Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

15K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56627

⸱

5 Ocak 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, Department of Animal, Plant and Soil Science, School of Life Science, La Trobe University, 2School of Biological Sciences, Flinders University, 3ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, University of Western Australia

Bu makalede

Özet

Mitokondri bitki hücre sadece küçük bir yüzdesi olarak, onlar çalışmalar bir dizi için saf gerekir. Mitokondri bitki organları çeşitli Homojenizasyon, son derece saf mitokondriyal kesir elde etmek için Diferansiyel ve yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından takip tarafından ayrılmış olabilir.

Özet

Mitokondri temel organelleri tesislerinde, en önemlisi adenozin trifosfat (ATP) oksidasyon Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin gibi azaltılmış bileşiklerin üretimi çok sayıda metabolik yollar yer vardır dinükleotit (FADH2). Arabidopsis thaliana genomunun tam ek açıklama olarak en yaygın olarak kullanılan bitki modeli sistemi ve böylece mitokondri organları (yaprak, kök veya çiçek) çeşitli arındırmak gerek dolu araçları kullanmak için gerekli olan kurmuştur bu Artık Arabidopsis mitokondrial Biyoloji eğitim kullanılabilir. Mitokondri homojenizasyon yaklaşımlar, daha fazla sürekli kolloidal yoğunluk gradient kullanarak saf bir ham mitokondrial Pelet üreten fark Santrifüjü adımlar bir dizi tarafından takip çeşitli kullanarak doku tarafından izole Santrifüjü. Kolloidal yoğunluk malzeme daha sonra birden çok Santrifüjü adımı tarafından kaldırıldı. 100 g taze yaprak doku başlayarak, 2-3 mg mitokondri rutin olarak elde edilebilir. Bu mitokondri solunum deney 100-250 nmol O2 dk-1 mg toplam mitokondrial protein-1 (NADH bağımlı oranı) tipik oranları hangi belirlemek için çeşitli yüzeyler ve inhibitörleri kullanma yeteneği ile görüntüleme yüzeylerde okside ve alternatif ve sitokrom terminal oxidases kapasitesi. Bu iletişim kuralı mitokondri Arabidopsis thaliana yaprakları sürekli kolloidal yoğunluk gradyanlar ve arıtılmış bitki mitokondri verimli bir solunum ölçümleri kullanarak üzerinden bir yalıtım yöntemini açıklar.

Giriş

Bitki mitokondrial araştırma tarihinin 100 yıl1döner. Sağlam mitokondri ilk 1950'lerin başında izole fark Santrifüjü kullanarak. 1980'lerde kolloidal yoğunluğu Gradyanda gelişiyle mitokondri ozmotik ayarlama suffering olmadan saf izin. Degrade arıtılmış mitokondri kütle spektrometresi, duyarlılık nedeniyle çoğu amaç için uygun olmakla birlikte bile nispeten küçük kirletici maddeleri tespit edilebilir ve uygunsuz bir şekilde mitokondrial konumu2atanabilir. Plastidic her ikisi de kaldırmak kullanımı serbest akışını Elektroforez can ve akış peroxisome kirlenme3, ama özgür Elektroforez alanında son derece uzman bir teknik ve çalışmaları büyük çoğunluğu için gerekli değildir. Ayrıca, ne zaman olması gerekir bir protein konumunu belirleme bu çift veya birden çok hedefleme proteinlerin hatırladı hücrelerinde oluşur. 100'den fazla çift hedeflenmiş proteinler kloroplast/plastitler ve mitokondri4ve çok sayıda mitokondri için hedeflenmiş proteinler için açıklanan ve tanımladıkları da5bilinir. Ayrıca, yeniden yer altında belirli uyaranlara, örneğin oksidatif stres, proteinlerin hücre biyolojisi6' gelişmekte olan bir temadır. Böylece, proteinler konumunun biyoloji eğitimi bağlamında dikkate alınması gerekir ve yaklaşımlar çeşitli belirlemek ve konumu2doğrulamak için kullanılır.

