Yöntem makalesi

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

DOI:

10.3791/56515

⸱

30 Mart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NK ve T Hücre klonlar CAEBV hastalardan elde etmek için basit bir yöntem yüksek verimlilik, periferik kan küçük bir miktar ve düşük doz IL-2 ile geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birkaç yöntem NK/T Hücre Lenfomasi veya lenfoproliferatif sendromu olan hastalar satırlarından kurmak için tarif edilmiştir. Bu yöntemler besleyici hücreler, 10 mL kan olduğu kadar arıtılmış NK veya T hücreleri veya yüksek doz IL-2. Bu çalışmada periferik kültür tarafından NK ve T hücre hatları mononükleer hücreler (PBMC) kan rekombinant insan IL-2 (rhIL-2) eklenmesi ile kurmak için güçlü ve basit bir strateji ile yeni bir yöntem sunar ve tam kan 2 mL kadar az kullanır. Hücreleri hızlı bir şekilde iki hafta içinde çoğalırlar ve 3 aydan fazla muhafaza. Bu yöntemle, 7 NK veya T hücre hatları yüksek başarı oranı ile kurulmuştur. Bu yöntem basit, güvenilir ve hücre hatları CAEBV veya NK/T Hücre Lenfomasi olan durum daha kurulması için geçerli.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epstein - Barr virüsü (EBV) her yerde birden bulunan ve sadece B hücreleri, ama aynı zamanda T ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, EBV ilişkili NK/T lenfoproliferatif hastalıklar (LPD) ve lenfoma/lösemi, EBV ilişkili Hemofagositik gibi bir dizi neden bozar hücre lösemi1,2,3Lenfohistiyositozis, hydroa vacciniforme benzeri lenfoma, Ekstranodal NK/T hücreli lenfoma, burun türü ve saldırgan NK. Bunlar arasında özellikle Doğu Asya'da olay olduğu ve hangi şimdi EBV-enfekte T veya NK hücreleri4,5,6, klonal genişleme neden bir LPD olarak kabul edilir şiddetli kronik aktif EBV (SCAEBV), bir hastalıktır 7, ama belirgin immün yetmezlik olmadan mevcut Enfeksiyöz Mononükleoz (IM)-ısrarla veya yerleştirilmiştir ateş, hepatosplenomegali, lenfadenopati ve karaciğer fonksiyon bozukluğu gibi belirtiler yanı sıra yüksek EBV-DNA yüklemek gibi periferik kan8,9. CAEBV olan hastalarda bir kötü prognoz10,11ve onun Patogenez ve EBV rol belirsizdir. Bu nedenle, EBV ilişkili NK/T lenfoproliferatif hastalıklar elde edilen satırları hücre ve EBV mekanizmasının açıklığa kavuşturulması NK veya T hücre çoğalması ve ilişkisini indüklenen yüksek insidansı lösemi için lenfomalarin bazilarinin hücre modelleri çok yararlı veya Lenfoma.

Bugüne kadar birçok hücre satır farklı teknikler12,13,14,15,16ile kurulmuştur. Bir insan NK hücre kültürünü, NK-YS, NK hücre Lenfoma/lösemi, bir fare stromal hücre satırıyla besleyici olarak ve rhIL-2 mL15başına 20U bir konsantrasyon, huzurunda ortak kültürü çalışmalarının tarafından kurulmuştur. KAI3 oldu hasta şiddetli sivrisinek anti ile veya SCAEBV ile Otolog lymphoblastoid hücre kültürünü (LCL), kurulan başka bir NK hücre kültürünü B hücreleri EBV, besleyici hücreler ve rhIL-2 100U/mL16ek olarak değiştirdi. SNK6 ve SNT8 burun NK/T Hücre Lenfomasi hastalar tümör dokulardan yüksek doz rhIL-2 (700U/mL)12ekleyerek elde edilmiştir. Benzer tekniği ile SNK-1 T hücreleri kaldırıp 700U/mL rhIL-213,17ekleyerek PBMC kültürlü CAEBV hastalardan hücresiydi. SNT13 ve SNT15 CD4 + ve CD8 + hücreleri18çıkarma tarafından kurulmuştur. Şimdiye kadar diğer T hücre ve NK hücre hatları EBV-NK/T LPD hastaların tüm bu yöntemi19ile geliştirilmiştir.

