Yöntem makalesi

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

DOI:

10.3791/56605

⸱

8 Aralık 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retrovirüs prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) protein retroviral Tümleştirme mekanizmasının okuyan bir model enzimdir. IN diğer Retrovirüsler, PFV inç daha çözünür ve daha deneysel manipülasyon için mükellef karşılaştırılır. Ayrıca, klinik insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) inç inhibitörleri, PFV inç katalitik mekanizması HIV-1 inç inç viral Tamamlayıcı DNA (cDNA) hedef kovalent katılmadan tromboksan benzer olduğunu ima için duyarlıdır Bir işlemde DNA strand transfer aradı. Bu strand transfer reaksiyon nickler hedef DNA tanıtır. Entegrasyon reaksiyon ürünleri analizini benzer şekilde DNA nick nükleaz varlığı ile şaşırmış. Bakteriyel nükleaz rekombinant PFV inç Escherichia coli içinde (E. coli) ifade ile birlikte arındırmak için gösterilmiştir. Burada PFV inç bulaşıcı nükleaz heparin benzeşme Kromatografi tarafından izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Kesirler kolayca nükleaz kirlenme bir supercoiled Plazmid ve özel Jel Elektroforez için tarandı. PFV inç ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose rekombinant PFV inç nükleaz ücretsiz hazırlanması toplu biyokimyasal veya tek molekül analiz entegrasyon için uygun izin için alternatif benzeşim görüntüler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein etkileşimler DNA ile biyokimyasal ve tek molekül çalışmaları son derece saf rekombinant proteinler gerektirir. Enzimler bakterilerden bulaşıcı bu deneyleri sonuçları belirsiz. Bulaşıcı bir nükleaz müstahzarları rekombinant proteinlerin oksijen leş protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ve Escherichia coli (e.coli)1 ' den izole prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) bulundu , 2 , 3.

Retroviral Tümleştirme deneyleri dönüşüm supercoiled DNA çentik ya da doğrusal ürünler için etkinlik4bir ölçüsü olarak güveniyor. Hücresel enfeksiyon sırasında inç bir viral cDNA iki ucu ana bilgisayar Kromatin5' e katıldı. Her iki ucu tepki katılmadan strand transferi olarak adlandırılır. Deneyleri rekombinant IN etkinliği iki DNA reaksiyonlar katılabilir miyim viral cDNA taklit biter bir hedefe DNA'sı uyumlu entegrasyon tepki4,5,6,7,8. Alternatif olarak rekombinant inç bir fizyolojik olarak sigara ilgili yarım sitesini Tümleştirme tepki9,10' tek bir DNA son üye olabilirler. Supercoiled plazmid DNA hedef olduğunda Tümleştirme, uyumlu entegrasyon ürünlerdir DNA doğrusallaştırılmış ve rahat daireler yarım sitesi Tümleştirme ürünlerdir. Bu reaksiyon ürünleri özel Jel Elektroforez1sırasında onların göreceli hareketlilik tarafından tanımlanır. Rekombinant inç bulaşıcı nükleaz varsa, sahte rahat daire veya muhtemelen doğrusallaştırılmış plazmid deneysel sonuçlar kafa karıştırıcı olacak. Viral DNA reaksiyonlar fluorescently kesin nükleaz ürünleri aksine entegrasyon ürünleri tanımlayan olarak etiketlenmiş olabilir. Ancak, içinde büyük ölçüde supercoiled DNA hedefleri iyilik; rahat daireler veya doğrusal DNA bulaşıcı nükleaz tarafından supercoiled plazmid kaybı sonuçları ve veri11yorumlanması çarpık. Böylece bakteriyel nükleaz MÜSTAHZARLARI retroviral kaldırmak için zorunludur.