Mitokondri homojenizasyon tarafından bitki dokulardan genellikle izole, mitokondri serbest bırakmak için hücre duvarı açık kırma ve mitokondri zarar değil arasında bir denge gereklidir. Geleneksel olarak, patates ve karnabahar, etkinliğini korumak için çeşitli bileşenleri ile bir arabellekte bir sıvı özü yapmak ev blender/meyve sıkacağı cihazları kullanarak homojenizasyon içerir. Mitokondri bezelye yaprakları, düşük yalıtım (genç fidan (~ 10 gün eski), kullanarak mitokondrial yalıtım için popüler bir malzeme yaprak malzeme yumuşak olduğu gibi hücreleri parçalayıcı bir blender kullanır. Arabidopsis thaliana T-DNA insertional knock-out satırları durumu ile fonksiyonel çalışmalar yürütmek için mitokondri arındırmak için ihtiyaç mitokondri yaprak, kök veya çiçek yalıtmak için yöntem geliştirme gerektirdiği doku. Genel olarak diğer bitkiler için geliştirilen yöntemler iyi7, optimize için gerekli olan malzeme taşlama ikramiye ile çalıştı. Arabidopsis için bu çeşitli şekillerde (aşağıya bakınız) elde edilebilir ve doku türleri (kök sürgün karşı) arasında farklılık gösterir. Sürekli degrade kullanımı da farklı organları üzerinden mitokondri yoğunluğu olarak optimize edilebilir ya da gelişim aşamalarında anlamına gelir onlar farklı geçirebilirsiniz. Böylece, en fazla ayrılması için degradenin yoğunluğu en iyi ayrılık ulaşmak için emin olmak için rafine olabilir.

Bir zamanlar saf mitokondri-ebilmek var olmak kullanılmış çalışmalar, protein, tRNA alımını deneyleri, enzim aktivitesi deneyleri, solunum zinciri ölçümleri ve Batı Leke analizleri de dahil olmak üzere çeşitli için. İzole mitokondri de protein bereket kütle spektrometresi analizleri için kullanılabilir. Hedeflenen birden çok tepki (MRM) analizleri izleme sağlayan miktar için proteinler tanımlanmış, ancak önemli tahlil geliştirme gerektirir. Buna ek olarak, miktar Dimetil veya diğer izotop etiketleri8, roman biyolojik anlayışlar ortaya çıkarmak için kullanılan tüm Proteom arasında farklılıklar belirlenmesinde bir keşif yaklaşım sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu iletişim kuralı üzerinden sürekli kolloidal yoğunluk gradyanlar kullanarak topraklarında yetişen Arabidopsis thaliana organları bozulmamış mitokondri yalıtım için kullanılır. Tüm yordamları malzeme topluluğu takip 4 ° C'de gerçekleştirilir

