Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Özet

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Özet

Temel hücresel süreçleri DNA ikileşmesi ve segregasyon, protein sentezi, hücre duvarı sentezi ve hücre bölünmesi gibi bakteriyel hayatta kalmak için gerekli proteinlerin işlevi güveniyor. Bu işlemler probları daha iyi anlamak gibi bir dizi hedef özel boyalar kullanılabilir. Lipofilik boyalar ile boyama membran yapısı gözlenmesi, lipid microdomains görselleştirme ve membran blebs olarak algılanmasını sağlar. Floresan-d-amino asitler (FDAAs) peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için kullanımı hücre duvarı Dipnotlar veya hücre büyüme desenlendirme potansiyel kusurları işaret ediyor olabilir. Son olarak, nükleik asit lekeleri DNA çoğaltma veya Kromozom segregasyon olası hataları işaret ediyor olabilir. Siyanür DNA hücre yaşayan etiket lekeleri ve hızlandırılmış mikroskobu çevrili Morfoloji gerçek zamanlı gözlemleri sırasında hücre büyümesini etkinleştirme için uygundur. Hücre etiketleme için protokol protein tükenmesi mutantlar membran yapısı, hücre duvarı Biyogenez ya da kromozom segregasyon tanımlamak için uygulanabilir. Ayrıca, hızlandırılmış mikroskobu gibi gerekli bir protein kaldırılır ve ek protein işlevi kazandırabileceğini morfolojik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Örneğin, hücre büyüme proteinler tükenmesi hücre daha kısa veya yuvarlak haline neden olabilir, ancak temel hücre bölünmesi proteinler tükenmesi filamentation veya dallanma, sonuçları. Burada, hücre büyümesi, hedef özel etiketleme ve hızlandırılmış mikroskobu protokollerde bakteriyel bitki patojeni Agrobacterium tumefacienssağlanır. Birlikte, hedef özel boyalar ve hızlandırılmış mikroskobu temel süreçleri karakterizasyonu etkinleştirmek A. tumefaciens. Son olarak, sağlanan iletişim kuralları diğer bakterilerde temel işlemleri soruşturma için kolayca değiştirilebilir.

Giriş

Bakteriyel hücre döngüsü boyunca ilerleme membran ve hücre duvarı sentezi, DNA ikileşmesi ve segregasyon ve hücre bölünmesi gibi birçok işlemi koordinasyon gerektirir. Tamamen bakteriyel hücre biyolojisi karmaşıklığını anlamak için bu temel olayları incelemek gereklidir; Başlıca bileşenleri bu yollar, mutagenized zaman hücre canlılığı tehlikeye beri Ancak, bu önemsiz bir görevdir. Hedef özel boyalar ile birleştiğinde Epifluorescence mikroskopi wildtype ve mutant bakteri suşları temel bu işlemlerde soruşturma için güçlü bir yaklaşımdır.

Peptidoglikan özel boyalar floresan antibiyotik (Vankomisin-FL, bocillin-FL) ve floresan d amino asitler (....

Protokol

1. A. tumefaciens suşlarının büyüme

1. A. tumefaciens suşları kültür
   1. Bir koloni istediğiniz baskı ile ATGN büyüme ortamının (tarifi için malzemeler listeye bakın) 1 mL aşılamak için steril bir tahta sopa ya da damlalıklı ipucu kullanın.
      Not: A. tumefaciens tükenmesi suşları için ATGN 1 mM IPTG temel protein biyosentezi korumak için bir uyarıcı içermelidir.
   2. A. tumefaciens suşları gecede ATGN 225 rpm'de sallayarak ile 28 ° C'de içinde büyümek.
   3. Hücreleri 600 optik yoğunluğunu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm (OD₆₀₀). Hücre kültürü bir OD₆₀₀ seyre....

Sonuçlar

Hedef özgü wildtype etiketleme A. tumefaciens hücreleri
Bu hücre morfolojisi göstermek için yıkama adımları veya (hangi floresan boyalar sulandırmak için kullanılır) % 1 DMSO ile tedavi etkilenmez, hücreleri doğrudan kültür (şekil 2A, sol paneli), hücreler tarafından yıkadıktan sonra yansıma 1.2 (şekil 2A, sol panelde) veya % 1 DMSO 10 min için hücrelerle kuluçka ve .......

Tartışma

Bu protokol A. tumefaciens tükenmesi wildtype ve mutant suşları incelenmesi için işlemler bir dizi içerir. Bu protokol bölümünde listelenen tüm yordamları büyüme medya, sıcaklık ve büyüme oranları için hesabınıza ek değişiklikler ile diğer bakteri suşları için kolayca adapte edilebilir dikkati çekiyor.

