Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından
Bu makalede
Özet
Özet
Uzun kemik defektleri sigara şifa tedavisi için farklı tedavi stratejileri yoğun bir şekilde araştırdık. Tedaviler mevcut Biyomalzeme kemik morfogenetik proteinler (BMP) gibi Osteojenik büyüme faktörleri ile birlikte kullanımı yol açmıştır bazı sınırlamaları kullanılmakta. Yaygın olarak kullanılan emme veya saklama yöntemleri BMP2, genellikle birkaç ciddi olumsuz yan etkileri kışkırtır bir sözde ilk patlama yayın etkisi sonucu supra fizyolojik miktarda gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için strateji kovalent protein için iskele çift olacaktır. Ayrıca, bağlantı site belirli bir şekilde bir tekrarlanabilir ürün sonuç sağlamak için yapılmalıdır. Bu nedenle, biz bir yapay amino asit (propargyl-L-lizin) kodon kullanımı genişletme (BMP2-K3Plk) tarafından BMP2 protein olgun parçası tanıtıldı bir BMP2 değişken oluşturdu. BMP2-K3Plk functionalized boncuk bakır katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC) ile birleştiğinde. Eşleşmiş BMP2 K3Plk biyolojik aktivitesini vitro kanıtlanmış oldu ve BMP2-K3Plk-functionalized boncuk Osteojenik etkinlik tabanlı hücre deneyleri kanıtlanmış oldu. C2C12 hücreleri ile temas functionalized boncuk boncuk yerel olarak kısıtlı bir mesafede alkalen fosfataz (ALP) ifade ikna edebildik. Böylece, bu tekniği ile functionalized iskele üretilebilir hücre farklılaşması Osteojenik bir soy doğru tetikleyebilir. Ayrıca, alt BMP2 dozlarda eşleşmiş BMP2 site yönettiği kontrollü yönelimi nedeniyle yeterlidir. Bu yöntemle, BMP her zaman onların reseptörleri hücre yüzeyi uygun yönde hangi faktörler site yönettiği kaplin teknikleri ile birleştiğinde Eğer durum böyle değil maruz kalır. Ürün sonucu çok kontrol edilebilir ve böylece, malzeme homojen özellikleri, onların uygulanabilirliği kritik boyutu tamiri için iyileştirilmesi ile sonuçlarında kusurları kemik.
Giriş
Kemik doku Mühendisliği ve kemik rejenerasyonu nihai hedefi dezavantajları ve sendikasız kırıklar ortak tedaviler sırasında ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden gelmektir. Her ikisi de birkaç dezavantajları olsa bile otomatik veya allo nakillerine ağırlıklı olarak geçerli tedavi stratejileri kullanılır. İdeal kemik grefti osteogenesis osteoindiksiyon yanı sıra osteoconduction, kemik greft osteointegrasyon için lider tarafından ikna etmek. Günümüzde, bir ideal kemik grefti tüm özelliklerinin sağladığı yalnızca otomatik nakli "altın standart" kabul edilir. Ne yazık ki, uzun cerrahi kez ve genellikle daha fazla komplikasyonlar (örneğin, kronik ağrı, Hematom oluş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. BMP2 değişken BMP2 K3Plk imalatı
- Klonlama, BMP2-K3Plk tarafından site yönettiği mutagenesis PCR kullanarak 12
- İnsan olgun BMP2 yükseltmek (hmBMP2) p25N-hmBMP2 vektöründen ( Tablo malzemelerigörmek) ile ileri bir astar (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') ve ters bir astar (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') tanıtan bir kehribar stop kodonu ( «««TAG) BMP2´s olgun bölümünün ilk lizin konumunda. Kullanarak 33,5 µL H2O, 10 µL PCR reaksiyon mix, 1,5 µL 10 µM dNTP hisse senedi çözüm, ileri astar (10 pmol/µL), ters astar (10 pmol/µL), p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) 1 µL 1,5 µL 1,5 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu makalede, kovalent bir yeni BMP2 değişken, BMP2-K3Plk, piyasada bulunan azid functionalized özel boncuk (şekil 1) çift için bir yöntem açıklanmaktadır. Üretilen BMP2-K3Plk değişken bioactivity alkalen fosfataz (ALP) gen ekspresyonu C2C12 hücrelerdeki indüksiyon tarafından doğrulandı. Vitro test benzer ALP ifade düzeyleri vahşi türü BMP2 tarafından indüklenen gösterir (BMP2-WT) ve BMP2-K3Plk (Şekil 2).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tagged protein değişik genetik kodon genişleme getirici birincil protein dizi herhangi bir konumundaki başta olmak üzere çeşitli doğal olmayan amino asit analogları giriş izin verir. 6-histidin (onun) etiketi yalnızca olabilir gibi BMP2 gibi BMP durumunda ortak Etiketler beri protein´s C-terminal sonuna Tersiyer protein yapısı içinde gömülü ve böylece dışarıdan erişilebilir değil N ölümcül, tanıttı. Diğer konumlarda tanıtılan etiket boyutunu çok büyük olasılıkla sonuç olarak BMP´s bioactivity tıkamak yapısal değişiklikle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Teşekkürler
Yazarlar Dr. M. Rubini (Konstanz, Almanya) pyrrolysyl-tRNA kodlama plazmid sağlamak için ve pRSFduet-pyrtRNAsynth karşılık gelen aminoasil tRNA sentetaz kodlama sağlamak için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > Malzeme< / güçlü > | |||