1. hazırlık orta, yıkama tamponu ve degrade çözümleri öğütme

  1. Orta (eksi askorbat ve sistein) ve Tablo 1 başına 2 x yıkama arabellek 200 mL bir gün önce yalıtım öğütme 300 mL hazırlamak, 4 ° C'de soğuk et
    Not: sodyum askorbat ve L-sistein (ücretsiz temel) bir son konsantrasyon 17.84 mM ve 20.36 mM, sırasıyla, tecrit sabahı taşlama orta ekleyin. Mitokondri kullanılacak ise Batı leke veya mavi yerli-polyacrylamide Jel Elektroforez (BN-sayfa) analizleri, 2 x yıkama arabellek BSA olmadan makyaj.
  2. Degradeler mitokondrial yalıtım (Resim 1 ve Tablo 1) sabahı hazırlayın.
    1. Ağır ve hafif degrade çözümleri içinde iki kadehler olun; 35 mL her iki degrade tüpler için yeterlidir.
    2. Chambers degrade dökücü ve PVC Peristaltik hortum deiyonize su ile yıkama ve üzerinden tüm boru boru ile bile akışı sağlamak.
    3. Degrade çözüm tüpler yan çalışan emin olmak için tüpler içine yer 2 santrifüj tüpleri (50 mL) PVC Peristaltik hortum çıkışları ile buz üzerinde hafif bir açıyla bantlanmış.
    4. İç ve dış chambers (siyah kolu aşağı) arasındaki bağlantıyı kapatın. Degrade dökücü bir manyetik karıştırıcı ile iç odası küçük heyecan barda yerleştirin.
    5. (Boru çıkışı olan odası) iç odasına 35 mL ağır degrade solüsyonu dökün. Yarım kalan kadar (300 mL/h) hızlı için ayarladığınız Peristaltik pompa fiyat ile buz üzerinde yerleştirilen iki santrifüj tüpleri içine ağır degrade çözüm dağıtmak.
    6. 35 mL ışık degrade çözüm dış Kamara (odası boru çıkış olmadan) içine dökün. Chambers (siyah itme kolu yukarı yarım) arasındaki bağlantıyı açın ve karışımı yavaşça çözümleri sağlar. Manyetik karıştırıcı kullanarak çözümler karıştırın.
    7. Yavaş çalışmasına çözümleri sağlar (60 mL/saat) kadar tüm degrade Mix reçete ikiye kaynaklanan odalarından 0 - % 4.4 (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) tüpler degrade dolgulu. Degradeler buz kadar adım 2.12 içinde kullanıma hazır tutun.
      Not: bir kez geçişin hazırlanmış olup, 2 x 1 x tutmak soğuk 4 ° C'de prechilled-deiyonize su ile yıkama orta sulandırmak