PFV inç için heparin sepharose bakteriyel nükleaz1' e göre farklı bir ilgi vardır. PFV inç ve nükleaz heparin sepharose üzerinden doğrusal bir degrade elüsyon tarafından ayrılmış. Nükleaz kolayca 280 nm pik ultraviyole (UV) Absorbans veya analitik Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) tarafından algılanmaz. Bunun yerine, nükleaz supercoiled plazmid dönüşüm rahat daire veya doğrusal ürünler için istihdam nükleaz etkinliği tahlil tarafından algılanır. Heparin sepharose Kromatografi takip her kesir nükleaz etkinlik için test edilmiştir. PFV inç ve nükleaz kirletici Mono-Q anyon reçine için ilgi hiçbir fark var. Mono-S katyon reçine için ilgi küçük bir fark vardır. Ancak, Mono-S çözünürlüğe bakteriyel nükleaz ve PFV inç proteinlerin verimli ayrılık izin vermez. Sonuçta, heparin sepharose benzeşme arıtma PFV inç sunar bakteriyel nükleaz en iyi ayrılması ve sınırsız yük hacmi bir avantaja sahiptir.

Nükleaz etkinlik kirletici için test diğer proteinler için adapte olabilir. Faiz protein alternatif benzeşimi özelliklerini PFV inç daha büyük olasılıkla olacak; protein faiz ve nükleaz kirletici özelliklerini bağlama fark ampirik olarak belirlenmelidir. Nükleaz kirlenme tanımlamak için bu yöntem Mono-S katyon veya Mono-Q anyon Satım reçineler de dahil olmak üzere diğer reçineler adapte olabilir. Benzeşme ve iyon değiştirme reçineler enzimler protein birimdeki sınırsız Kromatografi sırasında bulaşıcı üzerinden ilgi rekombinant protein izole etmek için güvenilir bir yöntem sunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PFV neden E. coli ifadede

