Biz desenleri farklı beyin bölgelerindeki boyama karakteristik Laminer ve alansal çinko ortaya çıkarır bir histochemical açıklayınız. Çinko boyama desen birlikte diğer anatomik işaretleri ile güvenilir bir şekilde katmanları ve gelişmekte olan ve yetişkin beyin bölgeleri ayırmak için kullanılan.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farklı bölge ve lamina gelişmekte olan ve yetişkin beyninin ortaya çıkarmak için sinaptik çinko Histochemistry kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
Anatomik ve fonksiyonel beyin organizasyon ve geliştirme karakterizasyonu farklı sinir devreleri ve olgunlaşmamış ve yetişkin beyin bölgelerinde doğru tanımlaması gerekir. Burada biz boyama desenleri farklı katmanları ve beyin bölgeleri arasında farklılıklar gösteren bir çinko histochemical boyama açıklayınız. Diğerleri bu yordam sadece çinko içeren nöronlar ve beyin devrelerinde ortaya çıkarmak için aynı zamanda başarılı bir şekilde gelişmekte olan ve yetişkin beyninin çeşitli türlerin alansal ve laminer sınırları betimlemek için kullanılan. Burada biz bu yordamı gelişmekte olan görüntüleri ile boyama göstermek ve yetişkin yaban gelinciği beyin. Biz alanları ve Katmanlar anatomik bir işareti olarak hizmet veren bir çinko boyama desen açığa vurmak ve güvenilir bir şekilde gelişmekte olan ve yetişkin görsel korteksin görsel kortikal alanlarda ayırt etmek için kullanılabilir. Ana amacı, bu protokol katmanları ve nerede bunu yapmak için diğer yöntemleri başarısız gelişmekte olan ve yetişkin beyin bölgelerinde doğru tanımlaması sağlar histochemical bir yöntem sunmaktır. İkincil olarak, densitometric görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem bir geliştirme boyunca olası değişiklikler ortaya çıkarmak için sinaptik çinko dağılımını değerlendirmek izin verir. Bu iletişim kuralı reaktifler, araçları ve gittikçe donmuş beyin bölümleri leke için gereken adımları ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Her ne kadar bu iletişim kuralı gelincik beyin dokusu kullanılarak açıklanmıştır, kolayca kemirgenler, kedi ya da maymunlar de diğer beyin bölgeleri olduğu gibi kullanmak için adapte edilebilir.
Giriş
Histolojik lekeleri architectonic şekil farklılıkları ortaya tarafından çeşitli türler kortikal alanlarda tanımlaması yardım geleneksel olarak kullanılmıştır. Onlar yetişkin beyninin benzer alan sınırları ortaya gibi gibi histochemical teknikleri kombine kullanımı Nisl madde, sitokrom oksidaz (CO) reaktivite veya miyelin verimli kanıtlayabilirim. Ancak, bu histochemical lekeler her zaman yeterince kortikal alanlarda ve immatür beyinde katmanlar arasında net sınırlar ortaya çıkarmak değil.
Merkezi sinir sistemi çinko DNA yapısı, çok sayıda düzenleyici fonksiyonları katılan ve varlığını sinaptik veziküller ile Nöromodülatör olarak davranan bir enzim kofaktör olarak hareket sabitleme dahil çeşitli kritik işlevlere sahiptir. 1. sinaptik çinko gibi protein bağlı çinko görüntülenmeyecektir2olamaz, ancak bu histolojik yöntemlerle görüntülenmeyecektir benzersizdir. Bu özellik sinaptik çinko desen farklı kortikal bölgelerde ortaya çıkarmak için istismar ve sinaptik çinko histochemistry çalışmalar bir dizi olarak kullanılmıştır. Bir alt glutamatergic nöronların serebral korteks içinde onların akson terminalleri3,4presynaptic veziküller içinde çinko içerir. Histochemical çalışmalar sinaptik çinko serebral korteks5,6,7heterojen bir dağıtım indirdik. Farklı bir alan ve laminer dağıtım farklı kortikal bölgelerde (örneğin, karşı somatosensor korteks görsel) veya katmanları histochemically reaktif çinko gibi görünüyor (örneğin, supragranular çinko düzeyleri ve Primer görsel korteks katmanların infragranular önemli ölçüde thalamocortical giriş katmanında IV nispeten düşük sinaptik çinko düzeyleri daha yüksek)5,8,9. Alansal ve laminer kimlik kolaylaştırır gibi korteks gözlenen sinaptik çinko boyama içinde heterojenite özellikle avantajlıdır.