2. homojenizasyon ve mitokondrial yalıtım

  1. Bütün rozet doku makasla topraklarında yetişen 4 - hafta eski Arabidopsis bitkilerden kesmek, en az 80 bitkiler 1 hazırlıkları için gerekli olacaktır.
    Not: 10-14 gün eski su kültürleri, en az 5 tencere/prep veya 2 - hafta eski fidan Murashige & Skoog Bazal tuz karışımı (MS) Ağar kaplamalar üzerinde en az 4 plakaları, büyümüş de kullanılabilir.
  2. Önceden soğutulmuş 4 ° C büyük harç ve havaneli taşlama orta (Tablo 1) 75 mL ile küçük parçalar halinde kesilmiş oldu bitki materyali yarısı yerleştirin ve yoğun doku yok büyük parçalar terk edene kadar birkaç dakika için eziyet.
  3. Ön Orta taşlama ile filtrasyon malzemesi (22-25 µm gözenek boyutu) 4 kat ıslak ve filtrasyon malzemesi plastik huni 4 katmanları homogenate 500 mL konik şişesi filtre.
  4. Kalan yarısı orta öğütme başka bir 75 mL ile dokusunun eziyet.
  5. Filtrasyon malzemeleri homogenates birleştirmek ve mümkün homogenate kadar filtre.
  6. Orta, filtre yine 500 mL konik şişesi içine taşlama kalan 150 mL ile tekrar filtrasyon malzeme üzerinde kalan kalan doku eziyet.
  7. 8 önceden soğutulmuş 50 mL plastik santrifüj tüpleri 2500 x g 5 min için bir sabit açılı rotor 4 ° C'de, filtre uygulanmış homogenate santrifüj kapasitesi.
  8. Süpernatant temiz santrifüj tüpler içine dökün (50 mL; yeşil Pelet rahatsız edici önlemek) ve santrifüj 17.500 x g 4 ° c de sabit açılı rotor 20 dk için.
  9. Silmek tüm ama < süpernatant aspirasyon tarafından 3 mL (veya hafifçe kapalı Pelet bozmadan dökmek). Yavaşça Pelet küçük ince fırça kullanarak kalan süpernatant içinde resuspend.
  10. 1 yıkama arabellek x 10 mL her tüpün ekleyin ve 4 tüpler 1 temiz santrifüj tüpüne birleştirmek (yani, ortaya çıkan 2 tüplerde).
  11. Bu tüpler 50 mL 1 x yıkama arabelleğe ile doldurun ve adımları 2,7-2,9 tekrarlayın.
  12. Ham mitokondrial granül 1 içine bir damlalık kullanarak tüp ve ince fırça ile eşit olarak dağıtmak Havuzu (yıkama arabellek az miktarda kullanılmış olabilir ama son hacim az 3 mL degrade üstüne sığacak şekilde olması gerekir). Yavaşça mitokondrial süspansiyon 2 sürekli 0 - % 4.4 (w/v) PVP degradeler üzerine bir damlalık ile katman.
  13. Tüpler (1 x yıkama arabellek kullanarak) ağırlık denge ve 40 dk. aradan kapalı sağlamak için 4 ° C de 40.000 x g, santrifüj kapasitesi. Mitokondri tüp alt grup için göç edecek veya (bulutlu, sarımsı bir şeritle; tanımlanan tüp alt ağır çözüm bulunması Şekil 2).
  14. Dikkatli bir şekilde çözüm mitokondrial grup yukarıda üst 5 cm aspirasyon tarafından çıkarın.
  15. Mitokondri 2 temiz tüpler içine içeren kalan çözüm dağıtmak ve 1 x yıkama arabellek ile doldurun. Eşit kolloidal yoğunluk gradient ve mitokondri tüp plastik parafin film ile ağız kapsayan ve birkaç kez ters çevirme dağıt. Santrifüj 31.000 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika.
    Not: Santrifüjü önce mitokondri ve kalan kolloidal yoğunluk gradient eşit şekilde dağıtılır emin olun. Aksi takdirde, kolloidal yoğunluk gradient tüp alt kısmında konsantre ve mitokondri peletleme önlemek.
  16. Süpernatant aspirasyon, 1 x yıkama ile tüp ilâ 50 mL tampon ve tekrar karıştırma sağlamak için ters çevir'i dolgu kaldırın. Santrifüj 31.000 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika.
  17. Süpernatant Aspire edin ve küçük olarak içinde granül mitokondriyal bir pipet (İpucu sunarken artırmak için sona küçük bir kesik) değiştirilmiş 200 µL ipuçları ile kullanarak mümkün olduğunca bir birim (~ 500 µL) toplamak. Mitokondri 1,5 mL tüp içine yerleştirin ve almak için acele kullanma veya mağaza-80 ° C'de buz üstünde
    Not: mitokondri Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) için kullanılacaksa, BN-sayfa veya immunoblot analizleri, 1 x yıkama arabellek BSA olmadan son yıkama için (Yani, adım 2.15 ve 2,16) kullanın.
  18. Bradford yöntemini kullanarak mitokondri protein konsantrasyonu belirlemek.
    Not: BN-sayfa santrifüj aliquots 4 ° C ve mağaza Pelet-80 ° c kadar kullanım için. Oksijen tüketimi ölçülerini sadece taze izole mitokondri kullanılabilir.

3. oksijen tüketimi ölçümleri

Not: Oksijen tüketimi tarafından taze bitki mitokondri mitokondriyal intactness, sitokrom c yolu aktivite ve alternatif yol aktivite tayini etkinleştirme bir Clark-türü oksijen elektrodu ile analiz edilebilir izole.

