Yöntem makalesi

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 Kasım 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Kromatin yetişkin fare iskelet kası, yapısal proteinler yüksek bir içerik ile fiziksel olarak dayanıklı bir doku üzerinden hazırlanması için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol tanımlamak. Disseke bacak kasları yetişkin fareler üzerinden fiziksel olarak mekanik homojenizasyon veya kıyma ve douncing, önce formaldehit fiksasyon lysate hücrenin Hipotonik arabellekte bir arada tarafından bozulur. Sabit çekirdek mekanik homojenizasyon veya douncing ve hücre artıkları kaldırmak için sıralı filtrations daha fazla döngüleri tarafından saf. Arıtılmış çekirdeklerin hemen veya daha sonraki bir aşamada donma sonra sonicated. Kromatin verimli bir şekilde sonicated ve transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler için uygun Kromatin immunoprecipitation deneyleri için profilleri tarafından gösterildiği gibi elde edilir. Bu iletişim kuralı tarafından hazırlanan Kromatin kullanarak tespit bağlama olayları ağırlıklı olarak kas lif çekirdeği Kromatin fiber ilişkili diğer uydu ve endotel hücreleri varlığı rağmen meydana bunlar. Bu iletişim kuralı bu nedenle yetişkin fare iskelet kas gen düzenlemesi çalışmaya adapte.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kantitatif Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) birleştiğinde ve yüksek işlem hacmi sıralama (ChIP-seq) transkripsiyon çalışmaya seçim yöntemleri ve epigenetik gen ekspresyonu çeşitli dokularda düzenlenmesi olmuştur ve hücre-tip1. Bu teknik genom çapında kovalent Kromatin değişiklikler, Histon varyant doluluk ve transkripsiyon faktörü bağlama2,3profil oluşturma sağlar.

ChIP kültürlü hücrelerden performans iyi kurulmuş olmakla birlikte, küçük parça--dan memeli dokulara daha zor kalır. Kromatin küçük parça için hazırlanıyor her doku ve hücre türü için optimize edilmiş olması gereken birkaç kritik adımları içerir. Kromatin kültürlü hücre hücresel lysates veya kendi çekirdek aşağıdaki arıtma hazırlanabilir. Memeli dokular söz konusu olduğunda, verimli lizis, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri arıtma Kromatin en iyi kurtarma sağlamak için önemlidir. Ayrıca, deneysel olarak belirlenecek önce veya sonra kendi arıtma çekirdeklerin düzeltmek seçeneği vardır. Bu engellerin rağmen çip başarıyla karaciğer, testis veya beyin4,5,6gibi dokularda üzerinden yapıldı. İskelet kası durumunda bozulma dokusunun yapısal proteinlerin yüksek bir içerik ve izolasyon-in onun çekirdeği sergileyen böyle bir fiziksel olarak dayanıklı, özellikle zorlu 's. Bu özgüllüğü göz önüne alındığında, diğer dokular için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları tatmin edici sonuçlar iskelet kasları için vermeyin.

Burada ChIP-grade Kromatin fiziksel olarak doku, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri ve sonication yalıtım engellemeden içerir fare iskelet kas dokusundan izole etmek için bir protokol açıklayın. Kromatin bu dokudan küçük parça için uygun hazırlamak için bu yöntem verimliliğini çeşitli transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler7için ChIP-qPCR ve ChIP-seq gerçekleştirerek gösterilmiştir.