Yukarıda belirtilen varolan yöntemleri dezavantajları besleyici hücreler, istihdam yüksek doz IL-2, olduğu kadar 10 mL tam kan kullanımı veya arıtma NK/T hücrelerinin şartı vardır nedeniyle klinikte çok zor bulunur hangi tip-in o EBV gizlice hücre doğrulama gerekliliği başlamadan kültürüne bozar. Olarak CAEBV ağırlıklı olarak Asya çocuklarda ortaya çıkar, 10 mL kan tüm bölgelerde elde etmek kolay değil. Bu çalışmada, düşük doz rhIL2 ve 2 mL tam kan hacmi olmayan besleyici hücreler kullanarak CAEBV hastaların PBMC kültür tarafından NK ve/veya T hücre hatları kurmak için yüksek başarı oranı ile yeni basit bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemi sonuçları, yüksek verimlilik ve zaman tasarrufu kanıtlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada genetik Enstitüsü ve gelişim biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi Etik Kurulu tarafından kabul edildi ve protokol insan refahı için kurumsal kuralları izler.

Not: Bkz. şekil 1 iş akışı bir şematik için.

1. PBMC CAEBV hastaların izolasyonu

  1. Tam kan CAEBV hastaların 2 mL gelen birincil PBMC degrade tarafından (örneğin, Ficoll-plak) arındırmak Santrifüjü üreticinin yönergeleri izleyin. Alternatif olarak, tezcan nitrojen RPMI 1640 orta ile gelen PBMC cryopreserved.
  2. Hücreleri leke için hücre sayaç plaka süspansiyon aktarıp hücre toplama ve canlılığı bir otomatik hücre sayacı ile ölçmek için 3 dakika bekleyin, trypan mavi, 2 µL (% 0,4) 18 µL hücre süspansiyon için ekleyin.
  3. 2-3 × 106 hücre/mL tam RPMI 1640 kültür % 20 insan serumu (ısı) 56 ° C'de inaktive olur, 2 mM L-glutamin içeren orta ile desteklenmiş bir yoğunluğu, hücre süspansiyon hazırlamak ve antibiyotik (100 µg/mL streptomisin, 100 U/mL penisilin). Tohum PBMC süspansiyon 24-şey hücre kültür plakaları kuyuya başına 1 mL.
  4. 150 U rhIL-2 de başına ekleyin.
  5. 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kültür tabak yerleştirin
  6. Gün 2, (200 X büyütme); mikroskopla hücre morfolojisi gözlemlemek Ne zaman onlar are parlak ve yuvarlak iyi durumda hücrelerdir.

2. hücre ve hücrelerin numaralandırma genişlemesi

  1. Hücre morfolojisi (200 X büyütme) mikroskopla gözlemlemek ve orta değiştirmeden önce hücreleri numaralandırma tarafından hücre büyümesini durumunu izlemek: trypan mavi (% 0,4) 2 µL 18 µL hücre süspansiyon için ekleyin ve hücre toplama hesaplamak (1.2, bkz: Şekil 2).
  2. 24-şey plaka ortamda 500 µL atmak ve 500 µL taze tam kültür orta ekleyin. 150U rhIL-2 de başına ekleyin.
  3. Orta haftada iki kez adım 2.2 olarak değiştirin.
  4. Hücre büyüme eğrisi (şekil 3) çizin.
  5. Geçerli hücre konsantrasyonu 5 × 106/mL aştığında, yeni kuyu, 1-2 × 106 hücre/mL her iyi bir konsantrasyon hücreleri bölün. Bu işlem 2-4 hafta sürer.

