Yöntem makalesi

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

DOI:

10.3791/56553

⸱

28 Mart 2018

 , 
1Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University, 2Neuroscience Laboratories, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Axon dallanma ve synapse oluşumu kesin nöronal devreler kurmak için çok önemli işlemler vardır. Geliştirme sırasında duyusal thalamocortical (TC) aksonlar serebral korteksin belirli katmanlar halinde şube ve sinapslarda oluştururlar. Axon dallanma ve synapse oluşumu arasında bariz uzamsal ilişki rağmen aralarındaki nedensel ilişki kötü anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için son zamanlarda bireysel TC aksonlar organotypic cocultures içinde dallanma ve synapse oluşumu aynı anda görüntüleme için bir yöntem geliştirdi.

Bu iletişim kuralı bir organotypic coculture ve elektroporasyon birleşimini içerir bir yöntemini açıklar. Organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks gen manipülasyon ve gözlem Laminer yapılandırması gibi karakteristik yapıları koruyarak aksonal süreçlerin kolaylaştırmak. DsRed ve EGFP etiketli synaptophysin (SYP-EGFP) kodlama iki ayrı plazmid talamik nöronların az sayıda bir adım tekniği ile birlikte transfected. Bu yöntem TC nöronların bireysel aksonal türleri morfoloji ve presynaptic siteleri aynı anda görselleştirmek izin verdi. Yöntemi Ayrıca axon dallanma ve synapse oluşumu arasındaki nedensel ilişkiyi ortaya uzun vadeli gözlem etkin.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thalamocortical (TC) projeksiyon memeli beyinde axon rehberlik ve mekanizmaları hedefleme araştırmak için uygun bir sistemdir. Geliştirme sırasında duyusal TC aksonlar kortikal plaka ve formu şube ve sinapslarda tercihen içinde katman IV serebral korteks1,2birincil duyusal alanda büyümek. Temel bağlantılar kurulması sonra bile, aksonlar arbors ve sinaptik terminalleri çevresel değişiklikler3,4bağlı olarak yenilenmiş. Ancak, nasıl TC axon Morfoloji dinamik olarak değiştirilmez kötü anlaşılmaktadır. Bir tek hücre düzeyinde yapısal değişiklikleri gözlemlemek için yeterli bir teknik eksikliği ana nedenlerinden biri. Mikroskobu, İki fotonlu mikroskobu gibi son gelişmeler yaşayan kortikal nöronlar vivo içindedoğrudan gözlem izin vermiş, ancak genel TC yörüngeleri5, yakalamak için hala teknik sınırlamalar vardır 6. bu nedenle, vitro yöntemleri TC aksonlar canlı görüntüleme için axon dallanma ve synapse oluşumu yapısal analiz için güçlü araçlar sağlamak.

Bizim grup ilk kez bir statik dilim kültür yöntemi geçirgen membran7ile kurulmuş. Bu yöntemi kullanarak, bir sıçan kortikal dilim bir duyusal talamik blok ile cocultured ve lamina özgü TC bağlantıları bu organotypic cocultures7,8' recapitulated. Seyrek bir floresan protein ile etiketleme daha fazla TC axon büyüme ve dal oluşumu9,10,11gözlemlemek için bize izin. Son zamanlarda, dallanma, aynı anda görüntüleme için yeni bir yöntem geliştirdik ve bireysel TC aksonlar organotypic sinaps oluşumu12cocultures. TC akson ve presynaptic siteleri aynı anda görmek için DsRed ve EGFP etiketli synaptophysin (SYP-EGFP) talamik nöronların az sayıda organotypic coculture elektroporasyon tarafından ortak transfected. Geçerli yöntem TC aksonlar morfolojik analizi kolaylaştırır ve akson dallanma ve synapse oluşumu arasındaki nedensel ilişkiyi göstermek için kullanılan uzun vadeli gözlem için sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osaka Üniversitesi ve Japonya Nörobilim Derneği hayvan refahı komiteleri tarafından kurulan esaslarına göre tüm deneyler yapıldı.

1. Organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks

Not: özgün yayınlar7,8,13ile ilgili ayrıntılı yordamlar için bakın. Tüm yordamları steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor. Sprague-Dawley (SD) fareler nöronal kültürler için kullanılır.

