Yöntem makalesi

Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi

DOI:

10.3791/56538

⸱

6 Aralık 2017

 ,  , 
1Department of Medicine I and Clinical Chemistry, University Hospital of Heidelberg, 2Institute for Diabetes and Cancer IDC Helmholtz Center Munich, Germany & Joint Heidelberg-IDC Translational Diabetes Program, 3German Center for Diabetes Research (DZD)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kantitatif analiz fare siyatik sinir içinde hücre içeriğinin doku kıtlığı nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı doku sindirim ve sinir bağışıklık hücre gruplarından bireysel farelerin Akış Sitometresi Analizi için yeterli hücre sağlar hazırlık için bir yöntemi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik sinir sistemi (PNS) sinir yerleşik bağışıklık hücreleri sağlıklı bir sinir içinde nöronal bütünlüğünü korumak için gereklidir. PNS bağışıklık hücreleri yaralanma ve hastalık, sinir fonksiyonu ve rejenerasyon kapasitesini etkileyen etkilenir. Nöronal bağışıklık hücreleri yaygın olarak ayirt (Eğer) tarafından incelenir. Eğer sinir, bağışıklık hücreleri konumunu belirleyen temel sadece yarı nicel olup yöntemi aynı anda analiz edilebilir işaretleri sayısı ve yüzey ifade derecesi ile sınırlı olup olmadığını tamamlayın. Bu çalışmada, Akış Sitometresi lökosit infiltrasyonu siyatik sinir veya dorsal kök ganglions (DRGs) bireysel farelerin kantitatif analiz için kullanıldı. Tek hücre analizi DAPI kullanılarak gerçekleştirilmiş ve çeşitli proteinler aynı anda yüzey ya da hücre içi ifade için analiz edildi. Bu protokole göre tedavi edildi her iki siyatik sinirleri bir fareden ≥ 30.000 tek çekirdekli olayları oluşturuyordu. Lökosit siyatik sinir, CD45, ifade tarafından belirlenen oranda yaklaşık %5 Toplam Hücre içeriğinin siyatik sinir ve DRG yaklaşık % 5-10 oldu. Her ne kadar bu iletişim kuralı öncelikle PNS içinde bağışıklık hücre nüfus odaklanır, aynı anda bir sayı işaretlerinin ölçmek için Akış Sitometresi esnekliğini diğer hücre nüfusları Schwann hücreleri, perisitlerden gibi sinir içinde mevcut anlamına gelir , fibroblastlar ve endotel hücreleri, de analiz bu yöntemi kullanarak. Bu yöntem bu nedenle PNS, neurotoxicology ve genetik modellerini nöropati veya diyabet gibi kronik hastalıkları gibi sistemik etkileri eğitimi için yeni bir yol sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PNS dolaşımdan girin bağışıklık hücreleri CD45 ve CD11b, ifade tarafından tanımlanan sinir bütünlüğünü korumak ve her iki rejenerasyon ve dejenerasyonu1' rol için yardım et. Makrofajlar (CD68 onların ifade Mouse tarafından tanımlanan) daha fazla MHC ifade bir enflamatuar fenotip doğru eğilmiş onların yüzey (M1) Sınıf II ve CD86 veya daha fazla hücre içi CD206 bir anti-inflamatuar fenotip doğru ifade (M2)2 . Makrofaj fenotip eğriltme3sinyal, patojenler (M1) karşı savunma makrofajlar ve doku rejenerasyonu (M2) rolünde farklı görevler yansıtan Akt üzerinden düzenlenmiş bir dinamik işlemidir. Yaralı bir sinir rejenerasyon ilk sinir4,5ve anti-inflamatuar makrofajlar tarafından fagositoz miyelin enkaz gerektirir (CD68+CD206+) M2 makrofajlar axon akıbet tanıtmak için gösterilmiştir PNS6. İşe Alım veya makrofajlar PNS için azaltılmış veya Engelli fagositoz kapasiteli Engelli rejenerasyon ve sinir bütünlük bakımından sonuçlanabilir. MHC sınıf II, ifade inflamatuar M1 makrofajlar M2 makrofajlar fagositoz daha az yetenekli ve nöronal inflamasyon çeşitli nörodejeneratif hastalıkları7patogenezinde karıştığı.