Burada ayrıntılı bir açıklama Danscher'ın 1982 yöntemi10değiştirilmiş bir sürümü bir sinaptik çinko histochemical yordam mevcut. Bu yöntem intraperitoneally enjekte selenit (IP) hayvana şelat bir ajan olarak kullanır. Selenit glutamatergic sinapslar kümesini veziküller içinde beyinde bulunan ücretsiz çinko havuzlu tepki beyin gitmektedir. Bu reaksiyon daha sonra gümüş geliştirme2,10,11tarafından geliştirilmiş bir çökelti verir.
Bu yordamı sinaptik çinko boyama Laminer ve alansal desenler ortaya koymaktadır; densitometric analiz bu desenler duyusal, çevre, farmakolojik veya genetik manipülasyon gibi diğer müdahaleler etkilerini incelemek için yetişkin ve olgunlaşmamış beyinde hem nitelik hem de nicelik değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bir de diğer modeli sistemlerinde olası gelişimsel değişiklikleri diğer kortikal veya subcortical yapılarda sinaptik çinko dağılımında değerlendirmek isteyebilirsiniz. Bu yöntemde densitometric çözümlemesi sağlayan nicel bilgi zaman içinde aşağıdaki beyin gelişimi için yararlı olabilir. Bu iletişim kuralı Laminer ve alansal sınırlarını ortaya çıkarmak için bir arkadaşı diğer immün ve histochemical işaretleri sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki iletişim kuralı tüm uygun devlet ve federal yönergelere uygun kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), City College of New York, tarafından kurulan hayvan bakımı kuralları izler. Anestezi yaban gelinciği için uygundur ve okudu türler göre değiştirilmemelidir.
Resim 1: Bu Protokolü 3 aşamada önemli adımları özetleyen akış çizelgesi ve her adımı tamamlamak için gereken süre. Tüm diğer adımları beyaz metin çevrelerde ise tamamen kurumasını bölümleri gerektiren dönemler yeşil metin çevrelerde gösterilir. Kırmızı dikdörtgen kritik bir adımdır ve ekstra bakım ile gerçekleştirilmesi gereken bir karar noktası, yeşil elmas şeklindeki metin kutusudur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
1. hazırlık adımları (slayt hastanesinden geçici görevle geldiğinizi ve çözüm yapma)
- sıcak suda unsubbed slaytlar arasında olan bir deterjan ile yıkayın ve iyice birisi kir ya da enkaz kaldırmak için distile su durulama ile takip sıcak suda durulayın birkaç kez. Slaytlar, oda sıcaklığında veya 37 fırında kuru izin ° C. Slaytlar tamamen kuru bir kez
- Katman Sarısız ince bir hatta kat parmak ya da bir fırça kullanarak her bir slayt üzerinde. 20-30 dk 60 ° C fırında kuru olanak sağlar. En iyi sonuçlar için ve bölümleri kapalı kaymasını önlemek için yumurta akı ikinci bir kat eklemek ve bir kez daha 60 fırında kuru izin ° C.
- % 1 jelatin çözüm 1 gram jelatin sıcak su (60 ° C) 100 ml çözülerek hazırlamak ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- 200 mL geliştirici çözüm bölüm 4 kullanmak için aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- 40 g artışlarla için 120 mL sıcak su (daha kolay bu şekilde çözülür) yavaş yavaş ekleyerek hazırla sakız Arapça çözüm. Çubuk karıştırarak bir cam ile çözüm karıştırmaya devam edin. Bir kez belgili tanımlık eriyik tamamen çözülmüş, ateşten alın ve birkaç dakika için serin, daha sonra gazlı bez bir huni içinde 6-8 katmanı üzerinden filtre izin. 20 mL dH 2 içinde O 5,04 g sitrik asit artı 4.7 g sodyum sitrat ekleyip karışımı eriterek
- hazırla sitrat arabellek. Bu çözüm pH 4.0 25 olması ° C. ayarlama pH çözüm sodyum hidroksit veya hidroklorik asit ekleyerek gerekirse.
