Yöntem makalesi

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

DOI:

10.3791/56537

⸱

19 Şubat 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ozmotik stres ekzositozu ve bu işlem sırasında serbest nörotransmitter miktarını etkiler. Biz nasıl transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte elektrokimyasal yöntemleri birleştirerek ekstraselüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu etkinlik, vezikül quantal boyut ve serbest nörotransmitter miktarı incelemek için kullanılabileceğini göstermek ekzositozu sırasında.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amperometry kayıt hücre salgı hücreleri ekzositozu etkinlik ve veziküller içinde tek ekzositozu olaylar serbest nörotransmitter miktarını azaltarak bu fiziksel stres yanıt ozmotik şok göstermek için tabi. Okuldan nörotransmitter azalma membran biyofiziksel özelliklerinde değişiklikler nedeniyle yanıt ozmotik stres olarak hücreleri küçültmek ve bu varsayımlar ile hücre sitoplazma içinde salgı veziküller etkilenmez olduğunu sürülmüştür hücre dışı ozmotik stres. Amperometry kayıt ekzositozu ne bir vezikül ile plazma zarı Sigortalar ancak vezikül füzyon tetiklenir önce bilgi vezikül içeriğine sağlamaz an hücrelerden serbest izler. Bu nedenle, amperometry birleştirerek ekzositozu hücreler tetiklenir önce salgı veziküller karakterize bir özelliği olan diğer tamamlayıcı analitik yöntemleri ile kayıt nasıl salgı veziküller incelenmesi için daha geniş bir genel bakış sunar ve ekzositozu işlem ozmotik şok tarafından etkilenir. Biz burada nasıl hücre içi elektrokimyasal sitometresi ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ile kayıt amperometry tamamlayan salgı veziküller boyutu ve nörotransmitter içeriğindeki değişiklikler karakterize etmek için kullanılabileceğini tarif kromafin hücre ekzositozu etkinlik öncesi ve sonrası ozmotik strese maruz kalma ile ilgili olarak. Tüm üç analitik yöntemlerle deneylerden elde edilen nicel bilgilerden bağlayarak, sonuçlar daha önce salgı veziküller içinde boyutunu küçültme ve vezikül quantal boyutunu azaltarak ekstraselüler ozmotik stres yanıt yapılmıştır bir sabit vezikül nörotransmitter konsantrasyon korumak. Bu nedenle, bu neden veziküller, ozmotik stres, cevaben ekzositozu yayın sırasında serbest tutar nörotransmitter azaltmak ile ilgili bir açıklama sağlar. Buraya amperometric recordings tersinir bir süreç ve o vezikül yerleştirilmiş hücreler izotonik bir ortama döndürülür zaman nörotransmiterler ile ozmotik şok doldurulmuş sonra bu gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbrek üstü bezlerinde kromafin hücre nörotransmitter molekülleri kan akışı içine yayın nöroendokrin hücrelerdir. Bu bir bağlantı içerir hücresel süreç ve içerik veziküller ekzositozu denen bir süreç ekstrasellüler alana yayın sonuçlanan veziküller, nörotransmitter dolu bir füzyon yoluyla ortaya çıkar. Nörotransmiterler (adrenalin ve noradrenalin) kromafin hücre içinde aktif olarak büyük yoğun çekirdek veziküller (LDCVs) zar proteinleri tarafından taşınan ve yüksek konsantrasyonda (~0.5-1 M)1,2' de depolanan. LDCVs içinde nörotransmitter birikimi katekoiamin molekülleri benzeşme chromogranin proteinler (~ 169 mg/mL)3,4,5 oluşan intravesicular yoğun çekirdek protein Matrix sağlanır ,6ve ATP (125-300 mM)7, Ca2 + gibi vezikül içine katekoiamin yükleme ve depolama için anahtar bileşenleri içeren intravesicular bir kokteyl çözüm (50-100 µM çözüm ve ~ 40 mM bağlı protein matriksi)8, Mg2 + (5 mM)9, askorbat (10-30 mM)10ve pH ~5.511,12. Teorik çözünen konsantrasyon veziküller içinde toplamı 750 mm'den kadar rağmen ISO ozmotik bir koşulu ile hücre sitoplazma (310 mOsm/kg)13, LDCVs korumak. İntravesicular bileşenleri bileşimi sadece yoğun çekirdek protein matris için yükleme ve depolama katekolaminler, aynı zamanda solutes toplama işlemi için gerekli değildir. Bu önemli ölçüde azaltır veziküller Osmolarite önemli ölçüde azalır ve ekzositozu5,6sırasında çıkış tutarı katekoiamin etkileyebilir.

Ekstrasellüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu işlem amperometric kayıt tarafından çalışmalar o yüksek hücre dışı ozmotik basınç ekzositozu etkinliği engeller ve single'salgılanan nörotransmitter sayısını azaltır bildirdin vezikül bölmeler4,14,15,16,17,18,19. Bu gözlemler açıklamalarını hücre sitoplazma inhibe vezikül füzyon olaylar ve membran biyofiziksel özellikleri sayısını etkileyen bir değişiklik makromoleküllerin kalabalık mümkün geliştirme üzerinde spekülasyonlar var. nörotransmitter ekzositozu sırasında serbest bırakmak. Yüksek hücre dışı ozmotik stres tetiklenmiş ekzositozu14, önceki aşamada bir vezikül bölümünde depolanan nörotransmitter moleküllerin tanımlayan vezikül quantal boyutu etkilemez bu düşünceler kabul 15 , 17 , 19 , 20 , 21. Tek Kişilik hücrelerde ekzositozu açıklaması amperometric ölçümler ile sinaps yapılandırma taklit eden bir deneysel ayarlarý oluşturma hücre yüzeyine yakın temas içinde bir karbon fiber disk elektrot yerleştirilir nereye amperometric elektrot bir postsinaptik dedektörü (şekil 1)22,23hizmet vermektedir. Ekzositozu hücresine uyararak, bir nörotransmitter dolu veziküller hücre plazma zarı ile sigorta ve bölüm veya tam vezikül içerik ekstraselüler uzaya serbest bırakmak için teşvik edebilirsiniz. Nörotransmitter electroactive (örneğin, katekolaminler) Ag/AgCl referans elektrot bir Redoks potansiyeli 700 mV vs uygulayarak Eğer elektrot yüzeyi yayımlanan bu nörotransmitter moleküller mamüllerinin tespit edilebilir . Sonuç olarak, geçerli sivri bir dizi bireysel ekzositozu olayları algılama işaretleyin. Geçerli zaman izleme amperometric kaydında karşı her tek amperometric spike altına alan başına ekzositozu olay tespit ücret temsil eder ve serbest, Faraday denklemi kullanarak nörotransmitter köstebek için dönüştürülebilir. Bu nedenle, amperometric kayıtları tek ekzositozu olaylardan ihraç tutarı nörotransmitter hakkında kantitatif bilgi vermek ve ekzositozu olaylar frekanstan rapor ancak salgı veziküller nicel bilgi mevcut değil içerik vezikül füzyon ve nörotransmitter yayın önce başlatıldı.

Bu nedenle, nasıl salgı veziküller hücrede daha iyi anlaşılmasını almak için sitoplazma yanıt ekstraselüler ozmotik stres için hücre ekzositozu, geçmesi tetiklenir önce bu bilgileri zenginleştirmek için diğer tamamlayıcı analitik yöntemleri kullanılabilir. Örneğin, ozmotik stres sivilce cilt değiştirirse araştırmaya, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analiz görüntüleme sonra kimyasal fiksasyonu hücrelerin vezikül boyutunu ölçmek için kullanılabilir. Ozmotik stres sivilce quantal boyutu etkiliyorsa incelemek için hücre içi elektrokimyasal sitometresi adında bir son zamanlarda geliştirilen amperometric teknik uygulanabilir vezikül nörotransmitter içerik salgı veziküller, miktar için onların hala canlı hücreleri26sitoplazma içinde ikamet ettiği yerel durum. Hücre içi elektrokimyasal sitometresi teknikte nanotip silindirik karbon fiber elektrot yavaşça canlı hücre ve bu elektrot için 700 mV potansiyel uygulayarak sitoplazma içine eklenir (vs bir Ag/AgCl referans elektrot), lanetlendiklerine memnun veziküller içinde çarpışma, adsorbing ve daha sonra stochastically elektrot yüzeyi rüptür ve böylece serbest içeriklerini karşı tek veziküller gelen ani geçerli bir Redoks tespiti tarafından sayılabilir elektrot yüzey26. Bu nedenle, zaman izleme karşı geçerli amperometric, her tek vezikül rupturing olay içinde geçerli bir geçici yol açabilir ve, her geçerli spike alan entegre ederek, vezikül quantal boyutu Faraday´s hukuk kullanılarak hesaplanabilir.