  1. Yazılım yükleme
    1. Lisanslı oksijen izleme yazılımını oksijen tüketimi ölçümleri için kullanılan bilgisayara yükleyin.
  2. Solunum orta, yüzeylerde, kimyasal hisse senedi çözümleri ve Clark-türü oksijen elektrodu hazırlanması
    1. Oksijen tüketimi deneyleri için kullanılan solunum orta (300 mM Sükroz, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, % 0,1 (w/v) sığır serum albumin (BSA), 10 mM TES (pH 7.2)) hazırlayın.
    2. Yüzeylerde, inhibitörleri ve mitokondrial solunum (Tablo 2) ölçmek için kullanılan effectors hazırlayın. Bunlar daha önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de depolanan
      Not: pH 7,0 için organik asitler gibi asidik çözümler pH nötralize NaOH kullanmadan önce kullanma.
    3. Solunum Orta olarak tahlil Odası (25 ° C) olarak aynı sıcaklık sıcak.
    4. Üretici protokolünde açıklandığı gibi Clark-türü oksijen elektrot bir araya getirin.
    5. 1 mL hava doymuş su (su hava doymuş şiddetle deiyonize su küçük bir miktar büyük bir konik şişeye sallayarak elde edilir) ölçüm odasına koyun. Karıştırıcı üzerinde geçmek için "Karıştırıcı hız" düğmesini tıklatın. "Tarih" düğmesini tıklatın ve 65 rpm karıştırıcı hızını ayarlar. Devam etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın. Stir suyu sürekli 25 ° C'de
  3. Oksijen elektrot kalibrasyon
    1. Tahlil Odası (25 ° C) olarak aynı sıcaklık kalibrasyonu için kullanılan su sıcak.
    2. Stabilize ve oksijen elektrot kalibre geçerli için bekleme.
    3. Oksijen elektrot kalibrasyon başlatmak için "Ayarla" düğmesini tıklatın, seçin "Sıvı faz kalibrasyon" ve sonra "Hava doymuş su."
    4. A yeni pencere-ecek açık (oksijen kalibrasyon (sıvı faz) - adım 1 / 5). Kalibre (elektrot denetim kutusunun bağlı olduğu kanalı) ve değişkenleri (küme için 25 ° C "odası sıcaklık" ve "Atmosferik basınç" 101.32 kPa) girmek için kanalı seçin. Tıkırtı "OK"devam etmek için.
    5. Sonraki karıştırıcı hızı (65 rpm) (Adım 2 / 5), kurulum adım ve devam etmek için "Tamam"'ı tıklatın.
    6. 5 adım 3, bir plato ulaşmak işaretimi bekleyin. Dönem "Yaylası, devam etmek için Tamam tuşuna basın ulaştı" kutusunda görünecektir. Devam etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
    7. 5 adım 4, 5 mg sodyum dithionite ekleyerek sıfır oksijen odasında kurmak. Devam etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
      Not: Bir düşüş oksijen konsantrasyonu izleme içinde görünür olmalı ve 0 ulaştırılması gerekmektedir.
    8. Kalibrasyon (Adım 5 / 5) son adımda, bir plato ulaşmak işaretimi bekleyin. Dönem "Yaylası, devam etmek için Tamam tuşuna basın ulaştı" kutusunda görünecektir. Devam etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
    9. "Kalibrasyon kalibrasyon kaydetmek için Kaydet"'i tıklatın. Yeni bir pencere açılacaktır. Oksijen denetimi kutusu için yeni bir ayar kaydetmek için onaylamak için "Tamam"'ı tıklatın.