- Hazırlamak Hidrokinon çözüm 30 mL dH 2 O Isıtma ve Hidrokinon 1,7 g eriterek.
Not: Hidrokinon çözüm kadar Isıtma Hidrokinon kolayca oda sıcaklığında suda eriyen değil gibi kolayca suda erimesi izin vermek için önemlidir. 60 ° C'den suyun sıcaklığı tutmak dikkatli olun, aksi takdirde Hidrokinon okside. Çözüm sarı dönüşürse, atmak ve başka bir taze çözüm hazırlayın. - Prepare gümüş laktat 0,22 g dH 2 O. 30 mL içinde eriterek tarafından çözüm
- Mix Çözümleri (1.4.1 - 1.4.4) sırayla hangi onlar hazır olduğunda reaksiyonlar (kesit, kurutma ve sabitleme sonra Yani,) gerçekleştirmek açıklanmıştır ( Şekil 2). Gümüş laktat çözüm sonunda ekleyin. Bu adım hızlı bir şekilde tamamlanır ve gümüş laktat ışığa duyarlı olduğu gibi bölümleri tepki zamanı gelenekadar geliştirici çözüm karanlıkta yerleştirilir emin olun.
Şekil 2: katılan adımlar dizisini gösteren şematik protokol çinko histochemistry aşamasında reaktifleri karıştırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
2. hayvan tedavi ve anestezi
- hayvan, sedatif önce 10 mg sodyum selenit 1 mL dH 2 O. eriterek tarafından bir % 1 sodyum selenit (Na 2 SeO 3) çözüm hazırlamak
- Anestezi ketamin (25 mg/kg) ve xylazine (2 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon hayvanla.
Not: anestezi uygun bir düzeyde pedal refleks yanıt kullanılarak elde edilir olun. - Enjekte çinko şelatör sodyum selenit çözüm (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
Not: Sodyum selenit farklı yaş veya diğer türler toksisite değişebilir. - 60-90 dk sodyum selenit beyne seyahat için izin. Bu dönemde, bu hayvan düzgün yatıştırıcı ve tepkisiz olduğundan emin olun, bu nedenle her 5 dk. anestezi derinliği kontrol için zorunludur
- Hayvan anestezi iken, göz kuruluğu önlemek veya onları nemli tutmak için oftalmik merhem yönetmek için kapalı selenit döneminde emin olmak.
3. Doku hazırlık ve Staining
- aşırı dozda sodyum Fentobarbital (100 mg/kg, IP) yönetmek olarak hayvan ötenazi.
- Gerçekleştirme transcardial perfüzyon normal tuzlu eriyik için 1 dk ile %4 paraformaldehyde 20 dakika süreyle ile son olarak, bir çözüm %4 paraformaldehyde ve % 10 sukroz (Toplam fiksasyon dönemi 1 h) ile yönetmek.
- Bir çift büyük makası kullanarak kafayı.
- Kafatası ortaya çıkarmak için neşterden burun boyun kullanarak bir ensizyon olun.
- Dikkatle beyin kaldırmak ve bir bıçakla hemisferlerin ayrı.
- Beynin arka tarafında engellemek ve birkaç saat için postfix içinde %4 paraformaldehyde 0.1 M fosfat tampon (PB).
- Bloklar 0.1 M PB % 30 Sükroz çözeltilerine içine yerleştirin ve batmaya beyin sağlar.
Not: beyin batmaya 0.1 M PB çözümde % 30 Sükroz ile %4 paraformaldehyde ve % 30 Sükroz çözüm yerine beyin sınırlar ' s maruz paraformaldehyde bu kalite boyama doku etkileyebilir. - Bir kez beyin lavabolar, yarma yarı teğet 40 µm kalınlığında görsel korteksin veya bölge dondurucu, sürgülü microtome veya cryostat ilgi ile. Bu yüzey aşağı ve yavaşça bir cam slayt ile düzleştirme medial ile blok yerleştirerek gerçekleştirilebilir.
- Toplamak bölümleri bir boya fırçası ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içeren bir mücadele kutusu deposunda.