Bu nedenle, hücre içi elektrokimyasal sitometresi tarafından kaydedildiği şekilde TEM görüntüleme vezikül quantal boyut analizi, birlikte kullanarak vezikül boyut ölçüleri elde niceliksel bilgileri bağlayarak, vezikül nörotransmitter konsantrasyonu da olabilir kararlı olmak. Bu hücreler için farklı ozmotik koşullar maruz kaldığında vezikül karakterizasyonu ve nasıl veziküller ekzositozu önce aşamada hücre dışı ozmotik strese yanıt verebilir üzerinde daha iyi bir görünüm sağlar. Bu yöntemler bir araya gelen sonuçları ekstraselüler yüksek ozmotik basınç, huzurunda veziküller küçültmek ve onların quantal boyutu ayarlamak ve bu ölçümler göreli değişikliklerden nicel bilgi karşılaştırarak gösteren göstermiştir çekmek ise, veziküller onların içeriği ve sürekli nörotransmitter konsantrasyon24korumak için boyutunu ayarlamak. Böylece, bu anlayış ozmotik stres maruz hücrelerdeki nörotransmitter sürümü üzerinde yapılan gözlemler bağlanma değerlidir. Bu protokoller ekstraselüler osmolalite kendi yerel ortamını yanıt nasıl salgı veziküller karakterizasyonu ve bu yanıt etkisi ekzositozu izin bu üç tamamlayıcı metodolojileri nasıl kullanılacağını açıklar işlem. Bizim önceki gözlemleri yüksek ozmotik basınç ekzositozu24ek olarak etkisi ile ilgili olarak, biz hücre kurtarma sonra ozmotik şok ve birden çok baryum elektrodlar kromafin içinde etkisini açıklayan ek deneyler mevcut hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültürü Enzimatik sindirim böbreküstü bezleri tarafından izole sığır kromafin hücre

  1. Kromafin hücre sığır adrenal bezleri toplanan yalıtmak için hücreleri % 70 etanol çözüm ile sterilize. Dış görev yağ ve bağ dokusu bir neşter kullanarak kırpın. 37 ° C'ye thermostated oldu Locke'nın çözüm (NaCl 154 mM, KCl 5.6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic asit (HEPES) pH 7.4 5.6 mM) kullanarak adrenal damarlar kan kaldırmak için durulama
  2. Doku sindirmek için her bezi yaklaşık 2.5 mL sıcak steril filtre % 0,2 collagenase P çözüm kullanarak adrenal ven yoluyla enjekte edilerek açıldığı ve doku 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Bezleri medulla sindirim süreci tamamlandıktan emin olmak için incelemek. Doku yumuşak ve değil gergin hissetmeniz gerekir.
  3. Kapalı bezleri boyuna yönde kırpma tarafından sindirilmiş medulla toplamak. Bir neşter kullanarak medulla doku kıyma. Doku süspansiyon kevgir üzerinde filtre ve Locke'nın çözüm collagenase s. etkinliğini azaltmak için yaklaşık 50 mL birime seyreltik
  4. Hücreleri bir santrifüj oda sıcaklığında 10 dakika içinde 300 x g de cips ve 50 mL steril test tüpleri toplamak. Elde edilen Pelet 20 mL Locke'un çözümde yeniden askıya alma ve çözüm üzerinde bir steril 100 µm naylon mesh tüpler içine filtre.
  5. Kromafin hücre süspansiyon ile steril Percoll (1:1) karışımı ve hücre çözümü 18.600 x g için oda sıcaklığında 20 dk, santrifüj kapasitesi. Yoğunluk gradient üst tabakası toplamak ve çözüm üzerinde 100 µm naylon mesh tüpler içine filtre.
  6. Percoll dışlamak için Pelet Locke'un çözümde yeniden askıya almadan önce Locke'nın çözüm ve oda sıcaklığında 10 dakika için 300 x g, santrifüj ile hücre süspansiyon oranında seyreltin. Yaklaşık 4 milyon hücre/mL izole hücre süspansiyon tahmini hücre yoğunluğudur.
  7. Amperometric kaydı ekzositozu ve hücre içi sitometresi ölçümlerin, kollajen IV plaka kromafin hücre yoğunluğu yaklaşık 17,5 × 103 hücreleri/cm2 60 mm plastik yemekler kaplı ve % 5 CO2 37 ° C'de hücreler kuluçkaya çevre. Elektrokimyasal deneyler hücre kültürü 1-3 gün içinde gerçekleştirin.
  8. Deneyler, 75 cm2 hücre kültür şişe şişe başına 7-8 milyon hücre yoğunluğu, plaka kromafin hücre TEM için Imaging ve % 5 CO2 ortamında 37 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.