Bu yeni teknik uzun collagenase sindirim adımları hangi zaman, genomik transkripsiyon faktörleri lokalizasyonu değişimler sırasında oluşan bir daha önce raporlanmış protokolü8 ' den çok daha hızlı ve değişiklikler gen ifadesinin içinde yer alabilir. Hangi ile çekirdekleri izole ve sabit hız burada açıklanan yöntemi daha sadakatle yerli genomik doluluk durumu yakalar Kromatin hazırlamak özellikle cazip kılıyor. Ayrıca, Kromatin yalıtım veya protein kas dokusunun çıkarılması için diğer yöntemleri olmasına rağmen açıklanan8,9,10 edilmiş ve seçili genler, hiçbir çip seq üzerinde ChIP-qPCR deneyler için kullanılan veri bunları kullanarak rapor edildi. Rapor burada yöntem transkripsiyon faktörü ve Histon değişikliği için ChIP-seq uygundur ve bu nedenle de 3/4 C veya hıc Kromatin conformation yakalama uygulamaları için uygun olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fareler sürekli bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili Kurumsal yönergelere uygun olarak ve uygun olarak ulusal hayvan bakım kuralları (Avrupa Komisyonu yönergesi 86/609/CEE; Fransızca kararname no.87-848). Tüm yordamları Fransız Ulusal Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. yalıtım kas dokusu

  1. kurban bir yetişkin 6 8 haftalık için fare ile servikal çıkığı. Sterlise % 70 etanol ile durulama tarafından bacak ve para cezası nokta makas ve forseps kullanarak arka bacak kasları (gastroknemius, Tibialis önünde, Quadriceps) teşrih.
    Not: Bir fare yaklaşık 500 mg doku verim.
  2. 2 mL içeren homojen bir hazırlık küçük buz gibi Hipotonik arabelleğe 1 mL tüp bebek kaslarında kıyma (< 2-3 mm 3) kullanarak adet ince makas ve tezgah üst karıştırıcı 5-10 dakika süreyle 4 ° C'de sallayarak tüp terk

2. Doku lizis

Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.

  1. Homogenate 14 mL yuvarlak alt tüp aktarmak ve 5 mL soğuk Hipotonik arabellekte (EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF) resuspend.
    1. Homogenise 15-30 s yuvarlak alt 14 mL tüpler için gevşek dounce (3 dakika içinde 20-30 vuruş) veya mekanik doku homogenizer kullanarak kıyılmış kas dokusu.
      Not: Lizis verimliliğini tarafından ışık mikroskobu bu aşamada tespit edilebilir ve gerekirse, ek kesinti yapılabilir.
  2. Homogenate 15 mL tüpler için transfer ve 10 mL soğuk Hipotonik arabellek kullanarak birime doldurun. Sonraki fare ile devam etmeden önce aşağıda açıklandığı gibi homogenate saptamak.

3. Fiksasyon

  1. formaldehit % 1 son toplama eklemek ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalanır.
  2. Glisin 0,125 M son bir konsantrasyon fiksasyon ve sallamak için oda sıcaklığında 5-10 dk durdurmak için her tüpün ekleyin.

4. Çekirdeklerin hazırlık

Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.

  1. Sabit lysate gevşek dounce (5-10 vuruş) kullanarak Homogenise.
    1. 15 mL tüp ve 1000 x g, santrifüj 4 ° C'de 5 min için çekirdek ve hücresel enkaz elde etmek için transfer.
  2. Süpernatant kaldırmak ve Pelet taze 5 mL Hipotonik arabellekte resuspend. Lysate 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL tüp içine filtre. Filtrate 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla yeniden filtre.
  3. Transfer filtrate 15 mL tüp ve santrifüj 1000 x g de 4 ° C'de nükleer Pelet elde etmek için 5 dakika.
    Not: Bu aşamada çekirdeklerin hemen sonicated veya sıvı azot kuru bir Pelet donmuş ve-80 depolanan yaslama ° C.

5. Sonication

  1. nükleer Pelet (makine ve dounce homojenizasyon için yaklaşık 50 µL) hacmi değerlendirmek ve sonication tampon 3-4 kez Paketli nükleer birimin kadar resuspend ve bir sonicator kullanarak 4 ° C'de 10-15 dk için solüsyon içeren temizleyicide .
    Not: Kromatin olabilir (6) aşağıda açıklandığı gibi hemen analiz veya dondurulmuş ve-80 depolanan ° C.

6. Kromatin parça boyutu Sonication takip değerlendirirken

Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.