  1. PFV inç ifade plazmid (10 ng/μL) 1 μL E. coli BL21(DE3) pLysS 20 μL için Ekle (20 μL aliquot piyasada bulunan hücre vardır > 2 x 106 CFU/μg plazmid) 1,5 mL tüp içinde. Hafifçe dokunarak veya tüp flicking finger ile karıştırın. Kuluçkaya on Ice 5 dak.
    1. Isı şok tam olarak 30 42 ˚C s su banyosu ve 2 min için buz hemen dönün.
    2. Süper en uygun oda sıcaklığında suyu catabolite baskı (SOC) medya ile 80 μL ekleyin. 37 ˚C sallayarak dakikada (devir/dakika) 225 devrimler ile 1 h için kuluçkaya.
    3. Bir 100 mm x 15 mm Petri kabına 25 mL Luria suyu (LB) agar içeren tarih karışımı 25 μL plaka (1 L LB agar: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 15 g agar) ve 100 μg/mL Ampisilin (100 mg/mL stok çözelti).
    4. İkinci aynı tabakta dönüştürülmüş hücrelerin kalan 75 μL plaka. Gecede 37 ° C'de aşağı kapakları ile plakalar kuluçkaya
  2. Plakaları almak dönüştürülmüş E. coli. 3 mL LB aşılamak için bir koloni kullanın (1 L LB: 10 g bacto-tryptone, 10 gram NaCl, 5 g maya özü) bir 14-mL yuvarlak alt polipropilen kültür tüp 100 μg/mL Ampisilin ile desteklenmiştir. 225 rpm sallayarak ile 37 ˚C ~ 8 h için kuluçkaya.
    1. Kültür 3 mL 50 mL LB 100 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL kloramfenikol (34 mg/mL stok çözelti) 250 ml Erlenmeyer şişesi ile takıma ekleyin. Gecede 37 ° C'de 225 rpm sallayarak ile Kültür kuluçkaya.
    2. Kültür 53 mL 1 L LB, 100 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL kloramfenikol içinde 4 L Erlenmeyer flask aktarın. 37 ° C'de 225 rpm sallayarak ile kuluçkaya.
    3. 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) kültürünün düzenli olarak. Başlangıçta, kültür OD600 her saat kontrol edin. Kültür istenen OD600ulaştığı gibi her 15 dakikada değil sarmak için kontrol edin. Kültür bir OD600 arasında 0,9 ve 1.0 için büyür. Şişeye bir buz banyosu aktarmak ve kültür sıcaklığını azaltmak için girdap.
  3. 1 mL kültür daha sonraki analizler için 1,5 mL tüp SDS-sayfa analizi denaturing tarafından aktarın.
    1. 14.000 x g oda sıcaklığında, microfuge içinde 1 dk aralıklarla tarafından 1.5 mL tüp hücrelerde cips. Süpernatant atmak. Pelet 150 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) pipetting tarafından resuspend. PBS ile veya olmadan CaCl2 ve MgCl2olabilir.
    2. 2 SDS-sayfa örnek arabellek x 150 μL ekleyin (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 1,2 SDS, % 30 gliserol, % 15 β-mercaptoethanol (βME), %0.0018 bromophenol mavi) ve damlalıklı veya girdap tarafından iyice karıştırın. -20 ° C'de 3 dk. deposu için kaynatın
  4. Bakteri kültürü ekleyin: 0,25 mM izopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M hisse senedi çözüm) ve 50 mikron ZnCl2 (50 mM stok çözelti) son bir konsantrasyon. IPTG üzerinden T7 organizatörü PFV inç gen ifadesi indükler ve ZnCl2 PFV inç Incubate 4 h için 225 rpm'de hemen sallayarak ile Kültür 25 ° C'de bir amino terminal çinko parmak etki alanının doğru katlanır için ek olarak eklendi şişeye bir buz banyosu aktarın. 1 mL kültür SDS-sayfa analizi 1.3 içinde yukarıdaki gibi aynı protokol sonrası için sakla.