2. tek hücre ekzositozu Amperometry deneyleri24

  1. Bu deneyler için karbon fiber microelectrodes imal etmek, bir bardak bu deneylerde kullanılan baş aşamasında kapiller elektrot tutucu için uygun bir dış çap ile alın. Borosilikat cam kılcal bir dış çap 1.2 mm ve bir iç çapı 0.69 mm ile kullanın.
    1. Kılcal uçlarına birini su aspirasyon tüp bağlayın. Bir parça kağıda beyaz görselleştirme geliştirmek için gibi bir şey üzerinde 5 µm çapı karbon elyaf yerleştirin.
    2. Tek bir karbon fiber tanımlamak ve karbon fiber karbon fiber ücretsiz sonu birbirine kılcal açık uçlu konumlandırma süre tutmak için parmağını bile bir uç fiber basılı tutun. Hafifçe böylece her iki ucunda da kılcal damar karbon fiber sopa karbon fiber kapiller bardağına Aspire edin. Aspirasyon kuvvet geri çekil.
  2. Karbon fiber kılcal bir micropipette çektirmenin yerleştirin ve cam kapiller iki ayrı cam pipet ipuçları çek. İki cam ipuçları arasında bağlı karbon fiber kesmek için karbon fiber kesip iki karbon fiber microelectrodes kazanç makas kullanın.
  3. Mikroskop altında karbon fiber karbon lif lif bir neşter kullanarak cam kapiller kaplama üzerinden nerede uzanan kenarındaki el ile kesme sağlayan kalın bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
  4. Karbon fiber, cam kaplamalı karbon fiber bahşiş bırakarak kesim sonrası bir kaç mm elektrot uç bir epoksi çözüm epoksi çekin ve karbon fiber ve çevresindeki cam arasındaki olası herhangi bir açık alan mühür için 10 dakika için ekleyin. Elektrot elektrot ucunda hantal tutkal damla önleyebilirsiniz için yavaş yavaş epoksi çözüm dışarı kaldırın.
  5. Elektrotlar, elektrotlar bağlı çift taraflı yapışkan ısıya dayanıklı bant ile sahibi (örneğin, düz bir tahta sopa) yerleştirin. Epoksi tedavi elektrotlar gecede 100 ° C'de bir fırında pişirin İpuçları kolayca zarar bir yüzeye temas gelirlerse elektrot Yani elektrotlar sağlamak her zaman güvenli bir şekilde nerede elektrotlar yerde sabit değildir ve ipuçları Dokunulmaktan riske değil bir tutucu kullanılarak depolanır.
  6. Bir düz disk elektrot yüzeyi elde etmek için elektrot bir microgrinder sahibi yerleştirin ve karbon fiber elektroda 45 °'in bir melek, eğim. Eğim sonra daha sonra disk elektrot yüzeyi 45 ° açıyla elektrot hücre ekzositozu ölçüm için yakınındaki yerleştirirken bulmak nasıl bilmek kalıcı bir kalem kullanarak, üst kat üzerinde kılcal işaretleyin.
    Not: Bu deneyler olduğu gibi bu adım önemlidir, oval disk elektrot düz üstünde tepe-in onun yüzey paralel Petri kabına yüzeyine hücrelerle yerleştirilmesi gerekiyor. Ayrıca, beveling elektrotlar bir taze ve temiz elektrot yüzey sağlamak için deneyler ile aynı gün yapılır.
  7. Kullanmadan önce çevrimsel voltammetry kullanarak geçerli kararlı duruma izlemek için bir test çözüm (örneğin, 0,1 mM dopamin PBS arabelleği (pH 7,4)) her karbon fiber elektrot yerleştirin. Bir döngüsel voltammetry inceden inceye gözden geçirmek için bir üçgen potansiyel dalga biçimi uygulamak için 0,8 V V-0.2 Ag/AgCl referans elektrot 100 mV/s'de iyi tepki Kinetik veri sağlamak için bu elde edilir vs 5 mikron çapında disk için teorik olarak hesaplanan değerleri ile anlaşma gelmektedir karbon fiber elektrot25.