      Not: başarılı kalibrasyon sonra etiketleme "oksijen (nmol/mL)" y ekseni üzerinde görünür.
    10. Kalibrasyon sonra uygun temizlik sağlamak için (en az 5 - 10 kez) odası su ile durulama tarafından ölçüm odası temiz. Yer 1 mL ölçme içine solunum orta odası ve oksijen tüketimi izleme doğrusal olana bir kaç dakikalığına equilibrate membran sağlar.
    11. İyi yamaç görebilmek için oksijen tüketimi izleme ölçeğini uyum. "Zoom XY" tıklayın ve değişkenleri girin ("Oksijen" küme 0 - 300 ve 0 - 45 dk "zaman ekseni").
  4. Mitokondrial bütünlük belirlenmesi
    1. Dalgıç açık 970 µL solunum hava doymuş orta tepki odasına ekleyin.
    2. (Toplam protein ihtiyacı hesaplamalarda sonradan dahil edilecek) mitokondri yalıtım sonra 30 izole µL mitokondri veya toplam mitokondrial protein 150 µg kararlı eklemek bir pipet ile kesilmiş bir ucu kullanarak tepki Odası'na.
    3. Mitokondrial süspansiyon bir manyetik karıştırıcı (65 devir/dakika) bar hava emdirmek-çözüm için 25 ° C'de kullanarak sürekli karıştırın.
    4. Odası pistonu ile mühür, oksijen tüketimini kaydetmek için "kaydı Başlat"'ı tıklatın ve oksijen tüketimi izleme (1-2 dk) stabilize etmek izin vermek.
    5. El ile 10 mM askorbat ve "önce deterjan" oranını elde etmek 5 min için 25 µM sitokrom c ekledikten sonra oksijen tüketim hızı belirler.
      Not: Ayrıca yüzeylerde, inhibitörleri ve effectors doğrudan izlemesinde etiketlemek için "Olay işareti Ekle" düğmesini tıklatın ve karşılık gelen etiket adı girin. Devam etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
    6. "Sonra deterjan" oranı vermek % 0.05 (v/v) deterjan ekledikten sonra 3 dk için el ile oksijen tüketim oranını belirler. Tıklatın "Durdurt."
    7. "Değişim oranları tablosu" düğmesini tıklatın. 2 imleçler grafik ekranda dikey çizgiler olarak görünür. ' I tıklatın ve oranı imleçler çifti izleme oranı aralığını tanımlamak için gerekli konumlara sürükleyin. Hızı aralığı sol oranı imleci kullanarak izleme boyunca taşıyın. Hızı aralığı kendisi doğru oranı imleci kullanarak ayarlayın. Sınıf başkanı bilgisayar yazılımı otomatik olarak oksijen oranı aralığı imleçler izleme boyunca taşıma sırasında iki imleçler arasındaki en uygun bir çizgi çizer.
    8. Sonra istediğiniz hızı aralığı ve pozisyon tanımlandığında, oranı 1 / 2 imleçler üzerinde sağ klik ile tabloya girin ve "Oranı tabloya ekleyin." seçin Oranı ana fiyatı tablosu üzerinde görüntülemek için onaylamak için "Ekle" düğmesini tıklatın.
    9. "Önce deterjan" oranı yüzde olarak ifade edilen "sonra deterjan" oranına göre bölerek mitokondrial bütünlük hesaplamak ve 100 çıkarın.
  5. Mitokondrial solunum belirlenmesi