Sinir yerleşik bağışıklık sistemi hasarı sonucu olarak meydana gelen değişiklikler kantitatif, CD45 kaybına tezahür olabilir+ lökosit (veya artmıştır infiltrasyon CD45+ lökosit olgu iltihabı), veya nitel, gibi makrofaj fenotip m2 M1 fenotip için değişti. PNS bağışıklık hücreleri geleneksel olarak donmuş bölümleri veya malzeme8parafin gömülü kullanarak Eğer aracılığıyla analiz edilmiştir. Eğer ilgi hücrelerinin yerelleştirme belirlemek için gereklidir. Ancak, eğer kez miktar kullanarak nispeten az sayıda dar bir bölümü olan miktar güvenilmez ve seçim önyargı karşı savunmasız hale doku, Hücre sayımı dayanır. Makrofaj fenotip belirlenmesi en az en az iki işaretleri, özellikle CD206 ve MHC gerektirir iken bağışıklık hücreleri belirli alt kümeleri tanımlaması için hücre dışı ve/veya hücre içi işaretleri eşzamanlı tespiti gereklidir Sınıf II. En yaygın olarak kullanılabilir mikroskoplar floresein isothiocyanate (FITC) ve phycoerythrin (PE), gibi en az iki renk kanallarına sınırlıdır eğer tarafından bağışıklık hücreleri belirli alt kümeleri karakterizasyonu kısıtlayıcı ve eksik, gerektiren olabilir birden çok slayt, gerek hangi lekeli ve paralel olarak analiz ilgi, aynı alanından türetilmiş. Bu zaman alan yönü bu nedenle does değil gerekli ödünç vermek kendisi büyük örnek kümeleri çözümleme için. Ayrıca, ilgi işaretlerinin çoğu hücre dışı gibi algılama ya parafin veya cryoconserved katıştırılmış, doku membran bütünlüğü bozulma ve epitopları maskeleme, hem de kaybı nedeniyle sorunlu olabilir antijenlere aseton ve metanol9gibi çözücülerin kullanımından ilgi.

Buna ek olarak, Akış Sitometresi, optik ölçen ve süspansiyon tek hücre özelliklerini Floresan ışık, bir demeti geçerken sağlar hücre popülasyonlarının çözümlenmesi için daha pratik ve kapsamlı bir araç. Doku, dijital bir görüntüsünü üreten yerine Akış Sitometresi sağlar bir hücrenin göreli boyutu ve ileri dağılım (FSC), parçalı yapı/iç karmaşıklık anılacaktır yansıtıcı dizin içeren parametreleri ayarlama, otomatik bir miktar veya yan-dağılım (SSC) ve göreceli floresan yoğunluğu, hücre konjuge bir antikor gibi uygun bir fluorophore ile etiketli sağlayan. Tipik Akış Sitometresi iki, hava soğutmalı lazerler oluşur; bir argon lazer 488, mavi ışık üretir nm ve helyum-neon lazer üreten ışıkta 633 nm. Bu kombinasyon algılama ve ölçüm, için aynı anda, en az beş hedef yüzeyi veya hücre içi bölme içinde sağlar. Daha gelişmiş akış cytometers seçilen fluorochromes, en yüksek emisyon dalga boylarında önemli ölçüde örtüşmeyen sağlayan sekiz farklı fluorochromes tespiti için bir kez, izin birden çok lazerler bileşiminden oluşabilir.

