Yöntem makalesi

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

DOI:

10.3791/56628

⸱

2 Mart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve neurite çıkıntı kez nöropsikiyatrik hastalık tedirgin gibi nörogelişimsel işler. Böylece, biz hızla ve tekrarlanarak insan IPSC kaynaklı NPCs bu nörogelişimsel işlemlerde değerlendirmek için protokolleri mevcut. Bu iletişim kuralları da ilgili büyüme faktörleri ve tedavi etkileri NPC gelişimi üzerine bir değerlendirme sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan beyin gelişimi işlemleri kesin bir şekilde düzenledi, daha önceki aşamaları yayılması, geçiş ve neurite çıkıntı tarafından ayırt edici ile bir dizi devam eder; ve daha sonraki aşamalarında axon/dendrite çıkıntı ve synapse oluşumu ile karakterize. Nörogelişimsel bozukluklar, sık sık bir veya daha bu süreçlerin, anomalileri beyin oluşumu ve fonksiyon önde gelen alt üst. İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisinin ortaya çıkmasıyla, araştırmacılar Şimdi sinir hücreleri de dahil olmak üzere hemen her hücre tipi, ayrıştırılan insan hücreleri bir bol kaynağı var. Bu hücreler normal beyin gelişimi ve hastalık patogenezinde eğitim için kullanılabilir. Bir dizi ölümcül nöropsikiyatrik hastalık kullanım modeli için hiPSCs kullanarak Protokolü sinir hücreleri ayrıştırılan veya 3D kültür sistemleri kullanmak organoids olarak adlandırdığı. Bu yöntemler insan hastalık patogenezinde okumak çok değerli kanıtlanmış olsa da bazı dezavantajları vardır. HiPSCs nöronlar içine farklılaşma ve organoids nesil deneyler ve tespit edilebilir değişkenler sayısını etkileyebilir uzun ve pahalı işlemler vardır. Buna ek olarak, sonrası Mitotik neurons ve organoids dendrite çıkıntı ve synaptogenesis, gibi işlemlere, hastalığı ile ilgili çalışma izin verirken yayılması ve göç gibi önceki işlemler çalışma engel. Otizm gibi nörogelişimsel bozukluklar genetik ve öldükten sonra kanıt erken gelişimsel süreçleri hataları gösterir. Sinirsel öncül hücreleri (NPC), son derece proliferatif hücre nüfus, hangi ontogenetik süreçleri ve hastalık başlatma hakkında soru sormak uygun bir model olabilir. Biz şimdi fare ve sıçan kortikal kültürlerinde insan NPCs için geliştirme eğitim öğrenmiş metodolojisi uzatmak. NPC kullanımı hastalığı ile ilgili fenotipleri araştırmak ve ne kadar farklı değişkenleri (örneğin, büyüme faktörleri, uyuşturucu) etkisi gelişimsel süreçleri yayılması, geçiş ve farklılaşma sadece bir kaç gün içinde de dahil olmak üzere tanımlamak için bize izin verir. Sonuçta, bu araç grubu tekrarlanabilir ve yüksek üretilen iş bir şekilde hastalığa özgü mekanizmaları ve nörogelişimsel bozukluklar fenotipleri tanımlamak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanımı basit organizmalar ve fare modelleri temel beyin gelişimi hem de hastalık patogenezinde mekanizmaları aydınlatılmamıştır. Tüm bulgular sade organizmalarda doğrudan insan hastalık karmaşık yönlerini ilgilidir çünkü bu gelişmeler rağmen birçok nöropsikiyatrik bozuklukların etiyolojisi zor kalır. Ayrıca, insan beyninin büyük karmaşıklığı kez model insan gelişimi için zor hale getirir ve hayvanlarda bozuklukları. Evrim ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) teknoloji ilerleme ile somatik hücre kök hücre yeniden programlanan ve insan hastalık çalışmaya nöronal hücrelere ayrılır. HiPSCs ve "omic" teknolojileri (genomik, transcriptomics, proteomik, metabolomics) gelişmeler insan beyin gelişimi anlayış bir devrim söz veriyorum. Bu teknolojiler şimdi "hassas tıp" yaklaşımı için ayrı ayrı tarafından nöropsikiyatrik hastalık karakterizasyonu mümkün olun.