    1. Dalgıç açık hava doymuş solunum orta 970 µL tepki odasına ekleyin. 500 µM ATP ve 30 izole µL mitokondri veya 150 µg toplam mitokondrial proteinin solunum orta tepki odasında kesilmiş bir ipucu ile bir pipet kullanarak ekleyin.
    2. Manyetik karıştırıcı (65 devir/dakika) bar 25 ° C'de kullanarak sürekli mitokondrial süspansiyon karıştırın
    3. Dalgıç kapatın, oksijen tüketimini kaydetmek ve oksijen tüketim hızı (oksijen tüketimi izleme doğrusal olduğunda) stabilize etmek için 1-2 dk bekleyin "kaydı başlatmak"'ı tıklatın. 5 mM süksinat ekleyin. Kayıt oranı oksijen tüketimi yaklaşık 2 dakika.
      Not: Ayrıca yüzeylerde, inhibitörleri ve effectors doğrudan izlemesinde etiketlemek için "Olay işareti Ekle" düğmesini tıklatın ve karşılık gelen etiket adı girin. Devam etmek için "Tamam" düğmesini tıklatın.
    4. 1 mM adenozin nükleotittir (ADP) ekleyin. 2 min için oksijen tüketim hızı kayıt devam etmek.
    5. 1 mM NADH ekleyin. 4-8 dk için oksijen tüketim oranını kaydedin. Bu oran solunum yolu ile sitokrom oksidaz kapasitesidir.
    6. 1 mM potasyum siyanür (KCN) (2.5 µM myxothiazol ya da 5 µM antimycin A) sitokrom c yolu etkisizleştirmek için ekleyin ve yaklaşık 2 dakika oksijen tüketimi alternatif oksidaz ile gözlemlemek kaydetmek devam edin.
    7. 5 mM dithiothreitol (DTT) ve tam olarak alternatif oksidaz etkinleştirmek için 10 mM pyruvate ekleyin. 5-7 dk için kaydetmeye devam etmek: Bu alternatif oksidaz kapasitesidir.
    8. 500 µM n-propil gallat (nPG) ekleyin ve 2 min için kayıt. Bu kimyasal inhibe olamaz kalan oksijen tüketim oranını değerlendiriyor. Kökenli mitokondrial olma olasılığı olmadığından bu oran diğer oranları kaydedildi, çıkarma. Hala sitokrom c ve AOX yolu (KCN ve nPG tarafından) inhibisyonu sonra meydana gelen oksijen tüketimi peroxidases izole mitokondri9' kirleticiler mevcut gelmek muhtemeldir.
    9. Tıklatın "Durdurt."
    10. "Değişim oranları tablosu" düğmesini tıklatın ve bir iki imleçler üzerinde sağ klik ile tabloya oranı girin ve "Tablo Ekle oranı" seçin. Oranı ana fiyatı tablosu üzerinde görüntülemek için onaylamak için "Ekle" düğmesini tıklatın.
      Not: Otelde effectors ekleme Çözünmüş organik çözücüler (örn., antimycin A, nPG, myxothiazol), Oda ve dalgıç etanol ile durulanır ve sonra uygun temizlik sağlamak için su.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralını kullanan, biz farklı mitokondrial proteinler SDS-sayfa ve immunoblotting tarafından tespit edebildik. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi su kültürü dokusundan izole protein zayıf bant (2 µg) tespit etmek yeterli olur. Sinyal şiddeti orantılı olarak yüklü miktarda artırır. Mitokondri plakaları (şekil 3B), yüksek ışık stres yanıt büyümüş dokulara gelen izole için farklı genotip tedavisinde alternatif oksidaz anti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