  8. Ekzositozu amperometry kaydı ile ters bir mikroskop üzerine kültürlü kromafin hücre Petri kabına yerleştirin. Bu kayıt, ölçülen çok küçük akımları nedeniyle amperometry sırasında elektronik gürültü ortadan kaldırmak için bir Faraday kafesi ile kurmak mikroskop korumak önemlidir. Mikroskop sahne Isıtma sıcaklığı 37 ° C hücre deneyler sırasında korumak için kullanın.
  9. Bir düşük gürültü düzeltme eki kelepçe aleti 700 sürekli potansiyelini uygulamak için kullanın Ayrıca çalışma elektrot uzak Petri kabına yerleştirilir bir Ag/AgCl referans elektrot karşı çalışma elektrot, mV. Kayıt ekzositozu kromafin hücre için 10 kHz sinyal digitalize ve bir iç düşük geçiş kaydedilen sinyali filtrelemek için 2 kHz Bessel filtre uygulayın.
  10. Tek hücre kayıt amperometric gerçekleştirmek için taze eğimli ve test edilmiş karbon fiber disk elektrot elektrot tutucu potansiyostat ile kullanılan baş Sahne Alanı'nın bağlayın.
    1. Yavaşça elektrot ile düz oval disk şekli elektrot yüzey hücre apikal yüzeye aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve elektrot bir micromanipulator kullanarak hücre membran temas yerleştirin.
    2. Elektrot yerleştirme hücre membran üstüne üzerine neden olduğu hücre deformasyon izleyerek hücre elektrot mesafe ayarlamak ve dikkatle elektrot hücre bir şekli özgün hücre şeklini yakın nerede kavuşur uzaklığa geri çek . Kinetik ve nicel kayıt için ideal bir synapse kimyasal ürün postsinaptik algılanması için benzer koşullar olan elektrot ve hücre yüzey ayırmak için 100 nanometre ince bir sıvı film oluşturmaktır.
  11. Ekzositozu hücrelere uyarmak için bir cam micropipette 2-3 µm çapı 5 mM BaCl2 çözüm en az 20 µm etkilemek için pipet ucundan sızıntı herhangi bir çözüm önlemek için hücreye, uzak mesafeden dolu, uç boyutu getirin deneme ve 5 s enjeksiyon nabzı 5 mm BaCl2 çözüm ekzositozu hücresine uyarmak için hücre yüzeyinde uygulayın.
  12. Ekzositozu süreci tersine çevrilebilir ozmotik basınç etkilerini çalışmaya, 310 mOsm/kg ISO ozmotik basınç ve ayarlayarak yapılan bir hipertonik arabellek izotonik arabellek çözümünü (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM glikoz, 10 mM HEPES, pH 7,4) hazırlamak 730 mOsm/kg için karşılık gelen bir osmolalite izotonik arabellek Çözümle NaCl konsantrasyonu.
  13. Hücreleri izotonik arabellekte yerleştirin ve yaklaşık 3 dakika için başlatılan ekzositozu aktivite sırasında amperometric geçerli geçişler kaydederken baryum enjeksiyonu nabzı uygulayarak ekzositozu hücresine teşvik.
    1. Hipertonik koşulları izotonik koşullarında ekzositozu yanıtlarını karşılaştırmak için hipertonik arabellek çözüm 10 min için hücreleri kuluçkaya ve bundan sonra ekzositozu teşvik ve amperometric kayıt 3 dk gerçekleştirmek için baryum enjeksiyonu nabzı uygulayın.
    2. Tersine çevrilebilir yanıt hücre için hücre izotonik arabellek çözüm 10 min için tekrar kuluçkaya ve bir 5'ler uygulayarak hücreleri uyarmak baryum enjeksiyonu nabız ve hücre ekzositozu yanıtından kayıt 3 dk gerçekleştirin.
  14. Denetim birden çok baryum elektrodlar tarafından ekzositozu etkinliği üzerindeki etkisini belirlemek için deneyler yapmak gibi bir amperometric kaydı üç ardışık ekzositozu sürümü aynı BaCl2 elektrodlar yerleştirilir izotonik arabellek hücre ve farklı osmolarite ile üst üste hücre kuluçka deneyler için aynı zaman iletişim kuralını kullanarak.

