştir. Fare genetik araçları açısından C57BL/6 en çok kullanılan olduğunu; Ancak, geleneksel P2 protein peptid 57-81 (P257-81) duyarlı SJL fare zorlanma8 hastalığında sonuçlanan yasadışı patogenezinde C57BL/6 gerginlik içinde işlevsel açıkları önde gelen değiştiremiyor. Neyse ki, sensitizasyon paradigmalar P0106-125 veya P0180-199 peptidler, kullanarak teslim adjuvan kombine boğmaca enjeksiyon ile toksin içinde kullanılmak üzere Gelişmiş genetik araçları etkinleştirme Bu bariyer üstesinden gelebilir fare EAN modeli.

Burada, EAN indüksiyon C57BL/6 farelerde için basit bir yöntem sunulur. Ayrıca, kapsamlı ve detaylı bir yaklaşım hastalığı ile ilişkili işlevsel ve neuropathological açıkları değerlendirileceği tarafından sağlanır. P0180-199 peptid9 P057-81 alternatif10tercih seçildi. P0180-199 modeli P057-81 alternatif10ile karşılaştırıldığında daha az şiddetli klinik belirtiler üretmek için açıklanan ve bu nedenle potansiyel olarak getirilmesi dayanacak şekilde yüksektir zararlı genetik tedirginlikler, cerrahi işlemler (örneğin, ozmotik pompa implantasyon) kurtarmak ve4test koşu bandı yürüyüş işleve mükellef. Ancak, koşu bandı yürüyüş fonksiyon testleri ve histolojik protokolleri burada açıklanan kolayca bir P0 indüklenen57-81 değişken hastalığında okurken uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

burada açıklanan tüm yordamlar Florey Enstitüsü tarafından Nörobilim ve ruh sağlığı (Melbourne beyin merkezi) hayvan Etik Komitesi için kabul edildi ve Avustralya uygulama kodu kullanımı hayvanlar için bilimsel için izleyin. Amaçlar.

1. EAN indüksiyon

Not: EAN başarıyla 6-8 hafta arasında yaşlı erkek C57BL/6 farelerde indüklenen. İndüksiyon Protokolü Toplamda 9 gün alır. Gün 0 ilk aşılama gün anlamına gelir. Bu iletişim kuralı için anestezi altında enjeksiyonları yapılmıştır (bkz. Adım 1.1.2 aşağıda).

  1. Üzerinde gün -1:
    1. boğmaca toksin hazırlamak (bakınız Tablo reçetesi) çözüm olarak 1.6 µg/mL steril 0.1 M fare izotonik fosfat kullanarak tamponlu tuz (MT-PBS).
    2. Anesthetization isoflurane ile:
      1. (C57BL/6, erkek, 6-8 hafta) fare anesthetization odasında yerleştirin ve oksijen akışı 1 L/dak için ayarlamak
      2. İsoflurane Buharlaştırıcı çevirmek, anesthetization ve nefes monitör için % 2.5 şekilde ayarlamak ve bekle 2 min için veya birincil refleksleri (kornea ve arka bacak) kadar artık duyarlı
    3. Fare anesthetization odasından kaldırın ve yukarıdaki boğmaca toksin eriyik 0.5 mL şırınga 30 1/2 G iğne ile kullanarak bir mayi (IP) enjeksiyon yolu ile 250 µL yönetmek.
    4. Enjekte edilebilir inoculum bağışıklama için hazırlamak:
      1. P0 180-199 peptid, 2 mg/mL solüsyon kullanarak hazırla Çözüm A (ile > %98 saflıkta, sıra S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) % 0,9 serum içinde.
      2. Hazırlama Çözüm B Mycobacterium tüberküloz 20 mg/mL solüsyon kullanarak (Tablo malzemeleri görmek) Freund içinde ' s tam adjuvan (FCA, oluşan: % 15 mannide monoolate + %85 0,5 mg/mL ve parafin yağı rendelenmiş öldürdü ve kuru M Mycobacterium butyricum),.
      3. Enjekte için son inoculum yapmak için eşit cilt bölgelerinde çözümleri A ve B bir boncuk çırpıcı birleştirmek ve bunları oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda karıştırın.
        Not: A ve B çözümleri olabilir stok olarak devam etti ve en fazla bir ay 4 ° C'de depolanan ama kombine son inoculum fare enjeksiyon gününde taze hazırlanmalıdır.
  2. Günü 0, inoculum (1.1.4. adımda açıklanan hazırlık) 50 µL yönetmek içine bir fare 23 G iğne kullanarak bir Subkutan Enjeksiyon yolu ile.
    Not: Enjeksiyon veya arka bacak ve kuyruk kürek kemikleri arasında Kaudal patolojisi üzerinde yerleştirilebilir.
  3. On gün 1, boğmaca toksin çözüm olarak 1,2 µg/mL (MT-PBS) yapmak ve bir fare 0.5 mL şırınga 30 1/2 G iğne ile kullanarak IP enjeksiyon yoluyla içine 250 µL yönetmek.
  4. Üzerinde gün 3, tekrar 1.3 yukarıdaki adım.
    Not: Stok çözümleri A ve B oluşan ve en fazla bir ay 4 ˚C depolandığı. Ancak, hisse senedi çözümleri A ve B, birleştirerek üretilen son enjekte edilebilir inoculum enjeksiyon gününde yapılmalıdır.
  5. Gün 8, inoculum (1.1.4. adımda açıklanan hazırlık) 50 µL yönetmek içine bir fare Subkutan Enjeksiyon yolu ile (bkz. Adım 1,2 yukarıdaki) adım 1.2 (için her hayvan) olduğu gibi aynı enjeksiyon yerinde