5 mg dan büyük verim kez ayrıntılı zımpara ile elde edilebilir genellikle, mitokondri Arabidopsis üzerinden işlemleri olan mitokondri 3 mg kadar verimleri yaklaşık 80-100 3 - 4 - hafta eski bitkiler, bırakır ancak. Verim büyüme koşullarına ile değişiklik gösterebilir ve mitokondri yapısı yaşlanma9sırasında bakımlı görünüyor olsa da senesce, gider önemli ölçüde azalır. İyi bir verim elde etmek için en önemli özelliklerine mitokondri serbest bırakmak hücrelere koşullar için bileme yöntemidir. Mekani...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çatışma bildirin.

Teşekkürler

Bu çalışmada bir Avustralya Araştırma Konseyi mükemmellik merkezi olarak bitki enerji Biyoloji CE140100008, bir Avustralya Araştırma Konseyi gelecek Bursu (FT130100112) MWM ve Feodor Lynen araştırma bursu (Alexander von Humboldt tarafından desteklenmiştir Vakfı, Almanya) JS için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ADPSigma-AldrichA2754Kimyasal
AntimisinA Sigma-AldrichA8674Kimyasal,
Tom Elthon Elthonve ark., 1989
AskorbatSigma-AldrichA0157Cucurbita sp.'den Askorbat Oksidaz
ATPSigma-AldrichA26209Kimyasal
Sığır serum albümini (BSA)BovogenBSAS 1.0
Kimyasal Berraklık batı ECL substratıBio-Rad Laboratuvarları1705061Kimyasal
Kriter Lekesiz Prekast Jeller %8-16 18 WellsBio-Rad Laboratuvarları5678104Kimyasal
SiyanürSigma-Aldrich60178kimyasal
Sitokrom cSigma-AldrichC3131Kimyasal
Difco Agar, granülBD Biosciences214530Kimyasal
DithiotreitolSigma-AldrichD0632Kimyasal
EDTA disodyum tuzuSigma-AldrichE5134Kimyasal
Gamborg B-5 Bazal OrtaAustratecG398-100LKimyasal
Gamborg Vitamin Çözeltisi (1000x)AustratecG219-100MLKimyasal
Keçi Anti-Fare IgG (H + L)-HRP KonjugeBio-Rad Laboratuvarları1706516-2mlKimyasal
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)-HRP KonjugeBio-Rad Laboratuvarları1706515-2mlKimyasal
L-SisteinSigmaC7352-100G
Kimyasal Magnezyum sülfatSigma-Aldrich230391Kimyasal
Murashige & Skoog Bazal Tuz Karışımı (MS)AustratecM524-100LKimyasal
MiksotiyazolSigma-AldrichT5580Kimyasal, etanol içinde çözün
NADHSigma-AldrichN8129Kimyasal
Ndufs4 antikoruEtienne Meyerve diğerleri, 2009
n-Propil gallatSigma-AldrichP3130Kimyasal, etanol içinde çözün
PercollGE Healthcare17-0891-01Kimyasal, kolloidal yoğunluk gradyanı
Polivinilpirolidon (PVP40)Sigma-AldrichPVP40Kimyasal
Potasyum siyanürSigma-Aldrich60178
Kimyasal Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Kimyasal PiruvatSigma-AldrichP2256
Kimyasal Sodyum klorürChem-SupplySA046Kimyasal
Sodyum ditiyonitSigma-Aldrich157953Kimyasal
Sodyum L-askorbatSigmaA4034-100GKimyasal
SüksinatSigma-AldrichS2378Kimyasal
SükrozKimyasal TedarikSA030Kimyasal
TESSigma-AldrichT1375Kimyasal
Tetrasodyum pirofosfat (Na4P2O7 · 10H2O)Sigma-Aldrich221368Kimyasal
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitroselüloz TransferKiti Bio-Rad Laboratuvarları1704271Kimyasal
Triton-X 100Sigma-AldrichX100Kimyasal, deterjan
Batı Bloke ReaktifiSigma11921681001Kimyasal
DengeMettler ToledoXS204Ekipman
BeherleriIsolab50 mL
SantrifüjBeckman CoulterAvanti J-26XP
Ekipman Santrifüj tüpleriNalgene3117-9500
Ekipman SirkülatörüJulabo1124971Bağlı oksijen elektrot odası
Konik şişeIsolab500 mL
Damlalık3 mL
Sabit açılı rotorBeckman CoulterJA25.5Ekipman
HunisiAlimentibaşına 14 cmFiltreleme için
Degrade dökücüBio-Rad165-4120Degradelerin hazırlanması için
Manyetik Karıştırıcı ATEVELP ScientificaF20300165Ekipmanları
MiraclothVWREM475855-1RFiltrasyon malzemesi
Harç ve havaneliJamie OliverGranit, 6 İnçEkipman
O2viewHansatech InstrumentsOksijen izleme yazılımı
Oxygraph Plus SistemiHansatech Instruments1187253Clark tipi oksijen elektrodu
Boya fırçasıSanatçının ilk tercihi1008R-12
ParafilmBemisPM-996plastik parafin filmi
Peristaltik pompaGilsonF155001Degradelerin hazırlanması için
PVC peristaltik boruGilsonF117930Degradelerin hazırlanması için
Su banyosuVELP ScientificaOCBEkipmanları
içinde çözülür.

Kaynaklar

  1. Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
  2. Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
  3. Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
  4. Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
  5. Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
  6. Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
  7. Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
  8. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
  9. Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
  10. Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
  11. Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
  12. Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
  13. Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
  14. Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
  15. Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
  16. Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Mitokondri İzolasyonuDiferansiyel SantrifügasyonKolloidal Yoğunluk GradyanıBitki Dokusu HomojenizasyonuMitokondri Peleti SaflaştırmaOksijen Tüketim AnaliziSubstrat Oksidasyon AnaliziAlternatif Oksidaz Yolağı
Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.