3. hücre içi elektrokimyasal sitometresi24,26

  1. Elektrotlar vezikül quantal boyutu ölçümler için imal etmek, aynı malzeme kullanımı ve 5 mikron çapında karbon fiber elektrot göre bölümler 2,1 ve 2,2 elektrot imalat amperometric ekzositozu için yer alan açıklamalar içinde hazırlanmaya başlayın ölçümleri.
  2. Mikroskop altında bir neşter 30 100 µm arasında bir uzunlukta karbon fiber cam ucundan yapışkanlık dışarı sol karbon fiber cam ucu dışarı uzanan kesmek için kullanın.
  3. Karbon fiber elektrot alev kazınmış ucu hazırlamak için bir bütan alev kullanın. Bir eşit olarak kazınmış elde etmek için silindirik şekilli elektrot uç, silindirik şekilli karbon fiber elektrot döner süre tutun ve karbon ucu kırmızı oluşturuncaya dek karbon fiber cam mavi bütan alev kenarına uzanan yer Renk. Bu kez daha az 2 alır s. Eğer başarılı olursa, bir kabartma elektrot uç boyutu 50-100 nm çapında (öyle uç bir SEM görüntüsü şekil 5' teBgösterilir) sonuçlanır. Aşındırma alev sonra elektrot elektrot uç değerlendirmek için mikroskop altında yerleştirin.
  4. Silindirik nanotip elektrot bir 15 s daldırma elektrot ucunu aseton çözümünü ardından 3 dk için epoksi çözüm ekleyin. Bu epoksi epoksi baskılı karbon fiber elektrot yüzeyi kapalı aseton temizler iken karbon fiber ve yalıtım cam kapiller duvarı arasındaki potansiyel boşluk boşluk imzalamaya sağlar. Epoksi tedavi etmek için elektrotlar bir fırın gecede 100 ° C'de pişirin
  5. Kullanmadan önce 2.7 bölümünde açıklandığı gibi her karbon fiber elektrot kararlı duruma mevcut test çevrimsel voltammetry kullanarak. Deneyler için yalnızca görüntülemek bir plato çevresinde geçerli elektrotları kullanın 1,5-2,5 nA27.
  6. Hücreler arası amperometry ölçüleri, hücrelerin mikroskop 2.8 içinde açıklandığı gibi yerleştirin ve potansiyostat 2.9 açıklandığı gibi aynı deneysel ayarlarını kullanın.
  7. Hücre içi amperometric ölçüm gerçekleştirmek ve hücre için önemli fiziksel zarar önlemek için nanotip silindirik elektrot hücre içine ekleyerek eklemek için nazik bir mekanik kuvvet, elektrot hücre plazma ile itmek için yeterli membran ve bir micromanipulator kullanarak hücre sitoplazma içine.
  8. Sonra ekleme ve silindirik elektrot kapalı hücre zarı ile canlı hücreden yerinde amperometric kaydını başlat seçimini yapın. Oksidasyon, potansiyel bu elektrot için uygulanır, veziküller elektrot yüzeyine absorbe ve stochastically rüptürü.  Bu nedenle, bu işlem başlatmak için uyarıcı türlü için gerek yoktur.
  9. Vezikül quantal boyutu ozmotik etkisini belirlemek için bir grup izotonik ve deneysel durumu 2,13 bölümünde açıklandığı gibi kullanarak hipertonik arabellek inkübe hücre hücre içi sitometresi ölçümleri toplamak.

