Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

8.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56557

⸱

3 Kasım 2017

 , 
1State Key Laboratory of Membrane Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Özet

Hematopoiesis çalışmalar için fare embriyo kullanarak sınırlama operasyonlarında, hangi büyük ölçüde embriyo intrauterin gelişme nedeniyle eklenen rahatsızlık 's. Nakavt (KO) fareler genetik verileri ikna edici rağmen KO fareler tüm genler için gerektiği gibi oluşturmak için gerçekçi değildir. Ayrıca, in vivo gerçekleştirme KO fareler elde edilen verileri birleştirmek için kurtarma deneyler değil uygun. Bu sınırlamalarını aşmak için aort-erbezi-Mesonephros (AGM) explant kültür hematopoetik kök hücre (HSC) geliştirme eğitim için uygun bir sistem olarak geliştirilmiştir. Özellikle kurtarma denemeleri için bu KO farelerde Engelli hematopoiesis kurtarmak için kullanılabilir. Uygun kimyasallar orta ekleyerek, Engelli sinyal yeniden etkinleştirilebilir veya yukarı düzenlenir yolları inhibe olabilir. Bu yöntemin kullanılması, birçok deney HSC gelişiminin kritik düzenleyiciler tanımlamak için gerçekleştirilen, HSC gen ekspresyonu mRNA ve protein düzeyleri, koloni oluşumu yeteneği ve sulandırma kapasitesi ile ilgili. Bu dizi deney memelilerde HSC gelişimi için gerekli temel mekanizmaları tanımlamada yardımcı olabilir.

Giriş

Hematopoetik kök hücre (HSCs) erythroid, myeloid, dahil olmak üzere multilineage potansiyel ve lenfoid hücrelerin yanı sıra kendi kendini yenileme yeteneği sahip doku özgü erişkin kök hücreleri vardır. Erken HSCs hemogenic endotel (HE), bilinen bir popülasyondan özel endotel, endotel dorsal aort1,2 ventral duvar, hematopoetik geçiş (EHT) aracılığıyla ortaya çıkan son çalışmalar göstermiştir ,3,4. Aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölgede embriyonik (E) 10,5 dan E12.5 için fare embriyo oluşan bir kez HSCs fetal karaciğer için genişleme içine göç ve son olarak bir kişinin hayatı boyunca yetişkin hematopoiesis korumak için kemik iliği kolonize 5 , 6. her ne kadar bu uzun yıllar boyunca inceledi, HSC ortaya çıkması ve geliştirme temel mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.

Vitro fertilizasyon ve Zebra balığı embriyo gelişimi, intrauterin fare embriyo gelişimi sırasında embriyogenez kesin hematopoiesis çalışma çok daha rahatsız edici yapar. Belirli KO fareler eksikliği de hudut onların kullanma-hematopoetik araştırma alanındaki her ne kadar genetik deneyler nakavt (KO) fare kullanarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, in vivo kurtarma denemeleri kolayca KO fareler gerçekleştirilemiyor. 1996 yılından bu yana, AGM explant kültür hematopoetik çalışmaları için alan7öncüleri tarafından geliştirilmiştir. Bu kültür sistemi sayesinde, AGM bölge ventral dokuların bir ters etkisi8,9dorsal doku uygulamayın iken HSC etkinlik, tanıtmak için tespit edilmiştir. AGM explant kültür sistemi aynı zamanda Serotonin, Mpl, SCF, BMP ve kirpi HSC geliştirme10,11,12,13, sinyal rolleri belirlemek için uygulanan 14. önemli, bu da mutant embriyo13,15dakika sonra hematopoetik kusurları kurtarmak için kullanılan popüler bir yöntemdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Pekin, Çin için etik Değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış olan.

