Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Özet

Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.

Özet

Uzun kemik defektleri sigara şifa tedavisi için farklı tedavi stratejileri yoğun bir şekilde araştırdık. Tedaviler mevcut Biyomalzeme kemik morfogenetik proteinler (BMP) gibi Osteojenik büyüme faktörleri ile birlikte kullanımı yol açmıştır bazı sınırlamaları kullanılmakta. Yaygın olarak kullanılan emme veya saklama yöntemleri BMP2, genellikle birkaç ciddi olumsuz yan etkileri kışkırtır bir sözde ilk patlama yayın etkisi sonucu supra fizyolojik miktarda gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için strateji kovalent protein için iskele çift olacaktır. Ayrıca, bağlantı site belirli bir şekilde bir tekrarlanabilir ürün sonuç sağlamak için yapılmalıdır. Bu nedenle, biz bir yapay amino asit (propargyl-L-lizin) kodon kullanımı genişletme (BMP2-K3Plk) tarafından BMP2 protein olgun parçası tanıtıldı bir BMP2 değişken oluşturdu. BMP2-K3Plk functionalized boncuk bakır katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC) ile birleştiğinde. Eşleşmiş BMP2 K3Plk biyolojik aktivitesini vitro kanıtlanmış oldu ve BMP2-K3Plk-functionalized boncuk Osteojenik etkinlik tabanlı hücre deneyleri kanıtlanmış oldu. C2C12 hücreleri ile temas functionalized boncuk boncuk yerel olarak kısıtlı bir mesafede alkalen fosfataz (ALP) ifade ikna edebildik. Böylece, bu tekniği ile functionalized iskele üretilebilir hücre farklılaşması Osteojenik bir soy doğru tetikleyebilir. Ayrıca, alt BMP2 dozlarda eşleşmiş BMP2 site yönettiği kontrollü yönelimi nedeniyle yeterlidir. Bu yöntemle, BMP her zaman onların reseptörleri hücre yüzeyi uygun yönde hangi faktörler site yönettiği kaplin teknikleri ile birleştiğinde Eğer durum böyle değil maruz kalır. Ürün sonucu çok kontrol edilebilir ve böylece, malzeme homojen özellikleri, onların uygulanabilirliği kritik boyutu tamiri için iyileştirilmesi ile sonuçlarında kusurları kemik.

Giriş

Kemik doku Mühendisliği ve kemik rejenerasyonu nihai hedefi dezavantajları ve sendikasız kırıklar ortak tedaviler sırasında ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden gelmektir. Her ikisi de birkaç dezavantajları olsa bile otomatik veya allo nakillerine ağırlıklı olarak geçerli tedavi stratejileri kullanılır. İdeal kemik grefti osteogenesis osteoindiksiyon yanı sıra osteoconduction, kemik greft osteointegrasyon için lider tarafından ikna etmek. Günümüzde, bir ideal kemik grefti tüm özelliklerinin sağladığı yalnızca otomatik nakli "altın standart" kabul edilir. Ne yazık ki, uzun cerrahi kez ve genellikle daha fazla komplikasyonlar (örneğin, kronik ağrı, Hematom oluşumları, enfeksiyonlar, kozmetik kusurları, vb) gerektirdiği ikinci bir travma site gibi önemli olumsuz yönleri de sunar. Allojenik Greftler, öte yandan tüm genel özellikleri¹için suboptimal özelliklere sahip. Alternatif kemik greft teknolojileri osteoindüktif, osteoconductive, Biyouyumlu, ve bioresorbable iskele üretmek amacı ile son birkaç yıl içinde geliştirilmiştir. Birçok Biyomalzeme değil göstermek tüm Osteojenik bu özelliklere göre farklı büyüme faktörleri, özellikle BMP2 ve BMP7, belirli iskele²Osteojenik potansiyelini artırmak için dahil edilmiş.