2. klinik puanlama

  1. klinik günlük 0 gününden başlayarak puanlama gerçekleştirmek.
  2. Her fare 0, 1, 2, 3 veya 4 yayımlanmış kriterleri 4 göre bir puan vermek. EAN klinik puanlama için bkz. Tablo 1.
    Not: tutarlılık sağlamak için bir çaba fareler aynı anda puan için her gün aynı araştırmacı tarafından yapılmalıdır.

3. Motor işlevi değerlendirme

Not: motor performans için hayvanların kohort aynı klinik puanlama paralel olarak değerlendirilir. Motor işlevi değerlendirme cihazları bir yürüyüş işlevi görüntüleme sistemi (Tablo malzemeleri görmek) yüklü olduğu bir bilgisayara bağlı gerekir. Ayrıca değerlendirilmek için tüm fareler EAN indüksiyon öncesinde çalışan görev habituated tavsiye edilir. Bunu yapmak için uygulama çalıştırır (2 test çalıştırmalarını fare başına) üç gün önce hastalık indüksiyon (gün -3) gerçekleştirilir.

  1. Motor işlevi değerlendirme cihazları ve anahtar ışık düğmesini açmak.
  2. Scruff fare sıkıca ve kendi ayakları kırmızı mürekkeple kuyruğunu tutarak dolu bir kap üzerine düşürerek mürekkep.
    Not: Bu adımı C57BL/6 zorlanma için gereklidir, ancak bir fare yük bir Beyaz önlük renkle kullanılırsa atlanabilir.
  3. Fareyi yürüyen bölmenin içine getirin ve koşu bandı hızını 15 cm/s.
  4. Koşu bandı ve tıklayın açın " Kayıt " çalışan hareket görüntüleme sistemi yürüyüş işlevini kullanarak fare yakalamak için düğmesini (Tablo malzemeleri görmek).
  5. Bir zamanlayıcıyı kullanın ve her çalışan için 36 ölçmek s. 36 s, stop kayıt ve stop treadmill sonra.
    Not: Bu 36 s aralığı için çalışan görev başarıyla tamamlanamıyor fareler başarısız olarak kabul edilir.
  6. Video dosyası belirtilen klasöre kaydedin.
  7. Her fare değerlendirilmek için yukarıdaki adımları yineleyin. Aynı çalışan görev ile fareler her 3 günde testi.
  8. Analiz yazılımı yürüyüş işlev parametreleri (bkz Tablo reçetesi) kullanarak düzenlenmiş video dosyalarını.
    Not: Nasıl farklı motor parametreleri çözümleneceği ayrıntılarını yazılım arasında çok farklılık lütfen üreticiye başvurun ' s öğretim analiz önce. Aksonal histolojik kanıt elde etmek için ve miyelin hasar immünhistokimya veya elektron mikroskobu, hayvan dokuları herhangi bir sahne sonrası motor işlevleri değerlendirme araştırma özel amaçları bağlı olarak alınabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P0180-199 peptid C57BL/6 fareler yol açan bir monophasic hastalığı klinik skoru ile EAN indüklenen başlangıcından ilk aşılama (dpi) ve en büyük puanı önem 25 dpi gözlenen 6 gün sonrası takip bazı klinik skora göre 40 dpi gelişmeleri süre (şekil 1)4,9. Yürüyüş işlevi, açısından fare başlar basit bir görevin çalışmasını 6 dpi olarak erken başarısız ve 35 dpi fare tarafından görev çalışan basi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu raporu C57BL/6 farelerde P0180-199 peptid kullanarak, anahtar neuropathological ve fonksiyonel açıkları EAN ile indüklenen farelerde miktar etkinleştirme EAN ikna etmek için basit bir yöntem özetliyor. Burada açıklanan EAN indüksiyon Protokolü bağışıklama enjeksiyonları gerçekleştirirken anestezi kullanımı farklıdır. İsoflurane anestezi kullanımını büyük ölçüde inoculum hacmi subkutan istenilen yere en az hata ve stres hayvanlara enjekte edilir emin olmak için yeteneğini geliştirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu eser ile ilgili hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