3. hücre fenotipleme Akış Sitometresi tarafından

  1. Hücreleri genişletildiğinde, 1 × 106 hücre hücre hatları fenotipleri belirlemek için toplamak. Santrifüj kapasitesi 240 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri (NK/T hücrelerinin tüpün dibinde çökelti).
  2. Süpernatant atmak, yağış 7 mL PBS ekleyerek yıka. Santrifüj vasıl 240 x g oda sıcaklığında 5 min için. Bir kez yinelenir.
  3. 200 µL insan serumu her tüpün ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  4. Senaryo Özeti 240 x g oda sıcaklığında 5 min için santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve 1 × 106/mL ile soğuk PBSA Web site (PBS+0.2%BSA), hücreleri yeniden askıya alma. Hücreleri her tüpün 2 × 105 hücreleri içeren 5 tüpler içine bölün.
  5. 240 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj hücreleri Süpernatant atmak ve PBSA Web site arabellek veya 10 µL PE (veya PE-Cy7) içeren PBSA Web site içeren hücreleri yeniden askıya alma ve 10 µL FITC etiketli antikorlar hücre reseptörleri buz üzerinde T veya NK hücrelerin şekil 4tarafından belirtildiği şekilde leke. PBSA Web site arabellek ile askıya hücreler bir negatif kontrol kullanılır.
  6. 20-30 dk içinde belgili tanımlık karanlık buzda antikor hücrelerle kuluçkaya.
  7. Hücreleri iki kez soğuk PBSA Web site ile yıkayın, 300 µL hücrelerle yeniden askıya soğuk PBSA Web site.
  8. Akış Sitometresi ile hücre fenotip analiz.
    1. "Çalışma oluşturmak" durumda Akış Sitometresi ayarlayın. Yan dağılım (SSC) karşı ileri dağılım (FSC) görüntüler bir nokta arsa ile deneysel şablonu ayarlayın.
    2. FSC ve SSC gerilim en iyi duruma getirmek için izotip kontrol tüp yük ve enkaz faiz hücre nüfusu ile engel olmadan ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini en iyi duruma getirme. FSC, SSC, FITC, PE ve PE-Cy7 dışında tüm parametreleri silin.
    3. Tazminat her 2-renk analiz grubundaki izotip kontrol ve tek bir olumlu denetim kullanarak gerçekleştirin.
    4. Örnekleri yükleme ve HLA-DR VS CD19 oluşturduğunuzda, hücre farklı nüfus gösterilen CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 ve CD3 VS CD16 nokta çizer.
      Not: PBMC negatif/izotip kontrol ve tek olumlu denetimi kullanarak tazminat gerçekleştirmek için kullanılmıştır. 2-renk ayirt Akış Sitometresi ile düzenli olarak yüzey işaretlerinin ifade analiz etmek için kullanıldı. Aşağıdaki antikorlar bulunur: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 Birleşik floresein isothiocyanate (FITC), anti-CD8, anti-CD56, phycoerythrin (PE) ile Birleşik CD3 ve anti-CD19 PE-Cy7 ile Birleşik.