Önemli bir ölçüt olarak hücre işe alım ve eki, hücre ingrowth ve anjiogenezi gibi önemli olaylar kolaylaştırmak amacıyla bir kontrollü doz yayın zamanla böyle büyüme faktörü vasıtalarının sağlamalıdır. Ancak, bmp gibi diğer Osteojenik büyüme faktörleri de sık kovalent olmayan³immobilize. Tuzak ve adsorpsiyon teknikleri genellikle kemik büyüme inducing tarafından çevre dokular etkileyen şiddetli dezavantajları içinde vivo yol açar bir ilk patlama açıklaması nedeniyle protein supra fizyolojik miktarda kullanımını gerektiren, Osteoliz, şişme ve iltihap⁴. Böylece, büyüme faktörleri daha uzun süreler için teslim yerinde tutma kovalent immobilizasyon yöntemleri tarafından elde edilebilir. Kimyasal olarak değiştirilmiş BMP2 (succinylated⁵, acetylated⁶ veya biotinylated⁷), mühendislik heterodimers⁸veya türetilmiş oligopeptides⁹ tasarlanmış ve sınırlamaları aşmak için kullanılan BMP2 ile ilgili emme. Ancak, düzenleme potansiyel olarak immobilize ligand bağlanması için hücresel reseptörleri inhibe. beri biyo-etkinlik bu yapıları, tahmin edilebilir değildir. Olarak daha önce gösterilen, bu tüm dört reseptör zincirleri aktif ligand-reseptör kompleksleri oluşumunda yer alan tüm aşağı akım sinyal cascades¹⁰tam olarak etkinleştirmek için immobilize BMP2 ile etkileşim esastır.

Bir inhomogeneous ürün sonucu sorunları açısından bioactivity, istikrar ve bioavailability immobilize faktörünün kısıtlamaları aşmak için kovalent iskele site yönettiği bir şekilde bağlama yetenekli bir BMP değişken tasarlanmıştır. BMP2-K3Plk, olarak adlandırdığı bu varyant genetik kodon genişleme¹¹' de kullanılmaya başlanan yapay bir amino asit oluşur. Bu varyant için iskele süre paraca desteklemek onun biyolojik aktivitesi kovalent kaplin strateji kullanarak başarıyla bağlanmıştır.