Akış Sitometresi tarafından analiz etmek için doku ilgi ilk enzimatik, bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için genellikle collagenase ile sindirilir olun gerekir. Fare siyatik sinir analiz daha önce her fareden alınan doku az miktarda nedeniyle zor olmuştur. Buna ek olarak, miyelin aksonlar çevresinde yüksek yağ içeriği hücre kurtarma engellemektedir ve enkaz büyük miktarlarda üretir. Siyatik sinir hazırlık ve sindirim için burada açıklanan yöntemi Barrette vd Schwann hücresi yalıtım kuralından adapte oldu 7ve sinirler için Akış Sitometresi Analizi, bireysel farelerin yeterli hücrelerden fareler arasında varyasyon azaltmak için izole amaçlamaktadır. Tek Kişilik hücrelerde ham doku Özet tanımlanması için DAPI kullanarak sık hücre kaybına neden axon enkaz kaldırmak gerek kaçınmanızı sağlar. Çamaşır deterjan zengini arabellek AIDS hücrelerinin sürümdeki ile birkaç kez böylece verim artırma yağlı enkaz içinde sıkışmış. Bu protokole göre tek bir fareden her iki tam uzunlukta siyatik sinir sindirim ≥30, 000 tek çekirdekli olayları oluşturur ve en az 3 kez bu rakam DRG alınmadı. CD45 oranı+ lökosit yapıldı Toplam hücre içeriğini siyatik sinir Özet ve yaklaşık yaklaşık % 5'i DRG Özet % 5-10. CD45 çoğunluğu+ siyatik sinir hücrelerinde ifade makrofaj işaretleri, CD68 ve CD206.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vahşi-C57BL/6 o farelerde tip (erkek; 10-12 hafta) standart 12 h açık/koyu döngüsünde tutuldu ve ücretsiz erişim için standart chow diyet ve su temin edilmiştir. Tüm hayvan deneyleri ilgili yönergelere uygun olarak yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından yürütülen ve bölgesel yetkilisi Karlsruhe, Almanya (G216/10) itibariyle yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış.

1. perfüzyon fare

  1. Kurban fare (C57BL/6; Erkek; 10-12weeks) CO2 kullanarak veya yerel düzenlemelere uygun olarak.
    Not: Retro-orbital kanama kontrolü lökosit, 1,5 mL EDTA kaplı borular kullanarak elde etmek için gerçekleştirilebilir. Kanama bu yöntem yalnızca kurbandan sonra hemen etkilidir. Ayrıca, Periton boşluğuna lavaj (PCL) denetim makrofajlar, 37 ° C'de soğuk Aglutinasyon perfüzyon engel olabilir kan önlemek için Önceden ısıtılmış PBS kullanarak elde etmek için gerçekleştirilebilir.
  2. Fare kürk karnına liberal % 70 v/v etanol ile püskürtme ve art arda bir doku ile pamuk gazlı bez ile silerek tarafından dezenfekte edin. Künt makas kullanırken, karın cilt tarafından boyuna bir kesi kesmiş.
  3. Plevral boşluğu içine belgili tanımlık kesme göğüs kafesi tüm uzunluğu boyunca uzanan ve kavisli, künt makas kullanarak diyafram bir kesi yaparak ortaya çıkarmak. Göğüs kemiği dikkatlice uzakta kaldırdı kadar kontralateral tarafında benzer bir kesim yapmak.
  4. Kalp ve büyük damarlarının açık bir görünümü ile bir kelebek 23¾ ölçmek için bir 50 mL şırınga bağlı iğne, INSERT kalbin sol odanın içine buz gibi PBS ile dolu.
  5. Iris makas inen aorta zarar vermeden mümkün olduğu kadar büyük bir çıkış oluşturmak için kullanırken kalbin sağ atrium için bir kesik yapın ve sonra yavaşça yaklaşık itmeye şırınga bunalıma girmek PBS 30 mL. Çıktı tıkanmadan akıyor. Karaciğer ve/veya böbrekler takas iyi bir perfüzyon bir göstergesi olarak kullanılabilir.

2. diseksiyon siyatik sinir ve DRG

Not: siyatik sinirleri diseksiyon için cilt yukarıdaki gluteus maximus kaldırılır ve fare ventral yan aşağı alt ekstremite uzanan iken konumlandırılmış.