HiPSC hastalığı-modelleme alanındaki geçerli elyaf hücreleri belirli nöronal alt türlerinden bir monolayer içine ayırt etmek için ya da beyin geliştirme1,2yönleriyle özetlemek için bir organoid olarak adlandırılan bir 3D kültür sistemi kullanmak için. 3. Bu sistemleri eğitim ve insan gelişimi ve hastalık4,5,6,7benzersiz özelliklerini ortaya çıkarılması son derece değerli olmuştur. Çalışmaya hazır olduklarını önce ancak, nöronal kültür ve organoids kez herhangi bir hafta sonra ay kültür gerektirir. Bu protokoller ve bu kültür sistemleri kez gerçekleştirilen deneyler sayısı ve büyüme faktörleri ya da uyuşturucu) (gibi test edilebilir değişkenlerin sayısını sınırlamak sürdürebilmek için ihtiyaç duyulan kaynakların miktarı zaman alıcı doğası. Ayrıca, birçok çalışma sonrası Mitotik neurons ve organoids kullanan dendrite çıkıntı veya synapse oluşumu gibi daha sonra gelişme meydana süreçleri üzerinde odaklanmıştır. Bu işlemler içinde gelişimsel bozukluğu otizm ve şizofreni gibi patoloji karıştığı olmuştur iken, daha önce daha önce kesin Nöronal Farklılaşma meydana gelen gelişimsel olayları da hastalık patogenezinde8 için önemlidir ,9,10,11,12,13. Nitekim, son genomik çalışmalar yayılması, işlem yapılan ve geçiş oluşur, orta-fetal dönem otizm Patogenez11,14' te özellikle önemli olduğunu gösteriyor. Böylece, çalışma nöral kök ve progenitör hücre popülasyonlarının önceki bu işlemleri daha iyi anlamak için önemlidir. İnsan beyin gelişimi daha iyi düşünülmüş özetlemek kendi 3D doğa ve organize yapısı nedeniyle, Organoid sistemleri, bazı bu önceki olayların eğitim için kullanılan bir progenitör havuzu içermektedirler. Ancak, organoids atası popülasyonda sık sık seyrek ve daha fazla Radyal gliyal hücreler nöral kök veya progenitör hücre5,15gibi. Böylece, açıkların bir aktif proliferatif hücre nüfus erken dönemlerinde çalışmaya yüksek aktarım yöntemi faydalı olacaktır.

Laboratuarda, sinirsel habercisi hiPSC elde edilen hücreleri (NPC), yayılması, hücre göç, gibi nörogelişimsel süreçleri çalışmaya son derece proliferatif nöral kök ve progenitör hücre karışık nüfus kullanan bir iletişim kuralı oluşturduktan ve ilk işlem (neurite) uzantısı. Bu deneyleri laboratuarımıza yıllardır başarıyla açıkların fare ve fare kortikal kültürler16,17,18,19,20eğitim için kullanılan teknik geliştirilmiştir, 21,22,23. Önemlisi, bu da fenotipleri ve düzenleyici sinyaller fare ve fare kültür sistemlerinde tanımlanan etkin vivo içindegösteren değeri bu teknikleri16, , olan mekanizmaları son derece akıllı gösterildi 17,18,19,24. HiPSCs NPCs için ilk farklılaşma sonra bu yöntemler hayati gelişimsel süreçleri birkaç gün içinde çalışma izin. Bu yöntemler pek çok avantajı var: (1) onlar biraz karmaşık ekipman isteyen ve uygulamak çok kolay olan, (2) çok sayıda deneysel çoğaltır tekrarlanabilirlik sonuçları ve (3) hızlı onay için izin zaman, kısa bir süre içinde yürütülen Kültür değişkenleri kaplama matrisler, büyüme faktörlerinin etkileri ve ilaçların etkinliğini gibi hızla ve düşük maliyetle test edilebilir. Ayrıca, farklı gelişim süreçlerinin kritik düzenleyiciler olarak hücre dışı büyüme faktörlerinin rolü köklü avantajlarından yararlanın. NPCs doğrudan nükleer silahların yayılmasına karşı neurite çıkıntı ve hücre göç gibi teşvik etmek ve onlar kontrol koşullar19 ' belirgin değildir hataları tanımlama yeteneği geliştirmek bulduk gelişimsel sinyalleri seçin sinin , 25 , 26 , 27 , 28. aynı şekilde, çeşitli tedavi müdahalelerin etkinliğini test etmek için hassas tıp teknikleri benimsemeye güçlü bir cadde uyuşturucu değerlendirme kolaylığı sağlar. Böylece, bu iletişim kuralı bir yüksek işlem hacmi, tekrarlanabilir ve erken beyin gelişimi, hastalık patogenezinde ve büyüme faktörleri ve uyuşturucu olası yararlı etkilerini nörogelişimsel fenotipleri üzerinde çalışmak için basit metodoloji kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. güvenlik prosedürleri ve Biyogüvenlik kabini bakım