  5. Bakteri kültürü uygun ölçekli santrifüj şişe aktarın. Örneğin, bir 1 L kültür dört steril tek kullanımlık 250 mL konik alt polipropilen Şişeler için transfer edilebilir. 20 dk 4 ˚C az için 3000 x g de buzdolabında bir masa üstü santrifüj şişelerde spin. Supernatants dökerek atmak.
    1. Tüm 25 mL (6.25 mL şişe başına) soğuk PBS (ile ya da ezelî CaCl2 ve MgCl2) toplam hacmi 1 L bakteriyel kültüründe çökeltilerini pipetting tarafından resuspend. Birleştirmek ve bakteriyel süspansiyonlar bir 50 mL konik tüp için transfer. 3000 x g de soğutmalı santrifüj 4 ° C'de 20 dk içinde spin Süpernatant dökme veya pipetting atın.
  6. Bakteriyel Pelet 10 mL resuspension arabellekte (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl ve 500 mikron phenylmethylsulfanoxide (PMSF) proteaz inhibitörü) pipetting tarafından resuspend. Ek bir Dewar şişesi ile sıvı azot 50 mL tüp daldırın için yeterli tüp yerleştirerek Pelet dondur. Dikkatle sıvı azot tüpü çıkarması ve-80 ° C'de depolayın
    Not: Bakteriyel granül birkaç ay-80 ° C'de depolanmış olabilir -80 ° C depolama iki yıldır takip aktif protein kaybı olmadan gördük.
  7. İndüksiyon öncesi ve sonrası indüksiyon örnekleri 8.3 cm genişliğinde, 7,3 cm yüksek, 0,75 mm kalın SDS-sayfa jelleri katman yığınlama 1,5 mL % 6 polyacrylamide ile analiz (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 6 Akrilamid, % 0,1 SDS, % 0,1 amonyum persülfat, %0,001 TEMED) ve 3,5 mL % 10 Katman çözme polyacrylamide (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, % 10 Akrilamid, % 0,1 SDS, % 0,1 amonyum persülfat, % 0.001 TEMED)12.
    1. Yığın jel dökme sonra 10 iyi tarak yerleştirin. Jel polimerli ne zaman sayfa aparatı monte ve yeterli SDS-sayfa çalışan arabellek (25 mM Tris, 192 mM glisin, % 0,1 SDS) ekleyin.
    2. Her örneğinin 10 μL ve prestained protein standartların 4 μL yük. Boya açık alt jel, yaklaşık 60 dk ulaşıncaya kadar 16,5 V/cm çalıştırın.
    3. Jel levha sökmeye ve jel için plastik bir küvet aktarın. Coomassie parlak mavi çözüm (%0.1 Coomassie parlak mavi R-250, % 40 metanol, % 10 Asetik asit) cömertçe jel kapak ve ortam sıcaklığı, 20 dk için leke için boyama ekleyin.
    4. Boyama çözüm dökerek kaldırın ve eski yerine koymak ile çözüm (% 40 metanol, % 10 Asetik asit) destain bantları kolayca görünür hale gelene kadar. Destaining çözüm dökerek kaldırın ve deiyonize su ile değiştirin. PFV inç sonrası indüksiyon örnekte kolaylıkla tanımlanmalıdır. PFV inç hexahistidine etiketi ile 47374 Da bir moleküler ağırlık vardır.
    5. PFV inç görünür değilse, bir dönüşüm plakaların farklı bir koloni ile başlayan indüksiyon yineleyin.