  1. İçin de-crosslink, Kromatin 30 µL 1,5 mL tüp içinde alıp 20 µL 5 M NaCl. 500 µL birime tamamlamak ve 65 ° C'de gecede kuluçkaya.
    1. Ertesi gün, bir tedavi (20 mg/mL stok), 10 µL 2 M Tris pH 6.8 ve 10 µL 0,5 M EDTA 42 ° C. gerçekleştir fenol-kloroform/kloroform ayıklama, 1 h, 1 µL İndinavir K ile gerçekleştirmek ve sodyum acetat 1 hacmi ile DNA çökelti e (3 M) ve 2 cilt % 100 etanol için bir h-80 ° C'de veya gecede -20 ° c
  2. DNA tarafından Santrifüjü 13.500 x g 15 dk. Decant süpernatant de cips ve Pelet soğuk % 70 etanol ve 5 dk. Decant süpernatant için tekrar santrifüj ile iyice yıkayın ve Pelet kuruması.
  3. Pelet TE arabellek özgün birimi (30 µL) içinde resuspend. 260 nm/280 nm Absorbans tarafından bir Spektrofotometre DNA konsantrasyon ölçmek. 500-1000 ng DNA ile birlikte ayrı bir % 1.5 özel jel hatlarının bir DNA boyutu merdiven pipette ve Elektroforez Kromatin parçası boyutunu değerlendirmek için gerçekleştirin.
    Not: Parça boyutu 200-500 baz çifti arasında olmalıdır ve sigara - ya da kötü-parçalanmış için DNA karşılık gelen parçaları yok algılanabilir yüksek molekül ağırlıklı olmalıdır. Gerekirse, Kromatin çözüm (5. adım) daha uzun bir süre için yeniden sonicated olabilir ve en uygun boyutu elde edilir kadar yukarıda açıklandığı gibi yeniden analiz.

7. Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.