  1. Çift taraflı bütün siyatik sinir kas dokusu üst dorsal kalça ayırarak incelemek ve sinir omurga takip etmek. Nerede omurga ve hemen diğer ucunda diz üstü çıkar sinir kesti.
    Not: kırma veya Forseps ile çekerek gibi sinir aşırı kullanımı önlemek.
  2. Forseps kullanarak, çıkarılan gangliyonlari, sinir, buz gibi PBS ve buz üzerinde mağaza 1 mL içeren bir 1,5 mL tüp için her yaklaşık 2 cm transfer.
    Not: Sinir gecede buz üzerinde depolanabilir.
    Not: alttaki yumuşak doku derisini nazikçe, göğüs, servikal ve Lomber spinal bölgeleri maruz kalan arka derisini soyma tarafından bir neşter ve forseps kullanarak DRG diseksiyon için bağlantısını kesin. Bir künt makas kullanarak kafatasının, keserek başından kaldırın.
  3. İç organlar ayırma omurga ön tarafına bağlı önce kaburga ve omurga her iki tarafta yakın paralel kesti. Uyluk kesim ve kalça düzeyinde kesilmiş bir enine omurga kaldırmak. Iris makas kullanarak, herhangi bir kas, yağ ve diğer yumuşak dokularda omurga üzerinden sadece... kes gitsin.
  4. Omurga dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve açın, bir ucu makas vertebral kanala saat 3'te kaydırarak Kaudal sonunda başlangıç konumu ve kemik makasladım. Saat 9'konumundaki yordamı yineleyin.
    Not: Tam ortasında DRG zarar görmesini önlemek için kesmek önemlidir.
  5. Yan yana gelen kesme rostral sonuna ulaştı ve omurilik tamamen maruz kadar yineleyin. Diseksiyon mikroskop kullanarak, omurilik omurga içinde DRGs bulmak için kullanılan spinal sinirlerin ortaya çıkarmak için kaldırın.
  6. Lomber DRGs yavaşça DRGs kaldırmak için Iris makasla sinirler ve bağ dokusu kırpma vertebral Kanallar içine DRG çekmeye dorsal kök çekiştirmeye tarafından kaldırın.
    Not: L4-L6 DRG koleksiyonuna kısıtlamak mümkün olan siyatik sinir katkıda bulunuyorlar.
  7. Forseps kullanarak, DRGs buz gibi PBS yaklaşık 1 mL içeren bir 1,5 mL tüp aktarın ve buza depolayın.
    Not: Sinir gecede buz üzerinde depolanabilir.

3. sindirim siyatik sinir ve DRG

  1. 100 µg/mL deoksiribonükleaz ve buz üzerinde mağaza ile takıma sindirim medya (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL collagenase tip 4) hazırlayın.
    Not: 1 mL sindirim orta fare (siyatik sinirleri + DRGs) gerekli miktarıdır. Bir kez hazırlanan, aliquots sindirim medya-ebilmek var olmak stok-20 ° C'de
  2. Siyatik sinir ve DRGs bir fare 500 µL sindirim medya içeren ayrı 1,5 mL tüpler içine aktarın. Siyatik sinirleri için malzeme bahar makas kullanarak 15-20 parçalar halinde doğrayın ve doku süspansiyonlar 37 ° C'de titreyen bir kuluçka nazik ajitasyon (≤ 450 d/d) ile 20 dk için kuluçkaya.
  3. Art arda hücre süspansiyon mekanik olarak eksik olarak sindirilir herhangi bir doku ayırmak için 1.000 µL pipet ucu ile triturate.
    Not: süspansiyon titre zorlanırsanız, pipet ucu künt bir sonu oluşturmak için makasla sonra kesti. Doku süspansiyon için nazik ajitasyon (≤ 450 d/d) ile 20 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  4. 1000 µL pipet ucu ile toz tekrarlayın ve nazik ajitasyon (≤ 450 d/d) ile 37 ° C'de daha bir 10 min için kuluçkaya.
  5. FACS arabellek (PBS % 10 FCS ve 1 mM EDTA ile desteklenmiş) hazırlamak ve buz üzerinde. Durulama ve 60 x 15 mm Petri kabına buzda bir paslanmaz çelik ekran FACS arabelleği ile 140 µm kafes büyüklüğü ile ıslatın.
    Not: naylon ekran filtreleri önemli çekirdekli hücre verim kaybına yol açar gibi kaçınılmalıdır.
  6. Tekrar tekrar buza künt Forseps ile Petri kabına üzerinde tutulur gibi doku süspansiyonlar 140 µm ekran filtreden geçmek. Hücre süspansiyon Petri kabına toplamak ve buz üzerinde depolanan bir yeni 1,5 mL tüp aktarmak.
  7. Filtre üzerinden 1.000 µL pipet ucu ile tekrarlanan toz tarafından kalan herhangi bir eksik olarak sindirilir doku itin. Ekran filtresiyle iki kez 500 µL FACS arabelleği durulama ve Petri kabına adım 3,6 gelen hücre süspansiyon ile birleştirmek için elde edilen hücre süspansiyon toplamak.
    Not: kullanılan Akış Sitometresi enkaz için hassas ise, hücre süspansiyon adım 3.7 70 µm ekran filtre geçirilebilir; Ancak, bu çekirdekli hücre verim kaybına neden olabilir.
  8. Hücre süspansiyonlar, 300 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve hücre Pelet FACS arabellek 1 mL resuspend. Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.
  9. Hücre Pelet gerekli (150 µL FACS başına arabellek boyama Masası) olan 150-350 µL FACS arabelleği, boyama bağlı olarak resuspend.