4. Genleşme ve dondurma NK/T hücreleri

  1. Hücre fenotip analiz tamamlandığında orta değiştirin. Dikkatle yarısı süpernatant kaldırmak ve alt plaka hücreleri dokunmaktan kaçının. Taze kültür içeren hücre plakaları 300 U/mL rhIL-2 Orta aynı hacmi ekleyin.
  2. Orta yarısı değiştirmek (2.2) olarak her 3 gün kadar hücre kümeleri (Şekil 2) mikroskop altında açıkça görülebilir. Tipik olarak, bu işlem 2-3 hafta sürer.
  3. Hücreleri farklı wells aynı soydan karıştırdıktan sonra T25 kültür Şişeler için 24-şey plakaları aktarın. Görünüşe göre sarı orta hacmi kadar Çift kültür orta hacmi 10-15 mL için genişletir. RhIL-2 150 U/mL konsantrasyonu ile ekleyin.
  4. 2-3 hafta sonra büyüyen, buz gibi önce Orta 24 h değiştirmek zaman hücre kütlesi çıplak gözle görülebilir. Hücre konsantrasyonu hücre sayacı ile ölçmek.
  5. Hücre süspansiyon için 240 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet 5-10 x 106 hücre/mL fetal sığır serum % 90 ve % 10 dimethylsulfoxide (DMSO) içeren dondurulmuş hisse senedi Çözümle yoğunluğu, yeniden askıya alma. -80 ° c min başına 1 ° C oranında donma ve ardından doğrudan sıvı azot aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 gün hücre hatları kurulması sırasında kültür sonra çok biçimli hücreler (Şekil 2) görünmesini başlar. Yüksek bir oranda (şekil 3) hücre canlılığı ve numarası arttıkça 7 gün sonra hücreleri hızlı bir şekilde büyümek. Hücre küçük kümeleri 10-14 gün sonra büyüyen, 3-6 × 106hücre konsantrasyonu aştığında açıkça görülebilir. Bu dönemde, hücre kültür plaka iki ya da üç kuyu içine bölümü tarafından genişletilip. Yaklaşık bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için tam kan CAEBV hastaların NK/T hücre satırlarından kurmak için yeni bir yöntem geliştirmiş. Yüksek başarı oranı ve iyi koşullarda hücre canlılık sergiler Ise mevcut yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntemin en büyük avantajı sadeliği ve kan, sadece küçük bir ses onun şartı var. Ayrıca, NK/T hücre hatları hücre tipleri gizlice peşin, enfekte belirlenmesi EBV daha fazla kan ve kültür önce zaman tüketmek belirlenmesi olmadan PBMC kültür tarafından kurulabilir. Alternatif olarak, hücre hatları için ana...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.Z., X.Z. ve X.C. yardımcı mucitler üzerinde bekleyen patent başvuruları NK/T hücre satırları ve bu çalışmada kurulan hücre satırları oluşturmak için bu yöntemin olası kullanımlar kapsayan vardır. D.Z., X.Z. ve X.C. bu çalışmalarında rakip hiçbir mali çıkarlarının bildirin. Kalan yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser anahtar projeleri, Çin Bilimler Akademisi (KFZD-Batı-205), stratejik biyolojik kaynakların teknoloji destek sistemi, Çin Bilimler Akademisi (CZBZX-1 ve ZSSB-004) ve hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı Çin () 81401640) ve Şangay Doğa Bilimleri Fonu (14ZR1434800).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
FACS için Hu HLA-DR FITCBDantikoru
Hu CD4 FITCBD555346FACS için antikor
Hu/NHP CD8 PEBD557086antikoru FACS için
Hu CD3 PEBD555340antikoru FACS
için Hu CD16 FITC 3G8BD555406
NHP CD56 PE MY31BDiçin antikorFACS
hu/CD19 için 556647 antikoru PE-Cy7BDFACS
insan IL-2Roche11147528001
insan serumuMRC CCC118-125
CO2 inkübatörüSANYO
SantrifüjTechcompCT6TSantrifüj
mikroskobuOLYMPUS CKX53CKX53
Otomatik Hücre SayacıCountstarIC 1000Hücre sayımı için
24 kuyulu hücre kültürü kümesiCorning Incorporated3524Polistiren plakalar
25cm2 hücre kültürü şişesiNest707001Polistiren
FBSGibco10270Hücre ortamının bileşeni
RPMI Orta 1640yaşam22400089Hücre ortamı için
L-GlutaminAmresco374Hücre ortamının bileşeni
100 x streptomisin penisilin çözeltisi BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Hücre ortamının bileşeni
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Lenfositin in vitro izolasyonu için
DMSOSigmaD2650Hücrelerin
dondurulması içinakış sitometresiBDBD FACSAria II
yazılımBDBD FACSDiva yazılımFACS analizi
560944 antikoru Hu/ için 560728 antikoru

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NK T H cre HatlarKronik Aktif EBVPeriferik Kan Monon kleer H creleriRekombinant nsan IL 2Ak Sitometrisi AnaliziGradyan Santrif gasyonH cre K lt r Bak mFenotip BelirlemeH cre Proliferasyon zlemiKriyoprezervasyon Tekni i

İlgili makaleler