Protokol

1. BMP2 değişken BMP2 K3Plk imalatı

1. Klonlama, BMP2-K3Plk tarafından site yönettiği mutagenesis PCR kullanarak ¹²
   1. İnsan olgun BMP2 yükseltmek (hmBMP2) p25N-hmBMP2 vektöründen ( Tablo malzemelerigörmek) ile ileri bir astar (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') ve ters bir astar (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') tanıtan bir kehribar stop kodonu ( «««TAG) BMP2´s olgun bölümünün ilk lizin konumunda. Kullanarak 33,5 µL H₂O, 10 µL PCR reaksiyon mix, 1,5 µL 10 µM dNTP hisse senedi çözüm, ileri astar (10 pmol/µL), ters astar (10 pmol/µL), p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) 1 µL 1,5 µL 1,5 µL PCR reaksiyonu gerçekleştirmek ve DNA polimeraz 1 µL ( Tablo malzemelerigörmek) termal cycler (95 ° c 5 min için denatürasyon denatürasyon 95 ° C'de 30 döngüleri için 1 dk 1 dk, 1 dk 72 ° C uzama ve son bir uzantısı için 10 dk 72 ° C'de 60 ° C'de tavlama) içinde.
   2. Aşağıdaki üretici önerileri piyasada bulunan bir seti kullanarak PCR ürünü arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
   3. 45 dk 16 µL H₂O, 3 µL sindirim arabelleği, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de restriksiyon enzimi NdeI PCR ürünü sindirmek (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Isı-65 ° c enzim 5 dk. sindirmek için 1 h H₂O, 3 µL sindirim arabelleği 16 µL, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de restriksiyon enzimi BamHI PCR ürünü devre dışı bırakabilirsiniz (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Enzim 5 min için 80 ° C'de ısı devre dışı bırakabilirsiniz.
   4. NdeI ile pET11a-pyrtRNA vektör 16 µL H₂O, 3 µL sindirim arabelleği, DNA'ın 10 µL kullanarak 2 saat 45 dk için 37 ° C'de sindirmek (20 ng / µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Isı-devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 5 dk. sindirmek için BamHI ile pET11a-pyrtRNA vektör 1 h H₂O, 3 µL sindirim arabelleği 16 µL, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. 5 min için 80 ° C'de ısı devre dışı bırakabilirsiniz.
   5. Sindirilmemiş vektör sindirilir vektör ayrı ve sindirim artıkları tarafından özel Jel Elektroforez (% 0,8 özel, 100 V 60 dk.). Sindirilir BMP2-K3TAG ekleme için 2 h 100 kullanarak (RT) oda sıcaklığında sindirilmiş pET11a-pyrtRNA omurga ile ligate pET11a-pyrtRNA omurga ve 34.5 ng ng BMP2-K3TAG ucun (molar oranı 1:3). Reaksiyon karışımı içeren DNA omurga ve INSERT, 2 µL ligaz arabelleği, DNA ligaz ve H₂O 20 µL toplam hacmiyle 1 µL.
   6. PET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk ve pSRF-düet-pyrtRNAsynth ortak bir dönüşüm BL21(DE3) bakteri gerçekleştirin:
      1. 50 ekleyin her plazmid bakteri için ng buz 30 dk için 50 42 ° C'de ısı şok karışımı koyun s, on Ice 5 min için yer, Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL karışımı ekleyin ve 60 dk için 300 RPM sallamak.
      2. Önceden ısıtılmış sefaloridin (50 µg/mL) üzerine bakteriyel karışımı 100 µL yaymak / Ampisilin (100 µg/mL) levha ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
2. İfade ve BMP2-K3Plk arıtma ^{13 , 14}
   1. Bir koloni LB orta 50 mL 50 µg/mL sefaloridin ve Ampisilin 37 ° C'de 100 µg/mL ile geceleme yaymak
   2. 800 mL 50 µg/mL sefaloridin ve 100 µg/mL Ampisilin ile müthiş suyu (TB) orta içine gecede kültür 1:20 oranında seyreltin ve 37 ° C'de 0.7 OD₆₀₀ ulaşılana kadar büyür. Propargyl-L-lizin 10 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüksiyon önce kültüründen 100 µL örnek toplamak.
   3. Gen ifadesinin IPTG ek olarak 1 mM son bir konsantrasyon tarafından ikna etmek. Kültür için bir orbital shaker 180 RPM 16 h 37 ° C'de büyümek. 100 µL örnek kültüründen toplamak.
   4. 9000 x g 30 dk at için de bütün kültür süpernatant santrifüj kapasitesi ve bakteriyel Pelet TBSE arabellek (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) 30 ml 1: 1000 (v/v) 2-(taze eklendi) mercaptoethanol ile resuspend.
      Dikkat: 2-mercaptoethanol duman başlık altında ele. Deriyle ve gözle temastan kaçının. Buharı veya duman zehirlenmesinden kaçının. 2-mercaptoethanol duman başlık altında içeren arabellekleri ile tüm resuspension adımları gerçekleştirin.
   5. Bir boş santrifüj kabı tartmak ve resuspended Pelet boş kabı aktarın. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve kabı ile Pelet tartın. Pelet ağırlığını hesaplamak için boş kabı ağırlığı çıkarma.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Pelet-20 ° c kısa vadeli veya uzun vadede-80 ° C'de dondurmak. Protokol sürdürme üzerine, RT, pelet tezcan
   6. Pelet STE arabellekte (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 375 mM Sükroz; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (taze ekledi)) resuspend. 200 mL STE arabelleği her 10 g Pelet için kullanın.
   7. Buz (40 s darbe, 20 s fren ve % 30 genlik ile 10 dakika) uzaklaştırılmış solüsyon içeren temizleyicide. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın. Sonication ve Santrifüjü adımları 4 kere tekrar edin.
   8. Pelet TBS arabellek (10 mM Tris, 150 mM NaCl) 100 mL resuspend. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.
   9. Pelet nükleaz arabelleği (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂) taze ekledi 80 U/mL nükleaz ile (örneğin, Benzonase) resuspend 10 mL/g Pelet kullanarak. Süspansiyon gecede, RT karıştırma plaka (30 rpm) üzerinde kuluçkaya.
   10. Triton arabellek ekleyin (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, % 6 (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenil-polietilen glikol) süspansiyon için. Eklemek için Triton arabellek hacmi süspansiyon 0.5 birim bölümüne karşılık gelir. RT (karıştırma), 10 min için kuluçkaya. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.
   11. Pelet TE arabellek (100 mM Tris, 20 mM EDTA) resuspend 8 mL/g Pelet kullanarak. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.
   12. Pelet 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5.0 ve 5 mL/g (taze eklendi) 1 mM dithiothreitol (DTT) ile 6 M GuCl ekleyerek resuspend. Süspansiyon gecede 4 ° C'de karıştırma plaka (30 rpm) üzerinde kuluçkaya.
   13. 75,500 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant şimdi gelişeceğini monomeric BMP2 protein içerir. Toplamak süpernatant ve bu özü 20 OD/ml bir konsantre olarak 3 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) membran kullanarak hücre ( Tablo malzemelerigörmek) konsantre.
   14. Konsantre monomerleri tek damla Renaturation arabellek (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM arkadaşlar, 5 mM EDTA, 1 mM glutatyon disülfür (GSSG), 2 mM glutatyon (GSH)) (30 rpm) karıştırarak ekleyin. RT karanlıkta 120 h için kuluçkaya.
       Not: Bu kuluçka döneminde occours refolding. Bu adım ileriye doğru çözüm katlanmış dimerik BMP2 K3Plk içerir.
   15. Konsantre HCl. Dialyze 1 mM konsantre HCl. karşı çözüm konsantre hücrede 10 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) membran kullanarak diyaliz solüsyonu kullanarak 3.0 çözüm pH ayarlayın.
   16. Çözüm arabellek (20 mM NaAc, % 30 isopropanol) ekleyerek equilibrate. Arabellek A bir çözüm % 30 birime karşılık gelen bir birim eklemek. Belgili tanımlık eriyik vasıl 4700 x g 15 dakika santrifüj kapasitesi.
   17. İyon değiştirme arabelleği A. yükü dengelenmiş sütuna protein çözüm 150 mL ile bir hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistem¹⁵ için sütun equilibrate. Doğrusal gradyan (20 mM NaAc, % 30 isopropanol, 2 M NaCl) arabelleği B kullanarak kesirler elute arabellek B. toplamak 2 mL kesirler 100 mL kullanarak.
       Not: Toplam sütun hacmine göre sütun için yüklemeden önce protein konsantre. Son protein birim olmalıdır < %5 Toplam sütun biriminin.
   18. Her kesir 20 µL SDS Polyacrylamide (% 12) Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ¹⁶ ve Coomassie parlak mavi boyama¹⁷ tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) analiz.
       Not: SDS-sayfa jel gösterir kesirler dimer (26 kDa) ve kesirler monomer (13 kDa) içeren içeren Coomassie parlak mavi lekeli.
   19. Dimer içeren kesirleri havuz. Kesirler gecede 4 ° C'de 1 mM HCl (5 litre hacim) karşı içeren dimer havuzu diyaliz. Santrifüj filtre ünitesi konsantre bir 10 kDa kullanarak nihai ürün konsantre ( Tablo malzemelerigörmek). SDS Polyacrylamide (% 12) Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ve Coomassie parlak mavi boyama tarafından nihai ürün analiz.
       Not: Coomassie parlak mavi bant SDS-sayfa lekeli jel 26 kDa tek bir grup göstermek. Bu son BMP2-K3Plk ürünüdür.