- Ayrı numaralı serisine bölümlere ayırın. Hemen bir mount veya beyin bölümleri Sarısız subbed slaytlarda (Bölüm 1), iki dizi oda sıcaklığında kuru gece kalmak için izin ve işlem bölümleri sinaptik çinko için histochemically.
Not: Karşılaştırma, miyelin 12 veya 13 tarihinde protokolü kullanarak sitokrom oksidaz gibi diğer işaretleri için diğer seri işleme: 2-8 h % 3 sukroz, %0,015 sitokrom C ile 40 ° C'de için kuluçkaya %0,015 katalaz ve 0.1 M PB %0.02 diaminobenzidine. Nisl madde için görsel kortikal alanlarda ayırt histolojik bir marker olarak da kullanılabilir. Bu diğer histolojik lekeler geleneksel jelatin kaplı slaytlar bunun yerine kullanılabilir böylece beyin bölümleri Sarısız subbed slaytlar üzerine monte edilir gerektirmez.
4. Sinaptik çinko Histochemistry
- mutlak alkol 15dk için slayt monte bölümlerde saptamak ve 1 h için oda sıcaklığında tamamen kuruması için izin < lBen > kısa bir süre için 10 bölümleri bırakın s % 1 jelatin çözümde (Bölüm 1) ve oda sıcaklığında kuru gecede izin.
- Çözümleri en kısa zamanda bölümleri tepki hazırız 1.8 adımda anlatıldığı gibi karıştırın.
- Slaytlar bir cam veya plastik tepsi içinde yan yana düzenleme ve gelişmekte olan çözüm slaytlar üzerine dökme tarafından bölümleri tepki. Slaytlar tamamen çözümde batık ve tepsiyi karanlık bir boşluğa aktarmak veya kapak ile ışık geçirmez bir kutu doğrulayın.
Not: yaklaşık 12 inç olan bir plastik tepsi yanında 8 inç genişliğinde uzun kullanılabilir, hangi tam olarak 18 slaytlar uyuyor. Toplam hacmi 200 mL geliştirici çözüm tamamen slaytları daldırın, bu yüzden doğru birim tepki ve buna göre tarifi ayarlamak için slayt sayısı için kullanılmasını sağlamak yeterli olur. Metal bir tepsi kullanarak karşı bir plastik ya da cam tepsi kullanmaktır tavsiye reaktivite geliştirici çözüm gümüş laktat ve demir arasında çapraz bir dereceye veya diğer bulunan metal tepsi metal gibi.
- Slaytlar bir cam veya plastik tepsi içinde yan yana düzenleme ve gelişmekte olan çözüm slaytlar üzerine dökme tarafından bölümleri tepki. Slaytlar tamamen çözümde batık ve tepsiyi karanlık bir boşluğa aktarmak veya kapak ile ışık geçirmez bir kutu doğrulayın.
- Bölümlerde her 30 dk görsel olarak inceleyerek reaksiyon gelişimi izlemek. Bölümleri genellikle 120-180 dk için geliştirme gerektirir..
- Bölümleri (bkz. şekil 3a) overstained olmak Eğer ayırt % 2 çiftçi ' s çözüm (9 parça dH 2 O ve 1 yarı %2 %2 sodyum thiosulfate potasyum Ferricyanide dH 2 O) 1-2 dakika süreyle
Not: şekil 3b ' kötü lekeli örneği bölümüne gösterilir. - İstenen yoğunluk elde sonra slayt kaldırarak reaksiyon sona erdirmek monte bölüm--dan belgili tanımlık tepsi ve slaytları bir slayt raf yerleştirme.
- Çanak boyama büyük bir cam slayt raf yerleştirin ve akan suyun jelatin ceket ve dış gümüş mevduat kaldırmak 10 min için slaytlar sıcak (40-50 ° C) yıkayın.
Not: bölümler kapalı kaymasını önlemek için slayt raf kışkırtmak değil dikkatli olun. Bölüm istenen yoğunluğu zaman yeterli Laminer varyasyon belirgindir ve bölümler yeterince karanlık ama değil aşırı tepki (bakınız şekil 4a) elde edilir. - Oda sıcaklığında kuru ve % 100 kurutmak slayt izin alkol (5 dk), Ksilen (5 dk) ve kapak kayma ile montaj orta içinde açık. Alternatif olarak, slaytları alkol artan bir dizi içinde yer, o zaman kurutmak, açık ve coverslip.