2. nikel benzeşme Kromatografi

  1. Bir bakteriyel Pelet buz çözme.
    Not: Bu önemli zaman (yaklaşık 2-3 h) alacak. Pelet hücre Bulamaç çözdürülen, ek bir 500 mikron PMSF (100 mM stok çözelti) ekleyin.
  2. 50 mL tüp bakteri Bulamaç buz üzerinde tutun. Bakteri için %30 30 genlik adlı solüsyon içeren temizleyicide s (1 s, 1 kapalı s) 1 L kültür 0,125 inç çapında 0,5 inç çapında biyolojik boynuzlu bir sonicator kullanarak elde Pelet başına konik microtip, 20 kHz frekans ve 400 W. maksimum güç
  3. Hücre örnek bir soğuk ultracentrifuge tüp aktarın. Polikarbonat şişe (25 mm çapında, 89 mm yükseklik) bir türü 60 Ti sabit açılı rotor ile uyumlu kullanabileceksiniz. Eğer aynı yerçekimi kuvveti elde alternatif tüpler ve rotorlar kullanılabilir. Spin 120.000 x g 4 ° C'de 60 dk Bariz bir Pelet olmalıdır. Süpernatant sarı bir renk olabilir.
  4. Süpernatant dökme veya soğuk 50 mL konik tüp pipetting aktarın. Not Ses; Bu birim yaklaşık buz gibi ek önce kullanılan resuspension arabellek hacmi olmalıdır. Süpernatant viskoz ise, Kromatografi sütun yapışmasına neden bakteriyel DNA tarafından kirlenmiş. Bu durumda, bakteriyel DNA cips ultrasantrifüj yineleyin.
  5. 500 mL hazırlamak bir (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mikron PMSF) tampon ve 500 mL arabellek B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mikron PMSF, 200 mM imidazole).
    Not: Bu protokol için hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemi, tüm tamponları ve örnek 4 ° C soğuk bir odada tutun.
    1. Steril filtre arabelleği A ve B 0,2 mikron tek kullanımlık filtre cihazları ile. FPLC sistemine bağlı olarak, yıkama pompası A ve pompa B arabellek A ve arabellek B, sırasıyla. Akış Arabellek A % 90 ve % 10 arabellek B iletkenlik ve UV okuma stabilize kadar sistemi aracılığıyla. Maksimum akış hızı araç üzerinde bağlıdır; bir akış hızı 5 mL/dk 1.0 MPa maksimum basınç limit ile kullanın.
  6. 110 mm uzunluğunda, 5 mm çap FPLC sütun 1,5 mL nikel-ücret reçine ile hazırlamak (en fazla bağlama kapasitesi 50 mg/mL, maksimum basınç 1 MPa). Sütun bir gün arıtma önce hazırlanan ve 4 ˚C depolanır.
  7. Sütun FPLC araç olarak bağlayın. Sütun ile tampon A % 90 ve % 10 arabellek B (20 mM imidazole) bir akış hızı 0.5 mL/dk 20 mL 0.5 MPa maksimum basınç sınırı ile equilibrate. Araç iletkenlik ve 280 Absorbans UV gerçek zamanlı veri toplama nm (bir280). İletkenlik ve UV okuma stabilize. Bu ölçümler stabilize değil, akışı arabelleği üzerinden sütun için kararlı oldukları kadar devam.
  8. 0,15 mL/dk Debi maksimum basınç sınırı 0.5 MPa olan adresindeki sütun için protein örnek (~ 10 mL başına pelet) yükleyin. Debisi ve sütun basıncı arıtma boyunca aynı kalır. 50 mL tüp aracılığıyla akış toplamak.
    1. Sütun yıkama 20 mL arabellek A % 90 ve % 10 ile arabellek B. toplamak bir 50 mL tüp yıkama. Proteinler 20 mL doğrusal gradyan, %10 100 arabellek B (20 mM 200 mM imidazole için) ile elute.
    2. Son olarak, sütun 5 mL %100 arabellek B (200 mM imidazole) ile yıkayın. Degrade ve son yıkama toplamak 0,27 mL kesirler.
  9. 2 x SDS-sayfa örnek arabelleği 15 μL 15 μL akışı aracılığıyla, yıkama ve tepe A280 kesirler ile birleştirir. Örnekleri 3 dakika kaynatın.
    1. İki %10 15 iyi tarak adımla 1.6 dışında daha önce açıklandığı gibi SDS-sayfa jelleri hazırlayın. Her örneği için jeller 10 μL ve prestained protein standartların 4 μL yük. Koşmak, leke ve jelleri 1.6 adımda anlatıldığı gibi analiz.
    2. Neredeyse saf PFV inç görsel inceleme üzerine dayalı içerecek şekilde görünür kesirler birleştirin. Pipetting tarafından genellikle 8-10 mL birimin tedbir.
    3. Bir Spektrofotometre kullanarak, birleştirilmiş kesirler A280 ölçmek ve PFV inç protein, toplam miktarı; ~ 10 mg-L indüklenen kültür bizim tipik verimidir. PFV inç yok olma katsayısı hexahistidine etiketiyle 59360 cm-1 M-1olduğunu.
  10. Hexahistidine etiketi kaldırmak için PFV inç ile 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M hisse senedi çözüm) ve 0,1 mM EDTA, pH 8.0 (0,5 M stok çözelti) ek. İnsan rhinovirus (HRV) 3 C proteaz mg PFV inç Incubate başına 15 μg gecede 4 ˚C ekleyin. Bölünme PFV inç molekül ağırlığı 47374 Da 44394 Da azaltır ve % 10 SDS-sayfa analizi tarafından doğrulanmadı.