2. bakır (I) getirilmesi-ALKİN-azid Cycloaddition (CuAAC) koşulları katalize

1. Sodyum askorbat (NaAsc) ve bakır (II) sülfat (CuSO ₄ ) etkisi _{BMP2 vahşi türüne (BMP2-WT)}
   1. 20 µM kuluçkaya BMP2-WT NaAsc farklı oranlara CuSO₄' e sahip. 0,5 mM NaAsc ve 0,5 mM CuSO₄ (başlangıç konsantrasyonu) 50 µL hacmindeki kullanın. NaAsc aşağıdaki oranları ile CuSO₄' e devam: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), CuSO₄ konsantrasyonu 0.5 mM sabit tutmak ve NaAsc konsantrasyonu buna göre ayarlayarak. H₂O dönen Mikser (20 devir/dakika) üzerinde tepki gecede RT. gerçekleştirmek
   2. Azaltılmış örnekleri %5 2-mercaptoethanol içeren yükleme arabelleği ekleyerek hazırlamak ve örnek 95 ° c 6 dk. analiz azalır ve SDS Polyacrylamide tarafından sigara azaltılmış örnekleri (% 12) Elektroforez (SDS-sayfa) ve Coomassie parlak mavi boyama jel için kuluçkaya. SDS-sayfa jelleri lekeli Coomasie 13 kDa (sınırlı koşullar) 26 kDa ve daha yüksek molekül ağırlıklı (sigara azaltılmış koşullar) aralığında bantları göster.
2. Etkisi Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) üzerinde CuAAC tepki
   1. 20 µM kuluçkaya BMP2-K3Plk THPTA farklı oranlara CuSO₄' e sahip. 5 mM NaAsc ve 200 µM 3-Azido-7-Hidroksikumarin (NaAsc ve 3-Azido-7-Hidroksikumarin sabit tutmak) kullanın. 50 µM THPTA ve 0,5 mM CuSO₄ konsantrasyonları başlangıç olarak kullanın. THPTA farklı oranlara CuSO₄kullanın: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). RT 24 h üzerinde dönen Mikser (20 devir/dakika) reaksiyon H₂O (50 µL Toplam hacim) gerçekleştirir.
   2. Kaplin üzerine bir floresan boya 3-Azido-7-Hidroksikumarin olur. Örnekleri azaltılmış ve sigara azaltılmış koşullarda hazırlamak ve bunları SDS-PAGE tarafından analiz. 3-Azido-7-Hidroksikumarin için belirli dalga boyu ile uyarma kanalın altında jelleri görselleştirmek (λ_abs 404 = nm; λ_em = 477 nm).