Hedef özel boyalar bakteri hücreleri hücre döngüsü olayları detaylı karakterizasyonu sağlamak için değerli bir araç kullanmaktır. Burada, peptidoglikan ekleme desenleri floresan d amino.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bakteriyel Suşlar
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Agrobacterium tumefaciens'in virülansı için gerekli plazmid. J Bakteriyol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58 ve Delta; tetRA::mini-TN7T-GM-PTAC-ctrA Δ ctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Süleyman A, Kahverengi PJB. 2016. Yapay bir attTn7 bölgesine Mini-Tn7 yerleştirilmesi, fitopatojen Agrobacterium tumefaciens'deki orijinal ana regülatör CtrA'nın itilmesini sağlar. Uygulama Çevresi Mikrobiyol. 82:5015-5025.
<>Ad<	strong>Company	Katalog Numarası	>
Media Components>
ATGN Minimal Orta			1 L sterilize suya 50 ml 20X Tampon, 50 ml 20X Tuz, 12.5 ml %40 glikoz ekleyin. Plakalar için 1 L suya 15 g Bacto Agar ekleyin ve otoklavlayın. 55 ° C'ye kadar serin; C ve 50 ml 20X Tampon, 50 ml 20X Tuz, 12.5 ml %40 glikoz ekleyin.
20X AT Tamponu			Suya 214 g/L KH2PO4 ekleyin ve sodyum hidroksit ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Otoklav.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Tuzları			40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4&boğa; 7H2O, 0.2 g/L CaCl2&boğa; 2H2O ve 0,024 g/L MnSO4&boğa; H2O suya. Otoklav.
(NH4)2SO4	Fisher Kimyasal	A701
MgSO4&boğa; 7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2• 2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4• H2O	Fisher Chemical	M114
Glikoz	Fisher Chemical	D16	%40 su stoğu hazırlayın. Filtre sterilize eder.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Tabakları hazırlarken 1 L suya 15 g ekleyin.
Name< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
İsteğe Bağlı Medya Katkı Maddeleri< / strong>
Kanamisin	GoldBio	K-120	Suda 100 mg / ml stok çözeltisi olarak hazırlayın ve süzgeçte sterilize edin. 200 & mikro nihai konsantrasyonda kullanın; g/ml'dir.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Suda 1 M stok solüsyonu olarak hazırlayın ve filtreyi sterilize edin. İndüksiyon için gerektiği gibi 1 mM'lik son konsantrasyonda kullanın.
Adı< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Mikroskopi Malzemeleri< / strong>
Mikroskop Slaytları	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Sparkle cam temizleyici ile temizleyin.
Mikroskop Kapağı	Camı Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Sparkle cam temizleyici ile temizleyin.
Sparkle Cam	Temizleyici Ev Deposu	203261385	Amonyak ve alkol içermez.
Ultra Saf Agaroz	Invitrogen	16500-100	Suya, PBS'ye veya ortama %1 - 1,5'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Mikrodalgada eritin ve steril
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X çözeltisine yerleştirin.
Parafilm	Bemis	PM-999	Agaroz ped hazırlamada conta olarak kullanılan laboratuvar filmi.
VALAP			Konik bir tüpe eşit ağırlıkta lanolin, parafin mumu ve vazelin ekleyin. 70 & derece ısı borusu; C kuru, boncuk veya su banyosu eritmek ve karıştırmak için. VALAP'ı hala erimiş halde uygulayın.
Lanolin Yağı	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petrol Jeli	Hedef A.Ş.	06-17644
Parafin Balmumu	Kurnaz Mumlar	263012
İsim	>Şirket<>güçlü	Katalog Numarası	Yorumlar
>Hedefe özel boyalar
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Boya stok çözeltilerini gerektiği gibi seyreltmek için kullanın.
FDAA'lar (NADA, HADA, TADA)FDAA'lar,			ile anlaşma yoluyla sentezlenebilir veya edinilebilir. DMSO'da 100 mM stok çözeltisi hazırlayın. 5 mM'lik bir son konsantrasyonda kullanın.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	DMSO'da 1 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. 1 & mikro nihai konsantrasyonda kullanın; g/ml'dir.
SYTOX Turuncu Nükleik Asit Lekesi	Invitrogen	S11368	DMSO'da stok konsantrasyonu 5 mM'dir. 5 >M'lik son konsantrasyonda kullanın.
FM4-64	Invitrogen	T3166	DMSO'da 8 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. 8 & mikro nihai konsantrasyonda kullanın; g/ml'dir.
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Equipment
Kuru banyo	Sheldon İmalat, Inc.	52120-200
Metalik termal boncuklar	Lab Armor	42370-002
Bu çalışmada EMCDD kamera			QImaging Rolera em-c2 1K elektron çarpım şarj bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera ile donatılmış Nikon Eclipse TiE kullanılmıştır.

strong su ile 1X'e seyreltilecek 70 C Mike VanNieuwenhze (Indiana Üniversitesi) ile donatılmış epifloresan mikroskobu