Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

8.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56535

⸱

31 Ekim 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

Bu makalede

Özet

Kemik iliği hücrelerinden fare birincil makrofajlar türetmek için bir düz ileri yöntem göstermek ve BSA-yağ asidi hazırlamak için basit bir yöntem conjugates. Sonra doymuş yağ asitleri makrofaj hücre ölümüne neden olabilir ve bu tür hücre ölümü olumlu ceramide düzeyleri hücresel birikimi ile ilişkilidir gösterir.

Özet

Makrofajlar epidermal yağ asidi bağlayıcı protein ve yağ yağ asidi bağlayıcı protein son derece hızlı. Onlar aktif alımı doymuş ve doymamış yağ asitleri, bağışıklık fonksiyonları düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir. Çok sayıda çalışmalar çeşitli yağ asitleri, doymuş olduğunu göstermiştir veya doymamış, Mayıs hücre büyümesi ve fonksiyonu farklı etkileri sahip. Ancak, yağ asidi hazırlık için kullanılan yaklaşımlar değişir, hangi fizyolojik olmayan sonuçlara neden olabilir. Serum albümin, memeli periferik kan, yağ asitleri için doğal bir taşıyıcı yağ asitlerinin sodyum tuzu ile karmaşık eşlenik şekillendirme için yağ asidi işlevinde böylece yağ asidi sabun toksisite en aza indirerek memeli hücreleri, eğitim için önerilir. Bu nedenle, basit, nispeten hızlı Isıtma ve yöntem sonicating geliştirilen ve burada BSA-yağ asit eşlenik oluşumu için sunulan. Doymuş yağ asitleri, özellikle Stearik asitler şiddetli hücre ölümü fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar içinde ikna etmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Biz daha fazla doymuş yağ asidi indüklenen hücre ölümü olumlu birikmiş hücresel ceramide düzeyleri ile ilişkili olduğunu gösterir. Bu yöntem yağ asidi diğer memeli hücreleri üzerinde etkisini çalışmaları için genişletilebilir.

Giriş

Yağ asitleri enerji metabolizması ve farklı hücre membran fosfolipitler sentezi kritik bir rol oynamaktadır. Yağ asitleri sulu düşük bir çözünürlük var. Yağ asidi uygun hazırlanması biyolojik fonksiyonları memeli hücrelerinde yağ asitlerinin çalışmak için kritik önem taşıyor. Yağ asitleri etanol ile hazırlanır birçok yağ asitleri bile nispeten düşük konsantrasyonlarda1hücre zarının toksik sabun (deterjan) etkileri göstermek. Bir doğal, büyük taşıyıcı serum serbest yağ asitleri için serum albümin yağ asidi teslim vitro yağ asidi işlevi deneyleri için2,3,4için iyi bir taşıyıcı olarak kabul edilir. Birçok araştırma kağıtları yağ asitleri kullanarak yayımlanmış olsa bile ancak, yağ asidi ve serum albümin eşlenik hazırlanması ayrıntılarını genellikle kullanılabilir değil.

Makrofajlar epidermal yağ asidi bağlayıcı protein ve yağ yağ asidi bağlayıcı protein5,6,7,8son derece hızlı. Onlar aktif alımı doymuş ve doymamış yağ asitleri bağışıklık işlevleri düzenleyen. Makrofajlar ve diğer hücrelerin yağ asitlerinin etkisi çalışma için uygulanan1,7,9yağ asidi hazırlık farklı yöntemleri vardı. Yağ asitleri makrofaj fonksiyonları üzerine etkisini araştırmak için uygun şekilde hazırlanmış yağ asidi/serum albümin conjugates kullanarak biyolojik anlamlı veri almak üzere kritik önem taşımaktadır. Yağ asitleri makrofaj fonksiyonları üzerine etkisi üzerinde çalışmalar temel bilgi ve yağ asidi metabolizmasının hastalıklarda makrofaj söz konusu ile ilgili potansiyel tedavi hedefleri sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

protokol kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Louisville Üniversitesi tarafından kabul edildi.

1. fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs)

  1. Euthanize CO 2 kullanarak bir 6 - için 8-hafta-yaşlı, sağlıklı vahşi tip fare. Bir köpük tahta aşağı pin ve sırılsıklam olana % 70 etanol ile sprey. Tibia/uyluk kemikleri forseps ve makas ile kaldırın. Onları 5 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile petri kabına koyardım. Steril koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirmek.
  2. Her iki ucunda da bir makas ile tibia/uyluk kemiği steril doku kültürü mahallede kesmiş. 15 mL tüp içine kemik PBS + % 2 fetal sığır serum (FBS) ile 25 G iğne ile flush.
  3. Kemik iliği hücreleri vasıl 500 x g, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
  4. Hücre Pelet 1 mL kırmızı kan hücre lizis arabelleği kırmızı kan hücreleri (RBC) koşullar için daha az 1 dk. Dilute 9 mL 1 x PBS ile hemen resuspend. Santrifüj tekrar adım 1.3 olduğu gibi. Supernatants dikkatle boşaltmak.
  5. 10 mL 1 x PBS içinde hücre Pelet resuspend, hücre süspansiyon hücre enkaz/kümeleri kaldırmak için başka bir 15 mL tüp içine steril 40 mikron naylon mesh aracılığıyla filtre. Santrifüj tekrar 1.3 olduğu gibi. Supernatants dikkatle boşaltmak.
  6. Hücre Pelet 15 mL Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) % 5 ile 1640 FBS ve 10 μg/mL gentamisin, yüzen dışarı 100-mm doku kültürü çanak 37 o C İnkübatör, hücrelerde alın 60 dk. yavaşça girdap için çanak, tabak resuspend hücreleri ve bunları kabul.
  7. 6 x 10 6 hücreler bir 100-mm tabak içinde 10 ng/mL rekombinant fare makrofaj ile medya (%5 FBS ve 10 μg/mL gentamisin, % 30 ' L929 şartına media 10 ile karışık RPMI 1640) ayırt 12 mL makrofaj ile plaka 2 gün için koloni uyarıcı faktör (M-CSF).
  8. % 5 CO 2 37 ° C kuluçka 2 gün boyunca kültür sonra her yemeğin medya 10 ng/mL M-CSF ile ayırt 6 mL taze makrofaj ile beslemek.
  9. 5 günde 8 mL eski medya hücreleri rahatsız etmeden alıp 10 mL taze makrofaj medya 10 ng/mL M-CSF ile ayırt ekleyin.
  10. 7 günde bir hücre lifter kullanarak kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) hasat.
    Not: Ekli makrofajlar da 5 mL 1 mM EDTA 1 x PBS için 5-10 dk içinde ile float hücreleri kaldırma ve iki kez 5 mL 1 x PBS ile tabak yıkama sonra ayrışmış. Adım 1.3 olduğu gibi hücreleri santrifüj kapasitesi., onları taze makrofaj medya ayırt resuspend ve bir hemasitometre ile Sayın.
    1. Onayla BMDMs ' fenotip Akış Sitometresi tarafından açıklanan 5. Türetilmiş fare makrofajlar aşağıdaki çalışmalar için belirli bir konsantrasyon hazırlayın.

2. BSA-yağ asit eşlenik hazırlık

  1. hazırla 2 mM BSA steril PBS. Örneğin, tartmak 6,65 g BSA, çözülmeye, 30 mL 1 x PBS eklemek sonra eklemek daha fazla PBS 50 mL kadar bileşenleri 2 mM BSA 1 x PBS yapmak için ölçekleme.
  2. Hazırlama 5 mM bireysel sodyum tuzu 2 mM BSA yağ asitlerinin. 37 ° C veya daha yüksek, gerekirse ısı ve net bir çözüm elde edilir kadar 2 mM BSA karışımı ve yağ asitlerinin sodyum tuzu solüsyon içeren temizleyicide.
    Not: doymamış yağ asitleri için karşılaştırıldığında, doymuş yağ asitleri daha yüksek bir sıcaklık ve sonication zamana eriterek için gerek.
  3. Filtre bir 0,22 ile yağ-asit-BSA çözüme mikron filtre, aliquot 1,5 mL steril microcentrifuge içine borular, onları kısa süreli kullanım için 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için-20 ° C'de ve saklayabilirsiniz. Hiç yağış depolama buzdolabında 4 ° C'de sonra dikkat edilmelidir.

3. Doymuş yağ asitleri neden hücre ölüm, fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar

  1. BMDMs 24-iyi doku kültürü plaka 10 6 /mL medya ayırt makrofaj olarak x 0.4 ile plaka.
  2. 0.4 mM palmitik asit ve Stearik asit, 37 ° C kuluçka %5 CO 2 ile 16-24 h için hücrelerle tedavi. Negatif kontrol BSA kullanın.
  3. Tedaviden sonra hücre lifter hücrelerle hasat ve spin 500 x g, 4 ° C'de 5 dakika süreyle, hücreleri aşağı
  4. Annexin V-Alexa 488 ve 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 100 hücrelerle leke μL V bağlama arabellek 15 dakika oda sıcaklığında annexin.
  5. Annexin-bağlama arabellek 200 µL örnekle sulandırmak, karışımı yavaşça, o zaman buz üzerinde örnekleri kuluçka süresinden sonra devam.
  6. Lekeli hücreleri en kısa zamanda Akış Sitometresi 5 tarafından analiz. V-Alexa 488 annexin FITC kanalda algılandığında ve 7-AAD PerCP/PerCP-Cy5.5 kanalda algılandı.