3. heparin benzeşme Kromatografi

  1. 250 mL hazırlamak arabellek C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 mikron PMSF) ve 250 mL arabellek D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 mikron PMSF, 1 M NaCl).
    Not: Bu protokol için FPLC sistem, tamponlar ve örnek 4 ˚C, soğuk bir odada tutulur.
    1. Steril filtre arabelleği C ve D 0,2 mikron tek kullanımlık filtre cihazları ile. FPLC sistemine bağlı olarak, yıkama pompası A ve pompa B arabellek C ve arabellek D, sırasıyla. Akış Arabellek C % 80 ve % 20 arabellek D iletkenlik ve UV okuma stabilize kadar sistemi aracılığıyla. Maksimum akış hızı araç üzerinde bağlıdır; Biz rutin 1.0 MPa maksimum basınç limit ile bir akış hızı 5 mL/dk kullanın.
  2. Bir 80 mm uzunluğunda, 5 mm çap FPLC sütun 1 mL heparin sepharose reçine (bağlama kapasitesi sığır 2.0 mg mL başına Antitrombin III reçine; maksimum basınç 1.4 MPa maksimum) ile hazırlayın. Sütun bir gün arıtma önce hazırlanan ve 4 ° C'de depolanan Sütun FPLC araç olarak bağlayın.
    1. Maksimum basınç sınırı 1 MPa olan arabellek C % 80 ve % 20 arabellek D (200 mM NaCl) bir akış hızı 0.5 mL/dk 20 mL ile sütun equilibrate. Araç iletkenlik ve 280 Absorbans UV gerçek zamanlı veri toplama nm (bir280). İletkenlik ve UV okuma stabilize. Bu ölçümler stabilize değil, akışı arabelleği üzerinden sütun için kararlı oldukları kadar devam.
  3. PFV inç örnek 200 mm NaCl konsantrasyon 1,5 birimleri arabellek C. ekleyerek azaltmak Örneğin, 10 mL PFV inç için arabellek C 15 mL ekleyin Bizim toplam genellikle ~ 25 mL birimdir.
  4. Yük heparin sepharose sütun, 0.5 mL/dk akış hızı maksimum basınç ile seyreltilmiş PFV inç örneğe 1.0 MPa sınırlayın. Debisi ve sütun basıncı arıtma boyunca aynı kalır. 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak.
    1. Yıkama sütun 20 mL % 80'i arabellek C ve arabellek D (200 mM NaCl), % 20 ile 50 mL konik tüp makinaya toplama. Sütun (200 mM 1 M NaCl ile) 30 mL doğrusal gradyan, %20 100 arabellek D ile elute.
    2. Yıkama sütun 5 mL % 100 arabellek d. ile 0.37 mL kesirler degrade ve son makinaya toplamak.
  5. Yük, akış, yıkama ve kesirler 8 oranında analiz SDS-sayfa 2.9 içinde açıklandığı gibi. 44394 Da bir molekül ağırlığı PFV bölünme hexahistidine etiketinin aşağıdaki inç var ve yok olma katsayısı 59360 cm-1 M-1 hexahistidine etiketi olmadan kalır. 4 ˚C, tüm kesirler nükleaz tahlil tamamlanması kadar saklayın.

4. nükleaz tahlil

  1. Neredeyse saf PFV inç birleştirmek 3 μL heparin kesir ve 50 içerecek şekilde görünür heparin sepharose kesirler tanımlamak ng 3 KB supercoiled plazmid DNA tepki tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 mikron ZnCl2 10 mM DTT) 15 μL son hacmi ile. 90 dk. Ekle bir negatif kontrol için 37 ˚C ile hiçbir PFV inç, kuluçkaya
    1. 1 mg/mL İndinavir K ile Reaksiyonu (20 mg/mL stok çözelti) DurdurveÇoğaltma % 0.5 SDS (% 10 hisse senedi çözüm). 1 h. örnekleri daha sonraki analizler için-20 ° C'de depolanmış olabilir için 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. 125 mL jel % 1 kilo başına birim (w/v) özel 1 x TAE tampon (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) 0.1 µg/mL arasında etidyum bromür (10 mg/mL stok çözelti)13ile hazırlayın. Özel çözüm eritin ve bir 15 cm x 10 cm jel döküm tepsiye dökün. 15 iyi tarak 5 mm genişliğinde, 0,75 mm kalın kuyu ile ekleyin. İnce wells 1.5 mm kalınlığında wells için karşılaştırıldığında daha iyi grup çözünürlük verim. Ortam sıcaklığında katılaşmaya jel izin.
    1. 1 jel bırakın 0.1 µg/mL arasında etidyum bromür ile x TAE. Boya (% 50 gliserol, % 0.15 Orange G boya) yükleme x 6 3.5 μL nükleaz tahlil reaksiyonlar için ekleyin. Birimin tümü jel için yükleyin. Jel sabit voltaj, cm (100 V), ortam sıcaklığında 1 h için veya Orange G boya açık jel sonuna ulaşana kadar başına 10 volt çalıştırın.
  3. Hemen özel jel etidyum bromür algılamak için ayarla floresan bir tarayıcı ile resim. Doğrusal DNA 3 kb boyutu sadık çalıştırmalısınız, supercoiled DNA daha hızlı (~ 2 kb) çalıştırmalısınız ve rahat daire DNA yavaş (~3.5 kb) çalıştırmalısınız.
    1. Görüntü analiz yazılımı kullanarak, her şeritte supercoiled, doğrusal ve rahat daire plazmid piksel hacmi hesaplama. Birimler bu üç DNA formu "Toplam DNA" için değer ve doğrusal ve rahat daireler yüzdesini hesaplamak için kullanabilirsiniz piksel toplamı ara. Örneğin, rahat daireler piksel hacmi toplam DNA piksel değeri bu şeritte bölünür, bu numarayı bir yüzde belirlemek için 100 ile çarpmak. Bulaşıcı nükleaz içeren kesirleri doğrusal ve rahat daireler negatif denetimine göre daha yüksek bir yüzdesi görüntüler.
  4. Bulaşıcı nükleaz faaliyet gösterme heparin sepharose kesirler birleştirin. 10 mm 6-8 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) diyaliz boru 1 L 50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 mikron ZnCl2, 10 mM DTT, % 20 gliserol karşı gecede 4 ° C'de diyaliz.
  5. Nükleaz serbest PFV inç örnek gelen diyaliz boru kurtarmak. A280 ölçmek ve son protein konsantrasyonu hesaplayın. Aliquot ve ek sıvı azot dondur. Aliquots-80 ° C'de depolayın