4. veri analizi Amperometry kayıtları

  1. Ekzositozu ve hücre içi vezikül quantal boyut analizi kaydedilen amperometry verileri çözümlemek için geçerli geçişler analiz zaman izleme karşı kaydedilen geçerli bu Kinetik sağlar bir yazılım programı kullanmak en yüksek parametreleri ve bireysel geçerli tepeler için entegre toplam ücret belirlenebilir. Veri analizi için veri analiz programı için Igor28yazılı Sulzer laboratuvarda geliştirilen yazılımı kullandık.
  2. Amperometric analiz sivri, üç kez kök ortalama kare (RMS)'in standart sapması her kayıt için gürültü doruklarına için bir eşik sınırı seçin.
  3. Amperometric sivri el ile Gauss şeklini izlemesini değil, birleştirilmiş ekzositozu olaylar sonucu, ve sadece üç kez bir eşik ile Gauss şekilli çiviler kabul sivri çift yanlış sivri önlemek üzere her hücre kayıt toplamak RMS ses daha yüksek.
  4. Toplamak için tek amperometric başına toplam ücret verileri zirve ve Faraday'lar hukuk kullanma (N = QnF) tespit ekzositozu ya da hücre içi tek vezikül rüptürü olay, N mol nerede katekoiamin nörotransmitter molar miktarını hesaplamak için Redoks reaksiyonu elektrot yüzeyi, Q geçmekte nörotransmitter her spike altında n tespit toplam ücret = = Redoks reaksiyonu transfer elektron sayısı (n = 2 katekolaminler için) ve Faraday´s sürekli F = 96485 C/mol.
  5. İlk olay her hücre için başına tespit ortalama ücret hesaplama tarafından toplanan verileri istatistiksel çözümleme gerçekleştirme. Sonra hücreleri arasındaki fark, hücreler arasında ortalama masrafı hesaplamak ve öğrenci'nin t-Testi eşit olmayan varyans varsayarak hücreler arasında kullanın. Bu çalışmada MATLAB programı istatistiksel analiz için kullanılan.