  1. Reaktifler hazırlıkları
    Not: Aşağıdaki reaktifler hacimleri bir sıçan beyin için vardır.
    1. Prepare 10 değiştirilmiş N2 ek x 13: insülin (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hidrokortizon (200 nM), sodyum selenit (300 nM), transferrin (1 mg/mL), putrescine (1 mM), glikoz (60 mg/mL)
    2. Prepare serum içeren kültür orta (10 mL): %85 DMEM/F12, %10 10 x değiştiren N2 ek, % 5 fetal sığır serum (FBS)
    3. Prepare serum serbest kültür orta (20 mL): %90 DMEM/F12, %10 10 x değiştiren N2 ek
    4. Sıçan kuyruğu kollajen çözüm (0.5 mL) hazırlayın. Kısacası, steril koşullar altında bir sıçan kuyruk ihale lifleri al ve Asetik asit çözümde gecede kuluçkaya. Santrifüjü sonra süpernatant (bir kaç mg/mL) toplar ve bir buzdolabı13' te saklarız.
  2. Kültür yemeklerin hazırlanması
    1. Bir membran eklemek bir 35 mm Petri kabına yerleştirin.
    2. Membran için 40-50 μL sıçan kuyruk kollajen çözüm ekleyin ve kollajen çözüm merkezi etrafında yayılmış.
    3. Hava Kuru membran tamamen temiz bir Bank içinde.
    4. 1.5-2 mL serum içeren kültür orta çanağı içine koymak, böylece membran ile orta ıslatılır.
    5. Bir kuluçka (37 ° C, oksijen % 95 hava ve % 5 CO2) kaplama önce kültür çanak yerleştirin.
  3. Kortikal dilimleri hazırlanması
    1. Tüm cerrahi aletler % 70 etanol ile 10 dakika veya daha uzun sterilize.
    2. Doğum sonrası gün (P) 2 üzerinden hızlı bir şekilde tüm beynini incelememize fare (-buz birkaç dakikalığına dalmış) buz gibi anestezi altında.
    3. Yer 100 mm Petri kabına 100 mL soğuk Hanks içeren beynine dengeli tuz solüsyonu.
    4. Pia sorun beyinden iyi Forseps ile kaldırın ve kortikal dilimler (300-400 mikron kalınlık) görsel ve somatosensor korteks mikrocerrahi makasla kesip (ayrıntı için bkz: şekil 1).
      Not: Kortikal dilim kalınlığı yaklaşık Binoküler mikroskop altında Izgaralar ölçeğini tarafından tahmin edilmektedir.
      Not: Alternatif olarak, kortikal dilimleri bir vibratome steril koşullarda yapılabilir.
    5. Birkaç kortikal dilim membran INSERT bir tek kullanımlık plastik pipet ile üzerine aktarın.
    6. Kültür INSERT (Ayrıntılar için bkz:8,13) yangın cilalı Pasteur pipet ile Merkezi yakın dilim konumlarını ayarlamak ve aşırı orta gelen Ekle Kaldır.
      Not: Dilimleri hem gaz hem de orta yeterli miktarda almak için biraz aşağıda dilimleri orta düzeyde ayarlayın. Bu hücre canlılık için çok önemlidir.
    7. Yalnız bir gün önce talamik bir blok alınır ve yanında yerleştirilir için oksijen % 95 hava ve % 5 CO2ve kültür ortamında 37 ° C'de serum içeren kültür orta dilim korumak.
  4. Talamik blokları hazırlanması
    1. Tüm cerrahi aletler % 70 etanol ile 10 dakika veya daha uzun sterilize.
    2. A gebe iri fare (embriyonik gün 15) anestezi içeren Fentobarbital (50 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile anestezi.
    3. Her embriyo rahim boynuzları üzerinden teşrih ve embriyoların bir 100 mm Petri kabına 100 mL soğuk Hanks dengeli tuz çözeltisi içeren yerleştirin.
    4. Binoküler mikroskop altında beyin her embriyo kaldırmak ve mikrocerrahi makas (bkz. şekil 1) kullanarak ventrobasal karmaşık ve yanal geniculate çekirdeği (yaklaşık 0.5 mm x 3)7 esas olarak içeren talamik blok kesme.
  5. Kültür ve organotypic cocultures korumak
    1. Pasteur pipet kullanarak, membran filtre üzerinde yerleştirilen kortikal dilimin ventrikül yüzey yanındaki blok talamik yerleştirin.
    2. Cocultures bir ortamda oksijen % 95 hava ve % 5 CO237 ° C'de serum içeren kültür ortamda korumak.
    3. Serum serbest kültür orta ile orta yarısı kültür iki gün sonra değişimi. Bundan sonra orta 2-3 günde değişimi.
      Not: Hücre hayatta kalmak için önemli olduğu gibi orta düzeyde orta değişiminden sonra kontrol edilmelidir.