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant PFV inç genellikle bakteriyel nükleaz1ile kirlenmiş. Biyokimyasal Tümleştirme deneyleri supercoiled plazmid DNA dönüşüm rahat daireler ve doğrusal ürünlerini Nefelometri bağlıdır. Bulaşıcı bir nükleaz varlığı bu deneyleri sahte Nefelometri için neden olabilir. PFV inç ifade hexahistidine etiketi ile E. coli (şekil 1) indüklenen ve ilk saf nikel benzeşme Kromatografi (Şekil 2). Kesirler neredeyse saf PFV inç ile birleş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA onarım proteinler, tek molekül mikroskobu uygulamalar veya retroviral integrases, oksijen gidericiler gibi DNA ile etkileşim rekombinant proteinler bakteriyel nükleaz2,3bulaşıcı özgür olmalıdır. Bu kirleticiler sonuçları yorumlama toplu biyokimyasal veya tek molekül deneyleri sırasında karışabilir.

Biz bir bakteriyel nükleaz sık PFV inç ile birlikte arındırır olduğunu bulduk Ancak, PFV inç bakteriyel nükleaz geçen madde

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BL21 / DE3 Rosetta E. coliEMD Millipore70956-4
LB et suyuEMD biyolojik bilimler1.10285.0500
AmpisilinAmresco0339
Kloramfenikol ve nbsp;Amresco0230
PBSSigma-AldrichD8537
IPTG Denville ScientificCI8280
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
Tris Ultra SafGojira İnce KimyasallarUTS1003
NaClP212121RP-S23020
PMSF Amresco0754
İmidazol Sigma-AldrichI0250
DTT P212121SV-DTT
UltraPure EDTACanlandırıcı / Gibco15575
MgSO4< / sub>Amresco0662
Agaroz Denville ScientificCA3510
Etidyum bromürThermo Fisher ScientificBP1302
GliserolFisher ScientificG37-20
Ni-NTA Süper AkışQiagen30430
Heparin Sefaroz 6 Hızlı AkışGE Sağlık Yaşam Bilimleri17-0998-01
HRV14 3C proteaz ve nbsp;EMD Kimyasalları71493-3

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  3. Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
  4. Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
  5. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  6. Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
  7. Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
  8. Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
  9. Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
  10. Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
  11. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409(2016).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Safla t rmaHeparin Afinite KromatografisiRekombinant ProteinSDS PAGEN kleaz AnaliziAgaroz Jel ElektroforeziPlazmid DNAE Coli Ekspresyonu

İlgili makaleler