  1. Biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) güvenlik prosedürleri
    1. BSL-2 malzeme ile çalışma hakkında kurumun yönergeleri izleyin. Kurumun uygulamaları BSL-2 malzemeleri atmayın. Odalar ve BSL-2 malzemeler için kullanılan ekipman gösterir. Önlük ve eldiven dahil olmak üzere tüm kişisel koruyucu ekipman (PPE), giymek.
  2. Biyogüvenlik kabini bakım
    1. BSL-2 düzey malzeme kullanımı için sertifikalı bir biyogüvenlik kabine kullanın.
    2. Biyogüvenlik UV ışığında en az 15 dakikadır kabine açın ve sonra sprey yüzeyler ile % 10 çamaşır suyu çözüm. Çamaşır suyu çözüm 15dk için oturup, kabine silin ve hava akımı kullanmadan önce açmak için izin.
  3. Radyoaktif Tritiated [3H]-timidin (trityum) güvenlik prosedürleri
    Not: Tritium Kategori 5 radyoaktif kaynak, 'en muhtemel tehlikeli olmak ' Bu kategori. Radyoaktivite ile çalışmak için kurumun yönergeleri izleyin. Bazı kurumlar sertifikalar gerekebilir veya trityum işlemek için izin verir.
    1. Eğitim kurumundan nasıl düzgün idare ve trityum elden almak. Uygun kapları, radyoaktif atık kurumun ilkelerine göre atın. PPE Tridium ile çalışırken giyiyorum.

2. iPSCs üzerinden sinirsel indüksiyon

Not: NPCs yapmak, biraz değiştirilmiş sürüm bir piyasada bulunan sinir indüksiyon kit ile birlikte gelen bir protokolü takip etti. Ve bir 50 x 1 x sinirsel indüksiyon orta (NIM) yapmak için kullanılan Neural indüksiyon ek (NIS), Neurobasal (NB) medya kiti oluşur. NIS da % 100 yapmak için kullanılan genişleme orta (bkz. Bölüm 3.1). Malzeme ve ekipman ve referanslar bölümünde43yılında protokolü için bir bağlantı bulunur.

  1. Onlar % 70-80 birleşmesi olunca geçiş iPSCs.
  2. Plaka 300.000 iPSCs 1 de hESC tam içine ekstraselüler matrisi-kaplı jel (ECM-taklit jel) 6-şey plaka içeren besleyici-Alerjik IPSC orta 2 mL ROCK inhibitörü 5 mikron ile taklit. Bölüm 3.2 kaplama wells ECM-taklit jel ile ilgili yönergeler için bkz:.
  3. Bir gün sonra kaldırma IPSC orta + 1 x PBS ile ROCK inhibitörü ve yıkama iPSCs. NIM 2 mL iPSCs için ekleyin.
    Not: NIM 50 mL 50 NIS ve 250 µL (50 adet/mL, 5 μL/mL) penisilin/streptomisin (P/S) x 1 mL 49 mL NB medya ekleyerek yapılır.
  4. Değişim medya sinirsel indüksiyon 2 günde alıyorum tarafından orta ve NIM 2 mL ile değiştirme Konfluent haline hücreleri (yaklaşık 4-5 gün) kadar geçirdi. Hücreleri Konfluent bir kez medya günlük olarak değiştirin.
  5. Geçiş hücreleri NIM ve ECM-taklit jel plaka 7 gün sonra %100 genişleme medya ve 5 mikron ROCK inhibitörü 2 mL içeren 6-şey plaka kaplı. Hücreleri geçiş 0 (P0) olarak kabul edilir bu noktada NPCs. Aşağıda bölüm %3.1 100 genişleme medya yapmak talimatlar için bkz.
  6. Bölüm 3,4 içinde açıklanan yöntemleri kullanarak geçiş hücreleri. Hücreleri P2 ulaştı ve NPC işaretleri ve deneyler (şekil 1) kaplama için leke dissociating önce Konfluent kadar bekleyin.