2. adım

Tüm yordamları steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.

Not: Elektroporasyon bir gün dekolmanı blokların önlemek için talamik blokları hazırlanması sonra gerçekleştirin.

  1. Plazmid
    1. Plazmid karışımı aşağıdaki gibi yapmak: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      Not: Endotoksin-Alerjik Maxiprep seti kullanarak her iki plazmid arındırmak ve Hanks dengeli tuz solüsyonu içinde çözülür.
  2. Elektroporasyon ekipman kurulumu
    Şekil 2' de gösterildiği gibi bir uyarıcı ve bir izolatör gibi elektrikli aletleri bağlanması gerekir.
    1. Uyarıcı bifazik izolatör bağlayın.
    2. Bir elektrot (gümüş tel 0.2 mm çapında) izolatör negatif terminaline bağlayın.
    3. Bir elektrot (gümüş tel 1 mm çapında) serisi 100 Ω direnç ve izolatör pozitif terminal için bağlayın.
    4. Amplifikatör elektrik akımları ile amplifikatör gerilim ölçerek direnç iletilir olup olmadığını izlemek için osiloskop bağlayın.
  3. Cam Pipetler hazırlanması
    Not: Plazmid çözüm çýkartýlmasýný ve elektrik darbeleri uygulanması için iki tür cam Pipetler kullanılır.
    1. Pipetler cam kılcal bir elektrot çektirme ile üzerinden yapmak.
    2. Fırlatma pipet için belgili tanımlık uç (uç çapı 20-50 mikron olmalıdır) bölünürler.
    3. Eziyet ve ateş-(iç çap 50-200 μm kalınlığında olmalı) parlatma tarafından takip zımpara ile elektrot pipet ucu Lehçe.
      Not: Doğrudan doku dokunuyor gibi elektrot uç düz ve pürüzsüz, olmalıdır.
  4. Elektroporasyon prosedürü
    1. Fırlatma ve elektrot Pipetler için manipülatörler bağlayın.
    2. Gümüş tel (0.2 mm çap) elektrot pipet yerleştirin.
    3. Fırlatma pipet 1 mL şırınga ile bir plastik tüp takın.
    4. Almak yukarıya-> 5 μL plazmid çözüm içine şırınga emme tarafından fırlatma pipet.
    5. Elektroporasyon sahnede coculture koyun ve 1 mm çap elektrot kültür ortamı yerleştirin.
    6. Fırlatma pipet talamik explant yerleştirin.
    7. Talamik blok yüzeyine dokunduğundan sonra şırınga el ile itin.
      Not: Plazmid 0.5 μL hakkında çözüm genellikle bir talamik blok kullanılır.
    8. Elektrot pipet talamik blokta hemen fırlatma pipet retraksiyon sonra yerleştirin.
    9. Elektrik darbeleri (50-400 μA, 3-5 tren 1 ms süre 200 Hz'de 200 kare bakliyat) teslim. Genlik ve trenler osiloskop üzerinde sayısını izler.
      Not: Elektrik akımlarını genlik bir elektrot pipet13iç çap üzerinde bağlıdır.
    10. Elektrot pipet geri çek ve bulaşık kuluçka makinesi için dönün.
  5. Mikroskobik gözlem
    1. EGFP için iki filtre kümesi ile donatılmış bir dik confocal mikroskop mikroskobik bir sahnede kültür çanak koymak (uyarma, 488 nm; emisyon, 515 nm) ve DsRed (uyarma, 514 nm; emisyon, 565 nm).
    2. 10-25 optik bölümleri 1-7 µm-adım boyutlarında bir 20 X uzun çalışma mesafe objektif lens ile fotoğraf çekmek. Hem DsRed hem de SYP-EGFP hızlı tek tek ayırt etiketli aksonlar seçin.
      Not: Yaklaşık 0,7 x 0.7 mm (yani 1024 x 1024 piksele karşılık gelen, 0,68 mikron/piksel) gözlenen alandır.
    3. Esir alma imge her 24 saat için günlük düşsel. Oda sıcaklığında 10 dakika içinde tamamlamak ve kültürler için kuluçka dönün. Kısa-Aralık zaman atlamalı görüntüleme için kültür ortamının % 95 hava ve %5 37 ° C'de CO2 nemlendirilmelidir tutar bir kültür odasında devam et

