Bu iletişim kuralı, mitokondrial kaynaklı peptidler içeren hücreleri uyarmak ve sinyal cascade ve yerelleştirme fosfo-proteinlerin değerlendirmek açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine ERK harekete geçirmek için hücre altı ayırma
Bu makalede
Özet
Özet
Mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP'ler) küçük açık okuma çerçevesi mitokondri genom kopyası bilinen diğer genler içinde tarafından kodlanmış peptidler yeni bir sınıf vardır. MDP'ler çok çeşitli nöronların apoptosis korumak, metabolik işaretçileri artırma ve kemoterapi hücrelerin korunması gibi biyolojik etkileri var. Humanin ilk MDP keşfedilmeyi ve en çok çalışılan peptid MDP aile arasında. Membran reseptörleri ve humanin aşağı akım sinyal yollar dikkatle karakterize. MOTS-c ve SHLP1-6 gibi ek MDP'ler daha Geçenlerde bulunduktan ve sinyal mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır zorunda. Burada Bu peptidler işlevini belirlemek için bir hücre kültür dayalı yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, hücre ayırma teknikleri, western Blot birlikte harekete geçirmek kantitatif tayin ve translocation önemli sinyal molekülünün için izin verir. Hücre ayırma başka yöntemler olmakla birlikte, burada açıklanan bir kolay ve basit yöntemdir. Bu yöntemler Bu peptidler ve diğer terapötik ajanlar etki mekanizması daha fazla aydınlatmak için kullanılabilir.
Giriş
Ortaya çıkan çalışmalar mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP'ler) cytoprotection ve metabolizma1,2,3' te önemli rol oynarlar göstermektedir. Sinyal iletim yolu MDP'ler huzurunda anlama bize hangi çeşitli işlevleri MDP'ler modüle mekanizması görmemizi sağlar. İlk tanımlanan MDP, humanin, hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz 1/2 (ERK1/2) artırmak için gösterilmiştir fosforilasyon, reseptör4,5bağlama aracılığıyla. Ancak, ERK1/2 aktivasyon aşağı akım etkisi hala underexplored.
ERK1/2 basamaklı hü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. peptid tedavi hücrelere
- iki milyon SH-SY5Y plaka veya HEK293 hücrelere 10 cm (2 x 10 6) yemek ve onlar için 2 gün
- (isteğe bağlı) ertesi gün, Dulbecco serum içermeyen hücrelerle yıkama ' s modifiye Orta (DMEM) medya bir kez kartal ve ücretsiz DMEM gecede serum boş ortam içinde yapılması gereken tedavi ihtiyacı varsa serum ile kuluçkaya.
- 3 günde S14G-humanin peptidler µm filtre, distile su ve 1 mM hisse senedi çözüm olarak sulandırmak 0,2 içinde erimesi.
Not: Peptidler peptid (örneğin, genel ücret) sıra özellikleri tarafından belirlenen ve peptidler ticari olarak kullanılabilir durumdaysa üreticisi tarafınd....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan işlemi uygulayarak, biz 1 mikron ve 100 mikron HEK293 ve SH-SY5Y hücrelerle tedavi S14G-humanin, bir güçlü humanin analog21, sırasıyla, içinde tamamlamak medya belirtilen süreler için (Resim 1A ve şekil 1 B). sonra ERK1/2 Toplam ve fosforile şeklinde Thr202/Tyr204 toplam proteini özleri itibariyle incelenmiştir. S14G-humanin tedavi ERK.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, biz iki farklı hücre tiplerinde humanin peptid-aracılı ERK1/2 Etkinleştirme oluşuyor ve aktif ERK1/2 hücre altı lokalizasyonu (örneğin, peptid, zaman nokta ve hücre doz koşullara bağlı olarak farklı olabilir gösterdi yazın). O humanin göstermiştir-sinyal içinde iki hücre hatları gibi farklı dozda kullanımının humanin gereksinimini farklılıkları açıklayabilir iki farklı reseptörleri22,23, sinyalleri. Bu fizyolojik etkileri değil tam olarak incelen.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bir hissedar ve Yen CohBar, Inc. bir danışman olarak hizmet vermiştir CohBar, Inc Kelvin danışmanlığını Pinchas Cohen olduğunu
Teşekkürler
Bu eser bir Ellison/AFAR doktora sonrası bursu SJK için eskime araştırma programı tarafından desteklenen ve Glenn Vakfı Ödülü ve NIH verir PC için (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tüm yazarlar filmde görünür.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Hücre sinyalizasyonu | 9102 | Seyreltme 1:1.000 |
| fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Hücre sinyalizasyonu | 4370 | Seyreltme 1:1.000 |
| Lamin B1 | Hücre sinyali | 12586 | Nükleer İşaretleyici, Seyreltme 1:1.000 |
| GAPDH | Hücre sinyali | 5174 | Sitoplazmik belirteç, Seyreltme 1:2.000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitokondri işaretleyicisi, Seyreltme 1:2.000 |
| anti-Tavşan-HRP konjuge | Hücre sinyalizasyonu | 7074 | Seyreltme 1:30.000 |
| RIPA Lizis ve Ekstraksiyon Tamponu | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Kültür Kabı | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptit | Genescript | ||
| 25mm Sylinge filtresi | ThermoFisher BİLİMSEL | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Gliserol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher BİLİMSEL | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sükroz | Sigma | S7903 | |
| Tris bazlı | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Hücre Sıyırıcı | FALCON | 353085 | |
| Durma ve ticaret; Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pürüzsüz Havaneli Doku Öğütücü Tertibatları | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| %8-16 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Modülü | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Sistemi | BIO RAD | 1704150 | |
| Clarity Western ECL Blotting Yüzeyleri | BIO RAD | 1705060 | |
| Western blot sıyırma tamponunu | geri yükleyinThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonikatör, Medel: FB120 | ThermoFisher BİLİMSEL | 695320-07-12 |
Kaynaklar
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral ins....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