4. boyama siyatik sinir ve DRG Fluorescently etiketli antikorlar ile Akış Sitometresi için

  1. Siyatik sinir veya DRG hücre süspansiyon 100 µL buzda bir V-şekilli bir 96-şey tabak içinde de içine aktarın.
    Not: Tek lekeli hücreleri gibi onlar-ecek sağlamak gerekli kontrolleri ile ilgili photomultiplier tüp (PMT) gerilim kazançları ve tazminat, de Akış Sitometresi üzerinden belirli ayırt etmeye yardımcı olması için oluşturmak için kullanılan tüm antikorlar için gereklidir non-spesifik bağlama. Sınırlı malzeme siyatik sinir ve DRGs mevcut nedeniyle, lökosit kan ve makrofajlar PCL (Adım 1.1-1.2)--dan-ebilmek var olmak kullanılmış tek lekeli denetimleri boyama hangi-meli var olmak kılınmak siyatik boyama ile paralel için sinir ve DRGs.
  2. Kalan havuzu süspansiyonlar (yaklaşık 50 µL örnek başına) siyatik sinir veya DRG örnekleri, bir günahı denetimi olarak hizmet etmek veya hücreleri.
  3. 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant plaka üzerinde bir depo gözü ters çevirme ve bilek keskin bir fiske uygulayarak atın ve kağıt havlu üzerine kuru hafifçe dokunun.
  4. Yüzey boyama, her hücre pellet FACS arabellek faiz (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 ve MHC sınıf II-Biotin) antikorları içeren 20 µL içinde resuspend ve kuluçkaya, ışık, buz 30 dk için korunuyorsunuz.
    Not: (1 en iyi antikor seyreltme üreticinin ürün bilgilerine göre seyreltme serisi gerçekleştirerek kullanmadan önce kararlı olmalıdır; (2) spesifik olmayan stainings üreticinin yönergelerine göre bu adımda, Fc-bloklu kuluçka tarafından azaltılabilir; ve (3) izotip kontrol stainings genellikle birincil antikorlar doğrudan bir fluorophore ile ve/veya ilgi antigen(s) ayrı nüfus üretmek zaman Birleşik kullanırken gerekli değil.
  5. Her şey için 130 µL FACS arabelleği ekleyin ve 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant gibi daha önce açıklanan (Adım 4.3) ve hücre topakları 150 µL FACS arabelleği ile iki kez yıkayın atın.
    Not: çekimsiz bir birincil antikor veya biotin için Birleşik bir birincil antikor kullanıyorsanız, o zaman bir fluorophore için Birleşik bir uygun ikincil reaktif bu noktada eklenebilir ve adımlar 4.4-4.5 yinelenir. Bu protokol söz konusu olduğunda, MHC sınıf II CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 ile birlikte veya CD68-APC ve F4/80-PE/Cy7, birlikte sırasıyla algılama streptavidin-PE/Cy7 veya Streptavidin-PerCP kullanıldı.
  6. Son yıkama adım sonra fiksasyon için PBS (pH 7,4) %4 paraformaldehyde 100 µL hücre granül resuspend. Plaka 10 min için buz üzerinde kuluçkaya ve vasıl 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Yukarıda açıklanan (adım olarak 4.3) süpernatant atın ve hücre topakları bir kez 150 µL FACS arabelleği ile yıkayın.
    Dikkat: Paraformaldehyde toksik; eldiven ve gözlük, vbgibi uygun koruma giymek.
    Not: hücre topakları 150 µL FACS arabellek ve iki güne kadar 4 ° C'de ışık korunuyorsunuz mağaza içinde Resuspend. Hiçbir hücre içi boyama gerekiyorsa, 4.11 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka centrifuging sonra tutamaçlarından
  7. Hücre içi boyama için hücre topakları FACS buffer+0.5% deterjan 150 µL içinde resuspend ve 15 dakika santrifüj 400 x g de plaka 4 ° C'de 5 dakika süreyle ışık korunuyorsunuz oda sıcaklığında kuluçkaya Yukarıda açıklanan (adım olarak 4.3) süpernatant atın ve hücre Pelet kez 150 µL FACS arabellek + %0.5 deterjan ile yıkayın. Hücre Pelet FACS buffer+0.5% deterjan faiz (CD68-APC, CD206-PE) antikorları içeren 20 µL içinde resuspend ve kuluçkaya, ışık, oda sıcaklığında 30 dakika korunuyorsunuz.
  8. Her şey için 130 µL FACS buffer+0.5% deterjan ekleyin ve 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant gibi daha önce açıklanan (Adım 4.3) ve hücre topakları iki kez 150 µL FACS arabellek + %0.5 deterjan ile yıkayın atın.
    Not: bir çekimsiz birincil antikor veya biotin için Birleşik bir birincil antikor kullanıyorsanız, o zaman bir fluorophore için Birleşik bir uygun ikincil reaktif bu noktada eklenebilir ve adımları 4,9-4,10 tekrarladı.
  9. Hücre topakları ışığa, iki güne kadar 4 ° C'de korunuyorsunuz 150 µL FACS arabellek + %0.5 deterjan ve mağaza, resuspend.
  10. Hücre topakları 150 µL FACS tampon + 5 µg/mL ile DAPI takıma % 0.5 deterjan ile resuspend ve oda sıcaklığında ışıktan korunan 5 min için kuluçkaya. 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Daha önce açıklandığı gibi süpernatant (Adım 4.3) atmak.
  11. Hücre topakları 150 µL PBS ve uygun şekilde etiketli bir FACs tüp transfer resuspend. Analiz için hazır kadar gelen ışık, korumalı oda sıcaklığında saklayın.
    Not: DAPI sinyal kaybına yol açan DNA, yavaş yavaş ayırmak bu yana PBS içinde resuspension sonra hücreleri saat içinde analiz edilmelidir.