3. Kültür medya, kaplama ve NPCs bakımından

  1. NPCs (% 100 genişleme medya) bakımı için medyası hazırlama:
    1. 50 mL % 100 genişleme medya DMEM/F12 24.5 mL NB 24.5 mL ile alabilrisiniz
    2. 50 x NIS 1 mL DMEM/F12 + NB çözüm ekleyin. P/S çözüm 250 μL ortamına ekle.
      Not: Medya buzdolabında (4 ° C) olabilir ve 2 hafta için kullanılan. Medya daha küçük hacimli DMEM birimleri ayarlayarak yapılabilir / F12 + NB + NIS 50 mL cilt gelince aynı oranları kullanarak.
  2. ECM-taklit jel hazırlanması kültür plakaları NPC bakım için kaplı.
    1. Aliquot ECM-taklit jel 6 mL çalışma çözeltisi için gerekli ses seviyesinde. Toplu iş toplu ve çok-çok ECM-taklit jel beri seyreltme faktörü analiz sayfası sertifika bakarak aliquot hacmi değişir hesaplayın.
    2. ECM-taklit jel aliquot buz çözme ve 6 mL soğuk DMEM/F12 medya geçiyoruz.
    3. ECM-taklit jel/DMEM/F12 çözüm 1 mL 6 iyi plaka her şey için ekleyin. 6-şey plaka ECM-taklit jel-37 ° C'de 30 dk için çözüm ile kuluçkaya
    4. ECM-taklit jel çözüm kuluçka 30 dakika sonra Aspire edin ve % 100 genişleme ortamı ile değiştirin veya tabak buzdolabında bekletin (4 ° C, 1 hafta kadar) olmadan ECM-taklit jel-çözüm alıyorum.
  3. NPCs bakımından
    1. Plaka NPCs 1.5 milyon hücre yoğunluğu bir ECM-taklit jel kaplı de 2 mL % 100 genişleme medya içeren içine at.
    2. %5 CO2ile nemli bir ortamda 37 ° C'de NPCs kuluçkaya.
    3. ROCK inhibitörü 5 mikron medyaya NPCs P3 veya daha düşük ya da aşırı hücre ölümü önlemek için çözdürülen NPCs ekleyin. Medya ROCK inhibitörü kaldırmak için 24 saat sonra değiştirin.
    4. Geçiş hücreleri Konfluent olduklarında üzerine bağlı olarak her 4-9 gün. Onlar tüm alt çanak yüzeyi kapsayan bir yoğun paketlenmiş monolayer olunca hücreler Konfluent düşünülür.
    5. 6-şey plaka bir kuyu başına 1 ila 1.5 milyon hücre yoğunluğu plaka NPCs (bkz. Bölüm 3,4). Harcanan medya her 48 h kaldırın ve 2 mL % 100 genişleme medya ile değiştirin.
  4. Asansör, ayırmak ve NPCs bakım ve/veya kaplama için deneysel koşullar cips
    1. Orta, yıkama hücreleri bir kez 1 x PBS ile Aspire edin. PBS Aspire edin ve Konfluent NPCs. Incubate 37 ° C'de 10 dakika için de 1 içine 1 x hücre dekolmanı çözeltinin 500 μL ekleyin
    2. Oda sıcaklığında (RT) PBS 500 μL ekleyin ve iyi bir P-1000 pipet hücreleri kaldırılmasını sağlamak için kullanarak yıkayın. Hücreleri + PBS çözüm 15 mL konik tüp içine toplamak. PBS 1 mL ile tekrar tabak yıkama ve tüp sıvı ekleyin.
    3. Hücreleri aşağı 300 x g cips 5 min için spin.
    4. Süpernatant hücre Pelet kaldır ve 1-5 mL Önceden ısıtılmış DMEM/F12 medya hücrelerde yeniden askıya alma. 1 ila 4 milyon hücre/mL ortamının yoğunluğu hücrelere sulandırmak. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri ölçmek.
    5. Hücreleri, özel NPC bakım (Kısım 3.3) ya da (daha fazla bilgi için sonraki bölümlere bakın) yürütülen tek tek tahlil için gerekli sayıda plaka.
    6. Hücre süspansiyon sesi ile kitle iletişim araçları arasında 15-100 μL hücre her şey/yemek için kullanılır böylece ayarlayın. Bu küçük kaplama birim var hatta hücre dağıtım ve büyüme faktörleri, uyuşturucu veya orta yüzeylerde değil seyreltilmiş sağlar.
    7. 37 ° C'de hücreler kuluçkaya Bireysel deneyleri belirli ayrıntılarını görmek veya medya her 48 h NPC bakım için değiştirebilirsiniz.
  5. Medya hazırlık için deneysel koşullar (% 30 genişleme medya)
    1. % 100 genişleme medya % 70 oranında seyreltik (% 30 olarak adlandırdığı genişleme) ekleyerek 1:1 DMEM/F12 + NB çözüm medya deneysel koşullar için yapmak.
    2. % 30 genişleme medya 20 mL 6 mL % 100 genişleme medya ekleyerek ve 7 mL NB ve DMEM/F12 medya 7 mL sulandrarak olun. 5 µL/mL P/S çözeltisi ekleyin.
      Not: %100 ortam P/S içeriyorsa, sonra 5 μL/mL kombine-DMEM için Ekle / F12 + NB (14 mL) = (5 μL/mL) x = P/S 70 μL 100µL yerine.
    3. Kaplama Substratları ve büyüme faktörleri % 30 genişleme medya için istenen konsantrasyonlarda ekleyin.