DGG bir NHMRC Peter Doherty ve Multipl skleroz araştırma Avustralya (MSRA) erken kariyer adam var. JLF bir MSRA doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. Bu eser Avustralya Ulusal Sağlık tarafından desteklenen ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) projesi hibe #APP1058647 JX için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL/6, erkek, 6-8 haftalıkAvustralya Biyokaynaklar Cenre, WA, Avustralya
Boğmaca toksinListesi Biological Laboratories, Inc., CA, ABD#181
0.1 M fare izotonik fosfatlı tamponlu tuzlu (MT-PBS)Laboratuvarların kendi protokolleri olacaktır.
IsofluranePharmachem, QLD, AvustralyaLaboratuvarları uygulama için kendi protokollerine sahip olacaktır.
P0180– 199 peptidWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180– 199, dizi S– S– K– R & ndash; G– R & ndash; Soru: T– P– V– L– Evet; Bir– M– L– D– H– S– R & ndash; S
Isı öldürüldü Mycobacterium tuberculosis (suşu H37RA)Difco, MI, ABD#231141
Freund'un tam adjuvanı (FCA)Difco, MI, ABD#263910
%16 Paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu Hizmetleri#15710Doku toplama gününde %4'e seyreltin.
% 25 glutaraldheydeProSciTech Pty Ltd, QLD, Avustralya# 11-30-8Fiksasyon gününde% 2.5 gluteraldehit ile seyreltin.
Sodyum azidChem-Supply Pty Ltd, SA, AvustralyaSL1890,1M MT-PBS'de %10 (a/h) stok oluşturun. % 0.03 (h / v) oranında kullanın.
SükrozChem-Supply Pty Ltd, SA, AvustralyaSA030%30 (a/h) kullanın.
Optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortaSakura Finetek, CA, ABD# 4583
Normal eşek serumuMerck Millipore, MA, ABD#S30-100% 10 (h / h) veya kendi laboratuvarı tarafından belirlenen başka bir konsantrasyonda antikor seyreltici olarak kullanın.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, ABD#90o2-31-1% 0.3 (h / v) veya kendi laboratuvarı tarafından belirlenen diğer konsantrasyonlarda antikor seyrelticisinde kullanın.
tavşan anti-amiloid öncü proteini (APP)Invitrogen (Yaşam Teknolojileri), CA, ABDS127001: 400'de kullanılır veya kendi laboratuvarında titre edilir.
tavşan anti-kontaktinle ilişkili protein-1 (Caspr)Wiezmann Bilim Enstitüsü'nden Prof Elior Peles'ten hediyeİsrail: 1:500'de kullanılır veya kendi laboratuvarında titre edilir.
Uygun Alexa Fluor konjuge ikincil antikorlarMoleküler Problar (Yaşam Teknolojileri), VEYA, ABD1:200'de çeşitli kullanım veya kendi laboratuvarında titre edin. Antikorun ortaya çıktığı türlerin ve Alexa Fluor'un seçilmesi her laboratuvarın takdirine bağlıdır.
Sulu montaj çözümüDako (Agilent), CA, ABDHer laboratuvarın kendi tercihi olacaktır.
Adı< / strong>Company< / strong> Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
Equipment< / strong
0.5 mL şırınga ile 301/2< / sup> g iğnelerBD# 326105
Kırmızı mürekkep pedi: Hayvanların ayaklarını işaretlemek için herhangi bir kırmızı mürekkep pedi veya kırmızı gıda boyası kullanılabilir.
DigiGate aparatı (koşu bandı içerir)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Görüntüleme SistemieMouse Specifics Inc. Framingham, MA
KronometreHerhangi bir zamanlayıcı kullanılabilir.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Diseksiyon mikroskobuZeissHerhangi bir uygun diseksiyon mikroskobu kullanılabilir.
Şarjlı slaytlarSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaHerhangi bir uygun cyrostat kullanılabilir.
Perfüzyon ekipmanı ve diseksiyon aletleriLaboratuvarları kendi perfüzyon protoktollerine sahip olacaktır.
Opak nemlenmiş odaLaboratuvarlar, opak bir plastik kap kullanarak kendi ürünlerini üretebilir.
PAP pene,GeneTex (ABD)Balmumu kalemi veya yüzey gerilimi de doku bölümünün etrafında bir kuyu oluşturmak için kullanılabilir.
Konfokal mikroskopZeis LSM780Uygun lazer çizgilerine sahip herhangi bir konfokal mikroskop kullanılabilir.
FIJI/Image JUlusal SağlıkEnstitüleri www.fiji.sc'den edinilebilir
#S3023 > 23 g iğneler BD # 305143 .

Kaynaklar

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EAN ModeliP0 180 199 PeptitSubk tan EnjeksiyonPertussis ToksiniMotor Fonksiyon De erlendirmesiKo u Band Gait AnaliziSiyatik Sinir DemiyelinasyonuTransmisyon Elektron Mikroskobu

İlgili makaleler