5. Kurulum Akış Sitometresi ve çalışan örnekleri

  1. Akış Sitometresi uygun lazerler ile donatılmıştır ve/veya filtre hücreleri leke için kullanılan fluorophores ölçmek için ayarlar olduğunu emin olun. Bu varsayılan sitometresi yapılandırma sistemi altında belirlenebilir. Bu iletişim kuralı durumunda hücreleri üç lazerler ile donatılmış bir Akış Sitometresi kullanarak analiz edildi (405 nm, 488 nm ve 633 nm) ≤ tespiti için 5 fluorophores izin verme.
  2. Uygun kanallar fluorophores ilgi algılanması için seçin. Tüm floresan sinyallerini en iyi Logaritmik güçlendirme ile tespit edilir.
  3. Örnekleri için bir uygun akış hızı seçin. Bu parametre kullanılan sistem bağlı olarak değişebilir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Bu iletişim kuralı olması durumunda, MED-HI (35-60 µL/dak) bir Debi iğne tıkanmasını önlemek için kullanıldı.
  4. Örnek tahsil edilecek olaylar/hücre toplam sayısını seçin. Olayları en az sayıda 1.000.000 olmalıdır.
  5. Scatter araziler altında SSC-a karşı genel bir çalışma sayfası oluşturmak FSC-A, FCS-A. karşı ilgi her fluorophore için de Olaylar ve seçili fluorophores için ortalama floresan yoğunluğu (MFI) sayısını görüntüler istatistik bir görünüm oluşturun.
  6. En küçük hücre alt sol yüzde 10'u dağılım çizim uygun voltaj FSC-BIR ve SSC kanal ayarlayın. Arka plan Floresans ve en az örnek Floresans siyatik sinir veya üst (P1) kapısı dağılım dayalı karar vermek DRGs. günahı denetimlerinden salt DAPI gelen arsa belirleme denetimleri boyama.
    Not: Bu bir koleksiyon kapı nedeniyle kısmen, PNS DAPI + kalabalıkta türdeş olmayan doğası değil.
  7. FSC dağılım kullanarak her fluorophores ilgi için arsalar, böylece günahı kontrol hücreleri içinde onların anılan sıraya göre dağılım parsel çeyrek daha düşük voltaj ayarlayın. Gates bu durumda, her ilgili işaretleri/fluorophores için pozitif hücreleri tanımlamak için bu bölge üzerinde oluşturulur. Bir kapı yerleşimini tek lekeli denetim (Adım 4.1) çalıştırarak doğrulanır.
    Not: emisyon spectra örtüşen için tazminat bu noktada gerçekleştirilen veya uygun analiz yazılımı ile geriye dönük olarak uygulanır.
  8. Akış Sitometresi, açıklandığı gibi henüz belirlenmedi sonra örnekleri çalıştırabilirsiniz.
  9. Koşmak sonra kalan örnek malzeme atılır ve FCS dosyaları daha ayrıntılı bir çözümleme için verilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre süspansiyonlar tam uzunlukta siyatik sinirleri ve tüm büyük DRG hazırlanan, protokole göre altı sağlıklı C57BL/6 fare ve boyama için üç eşit aliquots ayrıldı. DNA lekeleri, DAPI ile boyama sayaç için bir tek hücre nüfus (şekil 1A-B, üst paneli) algılama sağlar. Akış Sitometresi göre analiz önce DAPI dışarı yıkama bir ölçüde ayrı nüfus seçimi için tek parçalanmayabilir olaylar veya gömlek FSC-eksen üzerinde sağlar sigara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siyatik sinir lipidler, kolesterol, miyelin aksonlar çevresinde içeriği nedeniyle gibi büyük bir oranda içerir. Bu yana sıcaklık ile lipidler özelliklerini değiştirmek, farklı sonuçlar farklı sıcaklıklarda