1. malzeme hazırlık

  1. Sterilize 0.65 µm filtreleriyle ultraviyole ışınları ultraviyole altında üretilen ışın 4 h için temiz bankta lamba ve 2 h işaretinden sonra filtreleri teslim.
    Not: UV ışık ile çalışırken, uygun koruma giymek.
  2. Paslanmaz çelik kafesler 30 ortaçağ halk ozanı için 121 ° C'de otoklav ısıtıcı ile sterilize.
    Not: Paslanmaz çelik kafes belli bir yükseklikten hava-sıvı arabirimindeki filtreler desteklemek için gereklidir ve bu telin üstünde çelik kafes ( şekil 1 A) ile gerçekleştirilebilir.
  3. Seyreltik fluoksetin 10 µM son bir konsantrasyonu uzun vadeli M5300 içine kültür orta ve karışımı eşit.
    Not: altı-şey plaka için 2 mL M5300 uzun vadeli kültür her şey için uygun ortamdır. Hidrokortizon 10 -6 M, seçmeli olarak orta seyreltilmiş.
  4. Altı-şey plakaları veya yemekleri 10 µM fluoksetin ile desteklenmiş orta aktarmak ve sterilize edilmiş paslanmaz çelik kafesler orta koydu.
  5. Cam hücre kültür tabağına sterilizasyon için her zaman iki kez 3 dakika için 0,65 µm filtreleri kaynar su ile yıkayın. Sonra şekil 1 içinde A [şematik gösterildiği gibi ayakta vasıl hava-sıvı arayüzey filtreleri tamponlanmış fosfat tuz koymak her yıkama, (PBS) için 2 ortaçağ halk ozanı ve yer ıslak paslanmaz çelik filtre kafesleri Merkezi].
    Not: kaynar su asepsis elde etmek otoklav ısıtıcı ile oluşturulabilir ve ekipman alınmalıdır otoklav Sterilizatör zamanında dışarı sıcaklık düşüş önlemek için.

2. AGM kültür Explant

  1. dikkatle E10.5 veya E11 embriyo Forseps ile gelen AGM bölgeleri ayırmak.
    1. Hamile fareler gelen rahim diseksiyon makası ile şerit ve embriyoların rahim ayırmak.
    2. Sarısı sac, göbek kordonu ve iç organlar embriyo vücuttan yok etmek.
    3. Dorsal sinir doku ve kas çevre dokular dikkatli bir şekilde çıkarın.
    4. Kesim sitesinde ön ve arka bacaklarda Forseps ile belgili tanımlık doku kapalı ve AGM bölge embriyo vücudundan ayırmak. rakamlar 1 ABC göstermek şematik gösterim ve morfolojisi disseke AGM.
  2. Disseke AGMs filtreleri, hava-sıvı arayüzey ( şekil 1 A) ve kültür olarak 37 ° C'de % 5 CO 2 ayrı ayrı üzerine 2-3 gün boyunca explant.
    Not: Disseke AGM çelik Kafes Tel üzerine yerleştirin ve filtreleri hava-sıvı arayüzey kültür sırasında olduğundan emin olun. AGM yanı sıra sarısı sac ve fetal karaciğer de bu sistem 7 ile kültürlü.

3. İfade analizleri

  1. mRNA düzeyi
    1. 1 mL PBS içine kültürlü AGMs toplamak ve 4 ° c, 310 x g 6 dakika süreyle santrifüj kapasitesi
    2. Süpernatant kaldırdıktan sonra toplam RNA fenol, monophasic çözeltisi ile toplanan AGMs üreticiye göre çıkarılan ' s yönergeleri.
    3. Toplam RNA (2 µg) sonra geriye doğru M-MLV transkriptaz cDNA şablon olarak elde etmek için kullanarak transkripsiyonu. Nicel gerçek zamanlı PCR deneyleri SYBR yeşil ile gerçekleştirilir ve Gapdh iç kontrol kullanılır.
  2. Protein seviyesi
    1. yukarıda 3.1.1. adımda açıklandığı gibi kültürlü AGM toplamak.
    2. Protein hücre lizis arabelleği ile kültürlü AGM üzerinden hazırlamak (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 0,5 NP-40) proteaz inhibitörü ve protein seviyesi daha önce tespit etmek için Batı kurutma için kullanım içeren açıklanan 13.