3. BMP2-K3Plk azid için kovalent kaplin tekniği özel boncuk Functionalized

1. BMP2-K3Plk veya BMP2-WT (negatif kontrol kullanılan) 20 µM azid aktif özel boncuk tepki arabelleği (0.1 M HEPES pH 7,0, 3,9 M üre, 50 µM CuSO₄, 250 µM THPTA, 5 mM sodyum askorbat) 500 µL toplam hacmi içinde 20 µL ile bir rotati RT, 2 h için kuluçkaya NG Mikser (20 devir/dakika). Reaksiyon 5 mM EDTA (son konsantrasyonu) ekleyerek durdurmak.
2. RT dönen Mikser (20 devir/dakika) üzerinde 15 dakika kuluçkaya. 20.000 x g 1 dk az RT. toplamak için de örnekler santrifüj kapasitesi supernatants.
3. Üç kez ile 1.000 µL HBS₅₀₀ arabelleği (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), boncuk içeren Pelet üç kez 4 M MgCl₂1000 µL ile iki kez 1.000 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Her yıkama adımında, RT, 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj kapasitesi ve supernatants toplamak. Eşleşmiş boncuk PBS 1.000 µL 4 ° C'de depolayın
   Dikkat: süpernatant kaldırılırken boncuk Pelet rahatsız etmeyin.

4. doğrulama varlığı ve biyolojik aktivitesi immobilize BMP2-K3Plk kullanarak Texas kırmızı etiketli BMP reseptör ben bir Ectodomain (BMPR-IA _EC )

1. 50 kuluçkaya Texas kırmızı 1 µM ile BMP2-K3Plk functionalized boncuk µL dönen Mikser (20 devir/dakika) 1 h için RT 150 µL HBS₅₀₀ arabelleği (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) ile BMPR-IA_EC etiketli.
2. Boncuk için 1 dk RT. atma süpernatant az 20.000 x g, santrifüj kapasitesi. Boncuk 1000 µL HBS₅₀₀ arabelleği ile yıkayın. Ek bir çamaşır adım 3 kez tekrarlayın. Her sonra RT, 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj adım yıkama.
3. Boncuk PBS 500 µL içinde resuspend ve cam kapak Slayt üzerindeki 50 µL pipet. 561 veya 594 nm arasında mikroskop filtre ayarlayın. Texas kırmızı-BMPR-IA_ECalgılamak-BMP2-K3Plk functionalized kullanılması floresan mikroskopi ve take Fotoğraflar boncuk.

5. ölçme alkalen fosfataz (ALP) In Vitro Bioactivity BMP2-K3Plk önce üretilen ve kaplin reaksiyon sonra kanıtlamak için ifade.