alınabilir. Hücre koruma sağlamak için tüm merdiven içinde bu protokolü sindirim sonra buz üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tutarlılık sonuçları tekrarlanabilirlik iyiliği için tavsiye edilir iken, 3,6 ve 3,7 oda sıcaklığında adımları uygulayarak verim artışı mümkün olabilir. Adımda 3.8 sinirler yeterince sindirmek değil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışmada açısından hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; tarafından desteklenen SFB1118). Yazarlar Axel Erhardt diseksiyon çoğunu gerçekleştirmek ve yardımsever bu bilgi verici ve Dr Volker Eckstein Akış Sitometresi teknik açıdan yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL / 6 FareCharles NehriC57BL / 6NCrl
DMEM (+1g / L glikoz, Glutamin, Piruvat)Termo31885023Bu malzemenin kaynağı önemli değildir
HEPESSigma-AldrichH3375
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-AldrichA2153
Kollajenaz Tip 4Worthington Biochemical Corp., ABD
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz (DNaz) ISigma-AldrichDN25-1g
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Fetal Buzağı Serumu (FCS), ısıyla inaktive edilmişSigma-AldrichF4135
CD11b-PerCP/Cy5.5'e karşı antikorBiolegend101228Klonu M1/70
MHC sınıf II'ye karşı antikor, biyotinile Biolegend107603Clone M5/114.15.2
CD45-A647'ye karşı antikorBiolegend107603Clone 30-F11
CD68-APC'ye karşı antikorBiolegend137007Clone FA/11
CD206-PE'ye karşıantikor Biolegend141706Clone C068C2
F4/80-PE/Cy7 Biolegend'akarşı antikor123113Klon BM8
Streptavidin-PE/Cy7Biolegend405206CD45-A647 ve CDllb-PerCP/Cy5.5 ile MHCII-biotini tespit etmek için kullanılır
Streptavidin-PerCPBiolegend405213CD68-APC ve F4/80-PE/Cy7 ile MHCII-biotini tespit etmek için kullanılır
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
DAPISigma-AldrichD9542-1MGPBS'de 50x'e seyreltin ve 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C
Hücre ayrışma eleği - doku öğütücü kitiSigma-AldrichCD1
V-Şekilli, 96 oyuklu plakalarGreiner/SigmaM8185
5ml polistrine yuvarlak tabanlı tüp, 12x75mmBD Biosciences352008
60x15mm petri kabıGreiner/SigmaZ643084
BD LSR II Akış SitometresiBD Biosciences
LS004188

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
  2. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
  3. Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
  4. Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
  5. Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
  6. Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
  7. Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
  8. Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
  9. Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
  10. Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
  11. Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
  12. Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262(2016).
  13. Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Siyatik Sinirmm n H cre AnaliziTek H cre AnaliziH cre zolasyonuDoku SindirimiCD45 EkspresyonuL kosit nfiltrasyonuPeriferik Sinir Sistemi

İlgili makaleler