4. Koloni oluşturan birimler kültür (CFU-C) tahlil

  1. 2-3 gün sonra kültür, 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 4 ° c, 310 x g 6 dakika santrifüj AGM bölgelere toplamak ve 200 µL collagenase (PBS %0,1) 37 ile ayırmak ° C.
    Not: yaklaşık 20 dakika collagenase tek hücre-süspansiyonlar oluşturmak gerekli zamanı geldi. AGM içeren tüp sallayarak her 5 ortaçağ halk ozanı sindirim süreci hızlandırabilir. 200 µL % 0,1 collagenase her AGM için kullanılır ve 200 µL % 10 serum reaksiyonu durdurmak için kullanılır.
  2. Tek hücre-süspansiyonlar Ultra düşük ek 24-şey plakaları M3434 ortamda kültür.
    Not: kirlenmesini önlemek için penisilin-streptomisin çözüm seçerek orta eklenebilir. M3434 orta yapışkan olduğundan, 1.0 cc enjektör iğne olmadan bu hücreleri ve orta karıştırmak için kullanılan.
  3. Sonra 7 - 10 gün kültür 37 ° C % 5 CO 2, koloniler eritrosit, makrofaj, megakaryocyte (CFU-et) birimi--erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monosit (CFU-GM) ve CFU-granülosit, şekillendirme patlama da dahil olmak üzere her tür sayısı ayırt edici morfolojisi dayalı ve ters bir mikroskopla ( Şekil 2 C) attı mı.

5. Vivo Nakli tahlil

explant kültürü,
  1. koloni oluşturan birimler-dalak (CFU-S) tahlil
    1. sonra 2 - 3 gün AGMs toplamak ve 200 µL collagenase (PBS %0,1) 20 ile kuluçka tarafından tek hücre süspansiyonlar hazırlamak min.
    2. Ölümcül ışınlama (röntgen 9 Gy) 8 - 10 - hafta yaşlı erkek C57BL/6 farelerin gerçekleştirmek 4-5 h hücre enjeksiyon önce.
    3. Radyoaktif fare faaliyetini kısıtlamak için bir restrainer koymak.
    4. Kapakların damarın tanıtmak için %75 alkol dolu bir pamuklu çubukla kullanarak kuyruk yok.
    5. Enjekte 0.5 embriyo eşdeğer (ee) veya 1 ee tek hücre-süspansiyonlar AGM, intravenöz radyasyonlu fare kuyruğu damar içine 1.0 cc şırıngayla.
      Not: Hücreleri PBS ile askıya alınır ve alıcı başına 0.5 mL PBS uygun bir birimdir. Bir iğne 25 ölçer veya 26 ölçer boyutunun 1.0 cc şırıngayla enjeksiyon için kullanılır. Hava şırınga tanıttı olabilir. Kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez ile enjeksiyon izi basın.
    6. On bir gün ekimi, ödemeli posta ve alıcı farelerin dalağı Bouin içinde düzeltmek ' 1-2 gün ve başka bir 1-2 gün için % 80 alkol ile yıkama için s çözüm (15 mL doymuş %1.22 Pikrik asit sulu çözüm, 2 mL % 40 metanol ve 1 mL Asetik asit). Dalak görünür kolonilerde macroscopically saymak ve koloniler ee başına sayısını belirleyen.
      ​ Not: Bouin ' s sabitleştirici, giyim uygun koruma.
  2. Uzun vadeli nakli tahlil
    1. sonra 2-3 gün kültür explant, AGMs toplamak ve 20 dakika süreyle 200 µL collagenase (PBS %0,1) ile kuluçka tarafından tek hücre süspansiyonlar hazırlamak
    2. 8 - 10 - hafta yaşlı erkek C57BL/6 fare öldürücü ışınlama (x-ray 9 Gy) 4-5 gönderilen hücre enjeksiyon önce gerçekleştirmek.
    3. Radyoaktif fare faaliyetini kısıtlamak için bir restrainer koymak.
    4. Kapakların damarın tanıtmak için %75 alkol dolu bir pamuklu çubukla kullanarak kuyruk yok.
      5. < lBen > 0.5 embriyo eşdeğer (ee) enjekte veya 1 ee tek hücre-süspansiyonlar intravenöz ışınlanmış bir fare kuyruğu ven içine, AGM 1.0 cc şırıngayla. AGM bir doz 2 × 10 5 kemik iliği hücreleri (CD45.1 arka plan) ile alıcı başına 1 ee adlı enjekte.
      Not: Hava şırınga tanıttı olabilir. Kanamayı durdurmak için antiseptik bir bez ile enjeksiyon izi basın.
    5. Dört ay sonrası nakli, kemik iliği alıcının toplamak ve FACS tarafından sulandırma tahlil için kullanabilirsiniz. Yalnızca alıcıları ile ≥ % 10 chimerism donör elde edilen başarılı sulandırma sergilemek olarak kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Son yayın AGM13' te pro-apoptotik yolu engelleyerek endotel hücre kaynaklı serotonin HSCs yaşama teşvik bildirdi. HSC geliştirme teşvik etkisi serotonin onaylamak için fluoksetin dahil edildi. Bir selektif serotonin re-uptake inhibitörü olarak (SSRI), fluoksetin serotonin yeniden emme periferik dokulara16,17,18etkisizleştirmek için kanıtlanmıştır. AGM kullanarak explant kü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İyi olgun HSCs kemik iliğinde kan sistemi radyasyonlu alıcılarının yeniden doldurabilir bilinmektedir. Bu işlev HSCs farklı olarak, fare embriyo AGM içinde ortaya çıkan HSCs olgunlaşmamış. Doğrudan nakli sonuçlar gösterdi bu tür ben (VE-cad+ CD45- CD41+) ve tip II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs sahip hiçbir sulandırma yeteneği20. AGM explant kültür sistemi, AGM bölgedeki doğmakta olan HSCs yararlanarak alıcıları ekimi tahlil4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çakışan mali ilgi alanlarına sahip.