- Hayvanlar bir negatif kontrol hizmet etmek için önceki selenit tedavi olmadan kullanımı bölümleri. Bu bölümler gümüş amplifikasyon verim yok boyama.
Not: en iyi sonuçlar için bölümler kuru gecede için olanak sağlar. Kuru gecede bölümlerine izin verir daha iyi doku boyama.
şekil 3: Boyama Çocuk gelincik beyinde sinaptik çinko. Photomicrographs bölümlerin bir) overstained ve b) Juvenil gelincik beyinde understained yarı teğet çinko lekeli. Alansal sınırları Laminer varyasyon eksik olarak ayırt etmek zordur. Beyaz madde de ağır lekeli. ßy Suprasylvian korteks, WM beyaz önemli, ön, D dorsal. Ölçek çubuğu 500 µm (a-b) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
5. alansal sınırları ayırt etme ve resim alma
- Kullanım architectonic şekil-in farklı beyin bölgelerini alansal ve laminer tanımlama için.
Not: Örneğin, gelişmekte olan sıçan retrosplenial korteks 14 ' te, yazarlar tarafından ağır yetişkin içinde var olmayan ama kortikal açıklamak için yararlanılabilir çinko için boyama ile karakterize bir geçici modülerlik ortaya Bu tür geliştirme sırasında organizasyon. Başka bir çalışma 15, yazarlar özgüllüğü Bu bölünmeler tanımlaması kolaylaştırmak makak maymunu amigdala buldum farklı çekirdekleri sinaptik çinko dağılımında ortaya koydu. Gelişmekte olan ve yetişkin yaban gelinciği beyin görsel kortikal alanlarda yukarıda açıklanan 16 , 17 , 18, architectonic alt yeni korteksimiz içinde olmuştur gri sincap 19 açıklanan vardı. Ayrıca, çinko histochemistry daha önce sıçan somatosensor korteks geliştirmek yetişkin maymun görsel korteksin 8, geliştirilmesi ve yetişkin kedi görsel korteksin 5, alanlarında ayırt etmekte kullanılan 9 , 20 ve yetişkin fare somatosensor korteks 6 , 21. Varsa, lekeli, sitokrom oksidaz (CO) lekeli ve sinaptik çinko yetişkin alansal sınırları onaylamak için beyin bölümleri, lekeli miyelin boyama desende karşılaştırın. Gelincik görsel korteksin sinaptik çinko lekeli yarı teğet bölümlerde, alansal kimlik kolaylaştırmak görsel kortikal alanlarda arasında önemli farklar vardır. Örneğin, alanları 17 ve 18 yetişkin yaban gelinciği, sinaptik çinko boyama katmanları ı-III yüksek ve katman IV neredeyse çinko yoksun iken V. katman VI daha az yoğun, lekeleri ortaya koyuyor. Çinko katman IV veya koyu lekeli Grup alanları 17 ve 18 kontrastlı boyama göze çarpan eksikliği katmanda CO IV bölümleri lekeli buldum. Ancak, bölümleri lekeli katman IV. bölge 17 co tutar ile katmanları III ve V, keskin bir sınır ama katmanı alanı 18 IV yoğunluğu boyama içinde ince bir düşüş karakterizedir ve III daha az ayırt katmanda ile üst sınırı bulundu. - Aydınlık alan mikroskobu ile düşük güç amacı istimal kısımlar inceler (2 X veya 4 X büyütme) ve fotoğraf ilgi alanları.
- Geliştirin kontrast ve parlaklık özelliği görüntü işleme yazılımı kullanarak photomicrographs. Görüntüleri elde için optik yoğunluk ölçümleri herhangi bir şekilde değiştirilmesi değil.
şekil 4: boyama yetişkin yaban gelinciği beyinde sinaptik çinko ayıran farklı görsel kortikal alanlarda. (Bir) sinaptik çinko veya (b) sitokrom oksidaz (CO), yetişkin için bitişik yarı teğet bölümleri photomicrographs lekeli. Oklar alansal sınırları işaretleyin. ßy Suprasylvian korteks, ön, D dorsal. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
6. Dansitometresi (isteğe bağlı)
Not: Densitometric analiz temsilcisi çinko lekeli bölgeler bölümlerde ilgi optik yoğunluk ölçerek beyinde sinaptik çinko dağılımı değerlendirmek için kullanılan. Bu yöntem aynı zamanda sinaptik çinko düzeyleri geliştirme boyunca potansiyel değişiklikleri izlemek için yararlıdır.