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneme amaçları TC axon dallanma ve synapse oluşumu arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmak için burada açıklanan. Aynı anda aksonal yörüngeler ve yerleri presynaptic siteleri, tek veya organotypic cocultures bir kaç talamik hücrelerde görselleştirmek için kodlama SYP-EGFP ve DsRed elektroporasyon kullanarak iki Plasmid'ler ile transfected. Kültür ikinci haftasında tek tek ayırt TC aksonlar açıkça DsRed (şekil 3) tarafından etiketli. Sadece DsRed ve SYP-EGFP serg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçerli protokol de TC projeksiyon11dışında aksonlar büyüyen gelişim yönü eğitim için güçlü bir araçtır. Örneğin, kortikal dilim kültür ve elektroporasyon tekniği bir arada bireysel aksonal Morfoloji kortikal nöronlar ve uzun vadeli gözlem9,18görselleştirme sağlar.

Geçerli iletişim kuralını kullanarak, ilginç genler axon dallanma ve sinaps oluşumunda rol de floresan proteinler ve faiz genlerin eş ifade tarafında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrıca Gabriel Hand eleştirel okuma için teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEM / F12GIBCO11320-033
Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)Nissui5905
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo ScientificSH30396-03Hipon
İnsülinSigmaI6634
ProgesteronSigmaP8783
HidrokortizonSigma & nbsp;H0888
Sodyum selenitWako Pure
Kimya Endüstrileri		192-10843
Transferrin ve nbsp;SigmaT1147
Putrescine SigmaP5780
GlikozWako
Saf Kimya Endüstrileri		16806-25
35 mm petri kaplarıFalcon351008
Millicell-CM ek parçaMilliporePICMORG50
100 mm petri kaplarıBIO-BIKI-90-20petri kabı steril
HiPure Plazmid Maxiprep KitiInvitrogen
Tek kullanımlık steril plastik pipetler202-IStransfer pipetleri steril
Cam kılcal: Dış çap 1,2 mmNarishige  G-1.2iç çap, 1.2 mm
Gümüş tel: 0.2 ve 1 mm NilacoAG-401265 (çap, 0,2 mm), AG-401485 (çap, 1,0 mm)
1 mL şırıngaTerumoSS-01T
StimülatörüA.M.P.IMaster 8
Bifazik İzolatör BAK ELEKTRONİKBSI-2
Amplifikatör ve nbsp;A-M SistemleriModel 1800
OsiloskopHitachiVC-6723
ManipülatörNarishigeSM-15
MikromanipülatörNarishigeMO-10
Stereomikroskop OlympusSZ40
Üniversal stand OlympusSZ-STU2
Işık aydınlatma sistemi OlympusLG-PS2, LG-DI, HLL301
Elektrot çektirmesi NarishigePC-10
Konfokal mikroskopNikonDijital tutulma C1 lazer
x20 objektifNikonELWD 20x/0.45
Kültür odasıTokai HitUK A16-U
Sprague-Dawley (SD) sıçanJaponya SLC ve Nihon-Dobutsu
Mikrocerrahi makasıNatsume MB-54-1
K210006 Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
  2. Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
  3. Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).
  5. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
  6. Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
  7. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  8. Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
  9. Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
  10. Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
  11. Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
  12. Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
  13. Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
  14. Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
  15. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
  16. Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
  17. Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
  18. Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
  19. Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Organotipik Kok lt rElektroporasyon Tekni iKonfokal MikroskopiDsRed EtiketlemeSyp EGFP EtiketlemeAksonal MorfolojiN ral Devre Olu umuKortikal Kesit K lt r

İlgili makaleler