4. Hücre içi Ceramide boyama

  1. yağ asidi tedaviden sonra adım 3.3 olduğu gibi hücre hasat. % 4 paraformaldehyde 30 dakika süreyle hücreleri tamir
  2. Örnek 1 mL 1 x PBS ile yıkayın, aşağı spin olarak 3.3 içinde adım ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
  3. 100 μL 1 x permeabilization tampon 30 dakika süreyle anti-ceramide birincil antikor (1: 200 seyreltme) hücrelerle leke
  4. Yıkama ve spin aşağı hücreleri tekrar olduğu gibi adım 4.2.
  5. 100 μL 1 x permeabilization tampon 30 dakika süreyle Anti-fare IgM ikincil antikor (1:500 seyreltme) hücrelerle leke
  6. Yıkama ve spin adım 4.2 olduğu gibi yine hücreleri aşağı. 250 μL 1 x PBS ekleyin ve lekeli hücreleri Akış Sitometresi 5 tarafından analiz.
    Not: ekipmanları ve Kimyasalları tablosu ayrıntılı reaktif listesinde bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Obezite Serumda serbest yağ asitleri konsantrasyonları artar. Profesyonel fagositler makrofajlar aktif olarak ana bilgisayar homeostazı korumak için yağ asitleri götür. Bu işlemler sırasında aşırı yüklenmiş lipidler makrofaj hücre ölümüne neden olabilir. Bu amaçla, biz BMDMs vitro obez düzeyde diyet yağ asitleri ve akış sitometrik boyama kullanarak ölçülen makrofaj hücre ölümü ile kültürlü. Doymuş yağ asitleri, BSA denetimine göre özellikle Stearik asitler, indüklenen önemli hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yağ asidi çözüm uygun hazırlanması yağ asitlerinin biyolojik işlev eğitim için kritik öneme sahiptir. Yağ asidi nötralize sulu çözüm onun çözünürlük artar. Ancak, hala su veya PBS düşük çözünürlük, yağ asitlerinin, özellikle doymuş yağ asitleri, sodyum tuzları şunlardır biz gözlenen. Bir yöntem yağ asidi1dağıtılması yardımcı olmak için % 95-100 etanol kullanmaktır. Bu yöntemi kullanarak, hücrelere daha yüksek toksisite daha az toksik doymamış yağ asitleri için daha düşük konsantrasyonlarda bile gö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Bu eser kısmen Louisville Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklendi ve Ulusal Kanser Enstitüsü (Bethesda, MD) R01CA177679, R01CA180986 verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CPX Ultrasonik Banyo BransonicModel 2800
Sodyum palmitat (PA)Nu-Chek Hazırlık, Inc.S-1109MW 278
Sodyum stearat (SA)Nu-Chek Hazırlık, Inc.S-1111M.W. 306
Sığır serum albümini (BSA), yağ asidi içermezFisher Scientific9048-46-8
Fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (mM-CSF) Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi,   Inc.5228
RPMI 1640VWR Uluslararası71002-878
Ek V, Alexa Fluor 488 eşlenikFisher ScientificA13201
7-AADBD Biosciences559925
Monoklonal anti-seramid antikoru (fare IgM)SigmaC8104-50TSTKlon: MID 15B4
Keçi Anti-Fare IgM Antikoru ve mikro; zincir, FITC konjugeSigmaAP128F
Fiksasyon tamponuBiolegend420801
Geçirgenlik tamponuEbioscience4307693
Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu Sigma11814389001
Annexin V Bağlayıcı TamponBD Biosciences556454
L929 hücreleriATCCCCL-1
Corning  Hücre Kaldırıcı Fisher Scientific07-200-364
Not: MW moleküler ağırlık içindir.

Kaynaklar

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Seramid BirikimiBSA Ya Asidi KonjugatKemik li i T revli MakrofajlarAk SitometrisiStearik Asit UygulamasAnnexin V BoyamaSeramid TespitiMakrofaj Diferansiyasyonu
Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.