- Kullanarak seçili bölümleri, çinko-lekeli rastgele bölgesi faiz Edinsel photomicrographs (450 µm geniş sütun kullanılabilir) uygun genişlikte kortikal sütunlar (tek sıra halinde photomicrographs) seçin. Tüm kortikal katmanlara pial yüzeyinden beyaz madde kapsayan bir bölge kortikal bir sütundur.
- İlgi her bölgedeki birkaç farklı beyin bölümlerden uygun bir örnek sütun sayısını seçin.
- Örnek fotoğraflar temsilcisi sütunların bir görüntü işleme yazılımı transfer.
- Kortikal sütunun tamamını kapsayacak şekilde dikdörtgen seçim aracını kullanın.
- Tersine kontrast görüntü fotoğraf negatif sütun benzer oluşturmak için ters çevir'i aracını kullanın.
Not: Görüntülerin kontrast inversiyon yüksek optik yoğunluk değerleri yüksek sinaptik çinko düzeyleri için ve düşük optik yoğunluk değerleri düşük sinaptik çinko düzeyleri için verim için gerçekleştirilir. Bu şekil 5 ' te görülen benzer arsa profil grafikleri işlemek için daha kolay bir yoldur. - Optik yoğunluk profilleri bu görüntülerden piksel yoğunluklarını bir çizgi boyunca iki boyutlu bir grafik oluşturmak için arsa profili aracını kullanarak üretmek. Bir kez daha
- arsa üzerinde tıklatın ve çizim profil grafik dikey profile dönüştürmek çizim seçeneklerini kullanın profil.
Not: X ekseni temsil uzaklığını satır ve y ekseni boyunca piksel yoğunluğu gösterir. Bu nedenle, her arsa profil değeri sütun genişliği boyunca ortalama gri ölçek değeri her derinlikte yansıtır. - Açık arsa profil değerleri elektronik tablodaki metin dosyaları olarak, normalleştirme ve arsa grafikler (bkz. şekil 5).
Not: Sonuçları varyasyon tarafından farklı tepki süreleri, stainability, hem de diğer doku sonucunda genel boyama yoğunluğu içinde şaşırmış gibi sinaptik çinko göreli yoğunluğunu kantitatif ölçüm karşılaştırma için kullanılması önerilir değişkenleri. - Hesaplamak göreli çinko yoğunluğu verileri düzeltmek için arsa profil değerleri yük vagonu ortalamasını gerçekleştirerek.
Not: Bu, örneğin, birbirini izleyen her 20 ya da 30 piksel sayı ortalaması alınarak gerçekleştirilir (1 piksel = 2.5 µm) derinlik ve her örnek için maksimum yoğunluk için normalize. Bu nedenle, her ortalama arsa profil değeri o derinlikte (gri tonlama değerler aralık 0 ile 255) ortalama gri ölçek değeri yansıtır. Farklı normalleştirme yöntemi ilk edinilmesi beyaz madde (WM) optik yoğunluk değerlerini ilgi alanları temel beyaz madde içeren örnek bölgelerden tarafından kullanılabilir. İdeal olarak, bir ortalaması WM değeri elde etmek için mümkün olduğu kadar hafifçe lekeli birden fazla bölge seçin. Ortalama optik yoğunluk değerleri normalleştirilmiş WM değerler elde etmek için ortalama WM değerlerle sonra ayrılır. - Karar vermek demek optik yoğunluk değerlerini bölgeler ilgi belirli katmanlar halinde nicel karşılaştırmalar için.
Not: Örneğin, katman IV gelincik görsel kortikal alanlarında ortalama en az optik yoğunluk değeri belirlenir ±5 piksel az lekeli bölgeyi kapsayan tarafından. - Hesapla ortalama optik yoğunluk demek en büyük değeri belirlemek için ±5 piksel tarafından en koyu lekeli bölgeyi kapsayan tarafından gelincik görsel kortikal alanlarda supragranular ve infragranular katmanlarda değerler. Optik yoğunluk değerleri anlamına
- emin olun elde edilir üzerinden belirli katmanlar içinde.