5. TEM görüntüleme vezikül boyut analizi için

  1. Hücre farklı ozmotik koşullar, TEM görüntüleme gerçekleştirmek için önce izotonik veya hipertonik tampon % 5 CO2 ortamında hücreleri kimyasal fiksasyonu önce 37 ° C'de 10 dakika hücrelerde kuluçkaya.
  2. 29Karnovsky sabitleştirici yöntemi kullanarak hücre fiksasyon gerçekleştirin. Bu yöntemi kullanarak, hücreleri % 0,01 sodyum azid, % 1 formaldehit ve örnek 4 ° C'de saklanabilecek % 1.25 oxazolidin içeren bir çözüm ile kuluçkaya
  3. Fiksasyon sonra 0.15 M sodyum cacodylate arabellek hücrelerle yıkayın.
  4. Hücre leke örnekleri fiksasyon sonrası ve TEM görüntüleme için hazırlık olarak, 2 h 1 h kuluçka % 0.5 uranyl asetat çözüm karanlık oda sıcaklığında ardından 4 ° C'de % 1 Osmiyum tetroxide üçün hücrelerle kuluçkaya.
  5. Son fiksasyon adımda hücreleri ilk % 100 etanol hücrelerde durulama tarafından kurutmak ve hücreleri aseton ile durulayın.
  6. Epoxyresin içinde hücre örnekleri katıştır ve bundan sonra 30-40 dk için 4.000 x g de aralıklarla gerçekleştirmek ve 15 h 60 ° C'de 48 h kuluçka takip için 40 ° C'de polimerize için hücre örneği izin
  7. Görüntüleme için hazırlık olarak, bölüm hücre örnek gömülü Agar 100 reçine dilimler halinde 60 kalınlığı ile bir ultramicrotome kullanarak nm.
  8. 4 dk. 20 tarafından takip için bir %4 uranyl acetate/25% etanol çözüm için hücreleri Konu su ile durulama, s. Reynolds kurşun sitrat 3 dk. 20 tarafından takip için hücrelerle yıkama su ile durulama, s.
  9. Transmisyon elektron mikroskobu görüntüleme hücre örneklerinin gerçekleştirin. Bizim deneylerde biz-si olmak kullanılmış faaliyet gösterdi bir transmisyon elektron mikroskobu 120 kV.
  10. Veziküller nüfusu hücre sitoplazma görüntüler hücre ultrastructure gösteren bir hücre bölümü kaydedilen her görüntüden önce kaydedilen ölçek çubuğu her TEM Görüntüdeki piksel ilgili tarafından görüntü piksel boyutu kalibre edin. Her görüntü hücre izotonik veya hipertonik koşullara maruz vezikül boyutlarda belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanın. Bizim deneyler, yazılım ImageJ görüntü analizi için kullanılır. Bu hücre TEM görüntülerden hücresel ultrastructure görüntü analizi için düşünülmesi ve önceden Almers´s laboratuvar30tarafından açıklanan hücre bölümleri kalınlığına göre bu ölçümlerin boyutu ayarlama ihtiyacı dikkati çekiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada tarif protokol nasıl TEM görüntüleme iki elektrokimyasal metodolojileri, karbon fiber amperometry ve hücre içi elektrokimyasal sitometresi ile birlikte birleştirerek daha geniş bir görünüm için etkisi atıfta kazanımlar bilgiler sağlayabilir için hücre dışı ozmotik basınç salgı veziküller ve ekzositozu süreci. Hücreler için ozmotik maruz kaldığında deneysel ( şekil 1' de gösterilen) kurmak kullanarak tek kromafin hücre'ekzositozu piyasaya temsilcisi amperometric kayıtları karşılaşt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bir iletişim kuralı ve salgı veziküller ve daha iyi nasıl bir fiziksel güç gibi ozmotik basınç salgı veziküller etkileyebilir anlayış kazanmak için ekzositozu işlemi çözümlemek için üç tamamlayıcı analitik yöntemleri birleştiren avantajları mevcut ve salgı hücreleri ekzositozu sürecinde. Bu yöntemler ekzositozu etkinlik, veziküller kendi doğal ortamlarında quantal boyutunu belirlemek için kullanılır, hücre içi elektrokimyasal sitometresi kayıt için kurulan bir yöntemdir karbon fiber elektrot amperometry içerir ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar İsveçli Araştırma Konseyi (349-2007-finansman için 8680) ve Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, İsveç) sığır adrenal bezleri bağış için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaClSigma AldrichS7653
KClSigma AldrichP9333
NaHCO3Sigma AldrichS5761
HEPESSigma AldrichH3375
MgCl2Sigma AldrichM-2670
GlikozSigma AldrichG8270
Kollajenaz PRoche, İsveç11 213 857 001
100-&mikro; M Naylon örgüFisher Sientific08-771-19
PercollSigma AldrichP1677
Kollajen IV kaplı 60 mm plastik tabakVWR354416
SantrifüjAvanti J-20XP
Borosilikat cam kılcalSutter enstrümanı Co., Novato, CA
Mikropipet çektirmeNarishing Inc., JaponyaPE-21
Epoksi çözümleri (A ve B)Epoksi teknolojisi, Billerica, MA
BevellerNarishing Inc.EG-400
Ters MikroskopOlympusIX81
Yama kelepçesi AletMoleküler Cihazları, Sunnyvale, CAAxopatch 200B
MikromanipülatörBurleigh Instrument Inc., ABDPCS-5000
Bütan AlevMultiflame AB, H & auml; sselholm, İsveç
Transmisyon elektron mikroskobuOmegaLeo 912 AB

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33(1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633(1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amperometrik Kay tH cre i Elektrokimyasal SitometriGe irimli Elektron MikroskobuKromafin H crelerVezik ler Kuantal BoyutBaryum Klor r Stim lasyonuzotonik Tampon

İlgili makaleler