1. Alkalen fosfataz (ALP) tahlil
   1. Promyoblastic C2C12 hücreleri (ATCC CRL-172) %10 Fetal buzağı Serum (FCS), 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin %5 CO₂oksijen bir atmosferde 37 ° C'de Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) içinde kültür.
   2. C2C12 hücreleri, 3 × 10⁴ hücreleri/iyi bir yoğunluk bir 96-şey Mikroplaka içine tohum. Hücreleri bir gecede eklemek izin. Orta kaldırmak ve C2C12 hücreleri 0,5-200 huzurunda kuluçkaya 100 µL/iyi DMEM (% 2 FCS, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin), % 5 CO₂ 72 h için oksijen bir atmosferde 37 ° C'de BMP2-WT veya BMP2-K3Plk nM.
   3. Orta kaldırmak ve hücreleri PBS 100 µL iyi ücret ile yıkayın. RT 100 µL/iyi lizis arabelleği ile 1 h için hücreleri Parçalayıcı (%1 NP-40, 0.1 M glisin, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) bir sallayarak plaka (220 devir/dakika).
   4. 100 µL/iyi ALP arabelleği (0.1 M glisin, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) 1 mg/mL p-(taze eklendi) nitrophenylphosphate ile lysate hücreye ekleyin.
   5. Ölçmek emme 405 nm içinde renk gelişimi tamamlanana kadar ALP tampon ve her 5 dk ekledikten sonra multiplate bir okuyucu. Doz yanıt eğrileri ve EC50 değerleri logistic bir modeli kullanarak oluşturmak y = A₂ + (A₁-A₂) / (1 + (₀x)^p).
2. Alkalen fosfataz (ALP) Boyama
   1. Promyoblastic C2C12 hücreleri (ATCC CRL-172) içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %10 Fetal buzağı Serum (FCS), 100 U/mL penisilin G ve % 5 CO₂oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 100 µg/mL streptomisin kültür.
   2. C2C12 hücreleri, 3 × 10⁴ hücreleri/kuyuda bir 96-şey Mikroplaka yoğunluğu tohum. Hücreleri bir gecede eklemek izin. Orta kaldırın ve 20 µL/iyi BMP2-K3Plk birleştiğinde boncuk ekleyin. BMP2-K3Plk birleştiğinde boncuk bir PBS süspansiyon 1000 µL içinde vardır.
   3. %0,4 düşük erime noktası özel DMEM içinde bir çözüm hazırlamak. (600 W 3 dk) mikrodalgada eritin ve 37 ° C'de bir su banyosunda soğumasını kadar kullanmak sağlar.
   4. 20 µL % 0,4 düşük erime noktası özel her şey (kaplama boncuk ve hücreleri) ekleyin. 20 ° C'de 5 min için 2000 x g, santrifüj 80 µL DMEM (% 2 FCS, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin) ekleyin ve %5 CO₂ 72 h için oksijen bir atmosferde 37 ° C'de kuluçkaya.
   5. Orta katılaşmış % 0,4 özel ayırmaz için dikkatli olmak, kaldırın. 1-adım NBT 100 µL/kuyu eklemek/BCIP (Nitro-mavi tetrazolium klorür, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidin tuz) substrat çözeltisi.
   6. Alkalen fosfataz hemen mor boyama belli olduktan sonra ışık mikroskobu kullanarak boyama analiz. Parlak alan mikroskobu kullanın ve fotoğraf çekmek.

Sonuçlar

Bu makalede, kovalent bir yeni BMP2 değişken, BMP2-K3Plk, piyasada bulunan azid functionalized özel boncuk (şekil 1) çift için bir yöntem açıklanmaktadır. Üretilen BMP2-K3Plk değişken bioactivity alkalen fosfataz (ALP) gen ekspresyonu C2C12 hücrelerdeki indüksiyon tarafından doğrulandı. Vitro test benzer ALP ifade düzeyleri vahşi türü BMP2 tarafından indüklenen gösterir (BMP2-WT) ve BMP2-K3Plk (Şekil 2).