Not: Bu katmanlar ters kontrast görüntüler sınırlarını bitişik CO bölüm yanı sıra özgün photomicrographs karşılaştırarak doğrulamak için zorunludur. Bu bir bitişik katmanlarda rahatsız değil garanti.
şekil 5: sinaptik çinko farklı görsel kortikal Laminar dağıtım Yetişkin yaban gelinciği alanlarda. Normalleştirilmiş optik yoğunluk profillerin bir yetişkin ile tüm kortikal katmanı üzerinden sütunların temsilcisi photomicrographs. Yetişkin alanları 17 ve 18 IV tabakası dansitesi düşük sinaptik çinko profil arsa yalak simgesiyle gösterilir. Her arsa profilinde yalak katman IV dolu oval ortalama en az piksel yoğunluk değeri belirlemek için kullanılan değerleri gösterir. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sinaptik çinko için beyin bölümleri leke için bu iletişim kurallarını katılan büyük adımlar akış çizelgesi şekil 1' deki sunulur. Protokol üç döneme ayrılabilir: 1) perfüzyon ve doku koleksiyonu, 2) doku hazırlık ve boyama ve 3) çinko histochemistry. Kısaca, Protokolü'nün ilk aşamasında, hayvan anestezi ve IP sodyum selenit uygun dozu ile enjekte edilir. Bir yeterli süre sonra (ideal olarak 60-90 dk), hayvan daha sonra % 0,9 NaCl çözüm %4 paraformaldehyde çöz...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çalışmada sayede sinaptik çinko yerelleştirme tespit olabilir ve beyinde görüntülendi Danscher (1982) yöntemi10, değiştirilmiş bir sürümü dayalı bir histochemical tekniği istihdam. Bu yöntem aslında hayvan (15 mg/kg) çinko şelatör sodyum selenit (Na2SeO3) ile enjekte edilerek çalışır. Enjeksiyon, selenit beyne yayılıyor ve çinko içeren nöronlar presynaptic veziküller için yerelleştirilmiş ücretsiz çinko bağlar. Çinko iyonları sinaptik veziküller Çökelti içindeki moleküller il...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser araştırma kaynakları (2G12RR03060-26A1); hibe Milli Merkezi tarafından desteklenmiştir Azınlık sağlık ve sağlık eşitsizliklerin (8G12MD007603-27) ulusal sağlık Enstitüleri üzerinden Ulusal Enstitüsü; Profesyonel personel Kongre-City University of New York (PSC-CUNY); ve öğretim araştırma hibe (FRG II) Amerikan Üniversitesi Şarja. Biz Vidyasagar Sriramoju bize bu yöntemlere tanıtmak için teşekkür ederim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ötesol (Ötenazi çözeltisi) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodyum selenit | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamin (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg / ml enjektabl |
| Ksilazin (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg / ml enjektabl |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | F8775 | Seyreltik %4 |
| sakız arap | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Sitrik asit | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodyum sitrat | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hidrokinon | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Gümüş laktat | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Balık jelatini | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sitokrom c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Tip III, at kalbinden) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sükroz | Domino | ||
| Ksilen Fisher Scientific | X5P-1GAL | ||
| Permount Fisher | Scientific | SP15-500 | |
| 100 Etanol | Fisher Scientific | A406-20 | Slayt montajından önce dehidrasyon için kullanılır |
| Lameller | Beyin Araştırma Laboratuvarları | # 3660-1 | |
| Buzlu alt yataksız slaytlar | Beyin Araştırma Laboratuvarları | # 3875-FR | |
| Mikrotom | Amerikan Optik Şirketi | 860 | |
| Mikroskop | Olympus | BX-60 | |
| Photoshop | Adobe Sistemlerini Kabul Edin, San Jose, CA | Görüntüleri birleştirmek için | |
| ImageJ | Free yazılımı şu adresten indirilebilir: http://rsb.info.nih.gov/ij/ | Densometrik ölçümler için | |
| Plastik tepsi | Slaytları geliştirici çözeltisine daldırmak için | herhangi bir standart plastik tepsi kullanılabilir | |
| Sıcak plaka | Herhangi bir standart ocak gözü kullanılabilir |
Kaynaklar
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