Teşekkürler

Biz Suwei Gao şekil hazırlık yardım için teşekkür ederim. Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81530004, 31425016) ve Bilim Bakanlığı ve Çin teknoloji (2016YFA0100500) tarafından desteklenmiştir. JL deneyler gerçekleştirilen ve el yazması hazırlanan; Tayback el yazması düzenlenmiş. Her iki yazar okuyun ve son el yazması onayladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Durapore 0.65 ve mikro; m filtrelerMillipore R5BA63787AGM eksplant kültürü
M5300 uzun süreli kültür ortamıKök Hücre Teknolojileri5300AGM eksplant kültürü
Trizol Tiangen5829RNA ekstraksiyonu
M-MLV ters transkriptazPromega90694ters transkripsiyon
SYBR GreenQiagenA6002kantitatif gerçek zamanlı PCR
proteaz inhibitörüRoche55622Protein ekstraksiyonu
kollajenazSigmaC2674AGM dokularının sindirimi
MethoCult GF M3434 ortaKök Hücre Teknolojileri3434CFU-C testi
ultra düşük bağlantı 24 kuyulu plakalarCostar3473CFU-C testi
C57BL / 6 CD45.2 farelerPekin HFK Bioscience Co. LtdCFU-S testi
C57BL / 6 CD45.1 farelerPekin HFK Bioscience Co. LtdUzun süreli transplantasyon
fosfat tamponlu salinLife Technologines8115284AGM Koleksiyonu
Penisilin-Streptomisin çözeltisiHyCloneSV30010AGM eksplant kültürü
anti-CD45.2-PE-CY7eBioscience25-0454-80Uzun süreli transplantasyon
anti-CD45-FITCeBioscience11-0451-81Uzun süreli transplantasyon
UV lambasıPekin jiangmorning yuan biyo-teknoloji co., LTD039-14402Güç: 30W
paslanmaz çelik hasırAS ONE SHANGHAI Corporation2-9817-10 & nbsp;Açıklık çapı: 2,5 mm
hidrokortizonSigmaH0396seçici olarak M5300 ortamına seyreltilmiş
,

Kaynaklar

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784(2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hematopoetik K k H cre Geli imiAGM B lgesi zolasyonuKollajenaz DisosiasyonuKoloni Olu um AnaliziIn Vivo TransplantasyonFluoksetin TakviyesiRunx1 Ekspresyon AnaliziEmbriyonik 11 G n FareleriUltrafiltrasyon K lt r
Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.