| 1 Adımlı NBT / BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Hücrelere çözelti ekleyin |
| 3-Azido-7-hidroksikumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal |
| Agaroz düşük erime noktası | Biozym | 840101 | ALP testi için agaroz ve nbsp; |
| Azide agaroz boncukları | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | |
| BamHI (Hızlı Sindirim enzimi) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriksiyon enzimi |
| BMP reseptörü IA (BMPR-IAEC) | >-- | -Laboratuvarımızda | üretilmiştir |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Boya | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Coomassie için kullanılan kimyasal SDS PAGE'in parlak mavi boyanması |
| Bakır (II) sülfat susuz (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Tıklama reaksiyonu için kullanılan |
| kimyasal DNA Polimeraz ve reaksiyon tamponu | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kiti |
| Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s ortamı (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Hücre kültürü ortamı |
| etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Tıklama reaksiyonunu durdurmak için kullanılan kimyasal |
| İzopropil ve szlig;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bakteri indüksiyonu (1mM nihai konsantrasyon) |
| NdeI (Hızlı Sindirim enzimi) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriksiyon enzimi |
| NHS ile aktive edilen Texas Red | Life teknolojileri | T6134 | Reseptöre bağlı |
| P-Nitrofenil Fosfat | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkalin Fosfataz |
| p25N-hmBMP2 | -- | - | Walter Sebald'dan J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA'ya | -- | -- | Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanmıştır |
| propargil-L-lizin (Plk) | -- | -- | Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanmıştır |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanan Qiagen |
| Jel Ekstraksiyon Kiti | Qiagen | 28704 | Jel Saflaştırma |
| Qiagen PCR saflaştırma Kiti | Qiagen | 28104 | PCR Saflaştırma |
| Sodyum L-askorbat | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal |
| T4 DNA Ligaz | ThermoScientific | EL0011 | Ligasyonu |
| tris (3-hidroksipropiltriazolilmetil) amin (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal |
| 4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Katalog Numarası | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon konsantre hücre 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Konsantre ünitesi |
| Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri | Merck KGaA | UFC901024 | Konsantre santrifüj ünitesi |
| & Auml; KTA avant FPLC | Ä KTA | - | FPLC makinesi |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Bakteri kültürü için santrifüj |
| Bakteriyel Çalkalama İnkübatörü | Infors Bakteri | Çalkalama inkübatörü | |
| FluorChem Q sistemi | proteinsimple | -- | SDS-PAGE için görüntüleme ve analiz sistemi |
| Floresan miskroskop | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel & reg; EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | İyon Değişim Kromatografisi kolon malzemesi |
| Greiner CELLSTAR® 96 kuyulu plakalar | Sigma | M5811-40EA | Hücre kültürü için 96 kuyulu plakalar (ALP Testi) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | - | Santrifüj |
| M-20 Mikroplaka Sallanan Kova Rotoru | ALP boyama sırasında plaka için Mikrosantrifüj için | ThermoScientific | 75003624 |
| Mikrosantrifüj - 5417R | Eppendorf | - | Santrifüj |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | - | ALP tahlil verilerinin statik analizi için yazılım |
| Polisin Slaytlar | ThermoScientific | 10143265 | mikroskop slaytları |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | - | Avanti J-26XP santrifüj |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter için rotor ve nbsp; | - | Avanti J-26XP santrifüj |
| Rotoru JA 25.50 | Beckman Coulter için rotor ve nbsp; | - | Avanti J-26XP santrifüj için rotor |
| Tecan infinite M200 çok plakalı okuyucu | Tecan Deutschland GmbH | - | ALP testi için çoklu plaka okuyucu |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | - | PCR |
| TxRed - mikroskop filtresi | Floresan mikroskop için Keyence | Filtresi | |
| Ultrafiltrasyon rejenere selüloz diskler 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | amicon konsantre hücre 400ml |
| Ultrafiltrasyon rejenere selüloz diskler 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | amicon konsantre hücre 400ml ile kullanılır |
Kaynaklar
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