  1. Blok Protein G sepharose boncuk aliquoting 1 mL etanol içinde % 50 Bulamaç tarafından. Santrifüjü 400 x g 1 min bir benchtop için de tarafından boncuk santrifüj kapasitesi ve TE arabellek santrifüj 400 x g, 1 mL ile yıkayın ve yıkama tekrar Pelet
      Sonra ikinci Santrifüjü, yeniden askıya alma 1 ml çip seyreltme arabelleği 25 µL BSA (hisse senedi 20 mg/mL) ile ve 20 µL tRNA (hisse senedi 10 mg/mL) Maya
    1. . Döndürme (40-60 rpm) 4 tarafından en az 2 kullanılmadan önce s boncuk engellemek ° C.
    2. Seyreltik 50 µg Kromatin (5. adım), 8-10 kez çip seyreltme tampon kullanarak. Engellenen boncuk Bulamaç 50 µL ekleyin ve 4'te (40-60 rpm) dönen 2s için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 4 ° C'de önceden temizlenmiş Kromatin elde edilir ve taze bir tüp transferi de.
  2. İmmunoprecipitation için birincil antikor (örneğin, 1-2 µg Kromatin 10 µg başına) uygun miktarda ekleyin ve gecede 4 döndürme kuluçkaya ° C.
    Not: Antikor en uygun miktarda tedarikçi tarafından tavsiye edilebilir veya ampirik olarak optimum zenginleştirme görülmektedir kadar ChIP-qPCR antikor farklı miktarlarda ile gerçekleştirerek belirlenebilir. Ayrıca Protein G sepharose Protein A sepharose alt türü kullanılan antikor bağlı olarak değiştirilebilir.
  3. Engellenen boncuk ertesi gün eklemek ve döndürme (40-60 rpm) 4 1 h için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 20-30 s boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve çip başlamak için de yıkar.
  4. ChIP yıkama: arabellekleri ile aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: bir kez düşük Salt arabellek ile ve sonra iki kez LiCl arabelleği, ile iki kez yüksek Salt arabellek ile ve son olarak iki kez TE arabelleği ile.
    1. Döndürme (40-60 rpm) 4 ° C'de 10 dakika her yıkama gerçekleştirmek ve boncuk Santrifüjü 400 x g 20-30 s bir tezgah üstü santrifüj içinde de tarafından her yıkama arasında cips.
  5. Elüsyon için son yıkama kaldırmak ve sallayarak süre 15 dakika oda sıcaklığında (taze hazırlanmış) 250 µL elüsyon arabelleği boncuk resuspend.
  6. Santrifüj 400 x g ve toplamak yeni bir tüp eluate. Bu adım iki kez ve daha sonra de-crosslink eluate gecede 20 µL NaCl 5 M ve 1 µL RNase A ile gerçekleştirmek (10 mg/mL), İndinavir K ve fenol-kloroform/kloroform NG ile tedavihareket olduğu gibi adım 6.
  7. TE arabellek 50 µL içinde resuspend ve aliquots ChIP-qPCR için standart protokolleri 15 göre çip kalitesini kontrol etmek için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çekirdeklerin izole etmek için biz disseke ve kıyılmış kas dokusunun mekanik homojenizasyon 18.000 ve 22.000 RPM ( Tablo malzemelerigörmek) 15 veya 45 s için gerçekleştirilen. Her koşulda, çekirdeği doku enkazı ayrılmış ama verimi düşük hız (şekil 1A-B) kullanarak en uygun olan. Çekirdek de hazırlıklı douncing tarafından 3-5 dk (şekil 1Ave veri gösterilmez) ama mekanik homojenizasyon olduğunu yön...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada Kromatin yetişkin fare iskelet kasları ve gösteri bu Kromatin transkripsiyon faktörü bağlama ve kovalent Histon değişiklikler kas lif çekirdeği tespit çip deneyleri için uygun hazırlanması için yeni bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk dounce veya mekanik kesme tarafından gerçekleştirilen doku bozulma 's. Mekanik Kesme daha hızlı ve daha tekrarlanabilir ve bu nedenle yönteminin seçimi. Hiçbir uygun cihazı varsa, yine de, bozulma da douncing, nereye mikroskop altında lizis e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IGBMC yüksek işlem hacmi sıralama tesis, "Fransa Génomique" Konsorsiyumu (ANR10-INBS-09-08) bir üyesi ve tüm IGBMC genel Hizmetleri tüm personel özellikle IGBMC hayvan tesis personel teşekkür ediyoruz. Bu eser CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kanser gelen hibe tarafından desteklenen, Fransız Fonu aracılığıyla ANR programı ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 etiketli Investissements d'Avenir altında devlet ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. S.J Ministère de l'Enseignement tarafından desteklenen Ligue Nationale contre le kanser ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 ve V.U tarafından et de la Recherche. Ligue Nationale contre le kanser bir 'équipe labellisée' kimliğidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
T 25 dijital ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Proteaz İnhibitörü Kokteyl-EDTA İçermeyenRoche Teşhis11873580001
Protein G Sefaroz boncukSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinaz KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Hücre Süzgeçleri 70umCorning BV431751
Hücre Süzgeçleri 40umCorning BV352340
Formaldehit EM sınıfıEuromedex15710-S
Rnase AFischer Bilimsel12091039
Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol 25: 24: 1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
maya tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Glikojen MaviAMIBIONAM9516
Pol II ChIP AntikoruSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIP AntikoruAktif Motif39133
Tead4 ChIP AntikoruAviva Sistemleri Biyoloji(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Odaklanmış UltrasonikatörCovaris E220
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Ek öğeler
Makas
Gevşek Dounce
15 ml ve 50 ml şahin tüpleri
14 ml yuvarlak tabanlı tüpler
1.5 ml ve 2 ml Eppendorf tüpleri
70 μ m ve 40 μ m hücreli süzgeçler (Corning)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kromatin Haz rlamaMekanik HomojenizasyonFormaldehit Fiksasyonuekirdek PurifikasyonuSonikasyon ProtokolDNA EkstraksiyonuChIP SekanslamaTranskripsiyon Fakt r Ba lanmas

İlgili makaleler