Tartışma

Tagged protein değişik genetik kodon genişleme getirici birincil protein dizi herhangi bir konumundaki başta olmak üzere çeşitli doğal olmayan amino asit analogları giriş izin verir. 6-histidin (onun) etiketi yalnızca olabilir gibi BMP2 gibi BMP durumunda ortak Etiketler beri protein´s C-terminal sonuna Tersiyer protein yapısı içinde gömülü ve böylece dışarıdan erişilebilir değil N ölümcül, tanıttı. Diğer konumlarda tanıtılan etiket boyutunu çok büyük olasılıkla sonuç olarak BMP´s bioactivity tıkamak yapısal değişiklikle...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
< güçlü > Malzeme< / güçlü >
1 Adımlı NBT / BCIP	Thermo Fisher	34042	Hücrelere çözelti ekleyin
3-Azido-7-hidroksikumarin	BaseClick	BCFA-047-1	Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal
Agaroz düşük erime noktası	Biozym	840101	ALP testi için agaroz ve nbsp;
Azide agaroz boncukları	Jena Bioscience	CLK-1038-2
BamHI (Hızlı Sindirim enzimi)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Restriksiyon enzimi
BMP reseptörü IA (BMPR-IAEC)	>--	-Laboratuvarımızda	üretilmiştir
Coomassie Brilliant Blue G-250 Boya	Thermo Fisher Scientific	20279	Coomassie için kullanılan kimyasal SDS PAGE'in parlak mavi boyanması
Bakır (II) sülfat susuz (CuSO4)	Alfa Aesar	A13986	Tıklama reaksiyonu için kullanılan
kimyasal DNA Polimeraz ve reaksiyon tamponu	Kapabiosystems	KK2102	KAPA HiFi PCR Kiti
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s ortamı (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Hücre kültürü ortamı
etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Tıklama reaksiyonunu durdurmak için kullanılan kimyasal
İzopropil ve szlig;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Bakteri indüksiyonu (1mM nihai konsantrasyon)
NdeI (Hızlı Sindirim enzimi)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Restriksiyon enzimi
NHS ile aktive edilen Texas Red	Life teknolojileri	T6134	Reseptöre bağlı
P-Nitrofenil Fosfat	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Alkalin Fosfataz
p25N-hmBMP2	--	-	Walter Sebald'dan J. Nickel
pET11a-pyrtRNA'ya	--	--	Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanmıştır
propargil-L-lizin (Plk)	--	--	Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanmıştır
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanan Qiagen
Jel Ekstraksiyon Kiti	Qiagen	28704	Jel Saflaştırma
Qiagen PCR saflaştırma Kiti	Qiagen	28104	PCR Saflaştırma
Sodyum L-askorbat	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal
T4 DNA Ligaz	ThermoScientific	EL0011	Ligasyonu
tris (3-hidroksipropiltriazolilmetil) amin (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal
4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Equipment
Amicon konsantre hücre 400 ml	Merck KGaA	UFSC40001	Konsantre ünitesi
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri	Merck KGaA	UFC901024	Konsantre santrifüj ünitesi
& Auml; KTA avant FPLC	Ä KTA	-	FPLC makinesi
Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393124	Bakteri kültürü için santrifüj
Bakteriyel Çalkalama İnkübatörü	Infors Bakteri		Çalkalama inkübatörü
FluorChem Q sistemi	proteinsimple	--	SDS-PAGE için görüntüleme ve analiz sistemi
Floresan miskroskop	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel & reg; EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	İyon Değişim Kromatografisi kolon malzemesi
Greiner CELLSTAR®   96 kuyulu plakalar	Sigma	M5811-40EA	Hücre kültürü için 96 kuyulu plakalar (ALP Testi)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	-	Santrifüj
M-20 Mikroplaka Sallanan Kova Rotoru	ALP boyama sırasında plaka için Mikrosantrifüj için	ThermoScientific	75003624
Mikrosantrifüj - 5417R	Eppendorf	-	Santrifüj
OriginPro 9.1 G	OriginLab	-	ALP tahlil verilerinin statik analizi için yazılım
Polisin Slaytlar	ThermoScientific	10143265	mikroskop slaytları
Rotor JA-10	Beckman Coulter	-	Avanti J-26XP santrifüj
Rotor JLA 8.1	Beckman Coulter için rotor ve nbsp;	-	Avanti J-26XP santrifüj
Rotoru JA 25.50	Beckman Coulter için rotor ve nbsp;	-	Avanti J-26XP santrifüj için rotor
Tecan infinite M200 çok plakalı okuyucu	Tecan Deutschland GmbH	-	ALP testi için çoklu plaka okuyucu
Thermocycler - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	-	PCR
TxRed - mikroskop filtresi	Floresan mikroskop için Keyence		Filtresi
Ultrafiltrasyon rejenere selüloz diskler 3 kDa	Merck KGaA	PLBC04310	amicon konsantre hücre 400ml
Ultrafiltrasyon rejenere selüloz diskler 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	amicon konsantre hücre 400ml ile kullanılır