4. DNA sentezi, S-faz giriş ve NPCs sayıda hücre değerlendirilmesi

  1. DNA sentezi, S-faz giriş ve hücre sayı tahlil için hazırlık
    1. Poli-D-lizin (PDL) 1 mg/mL stok çözeltisi dH2içinde O yapmak ve filtre sterilize. 1:10 0,1 mg/mL PDL çözüm olun ve her şey 24 iyi plaka veya 35 mm çanak 1 mL 300 μL eklemek için dH2O sulandırmak. Dik, 20 dk için kuluçkaya
    2. PDL wells dH2O. aspiratı dH2O 5 min için 3 kez yıkayın ve 300 μL/iyi veya 1 mL/tabak 1 x PBS içinde seyreltilmiş laminin (5 μg/mL) ekleyin. Parafilm ile kuruyucu ve steril, bir biyogüvenlik gecede RT (12-24 h) kabine tutun.
    3. Sonra 12-24 h. Ekle araç, büyüme faktörleri veya istenen konsantrasyonu % 30 NIS sulandrarak önlemek için toplam çözüm daha az % 10 olan cilt olarak faiz ilaçların % 30 genişleme medya (bkz. Kısım 3.5) hazırlamak genişleme orta.
    4. Her yıkama 24-şey plakalı iki kez 1 x PBS (5 dk her), de. 1 x PBS Aspire edin ve medya (olmadan veya uyuşturucu/büyüme faktörleri ile) 450 μL ekleyin. Plaka için en az 15 dk. 37 ° C'de hücreler kaplama önce kuluçkaya.
    5. Her deneme için 2-3 Kuyu veya koşul başına yemekleri ayarlayın.
    6. Plaka NPCs (bkz. Bölüm 3,4):
    7. NPC DNA sentezi tahlil: 100.000 hücreler/24 bir iyi tabak içinde iyi
    8. S-faz giriş: 500.000 hücreler/35 mm çanak
    9. Hücre sayı tahlil: 50.000 hücreleri/24-şey tabak içinde iyi
  2. Sinirsel habercisi hücre DNA sentezi tahlil
    1. 100.000 hücreler/iyi bir 24-şey plaka plaka ve nüsha/durumu değerlendirmek.
    2. Eklemek radyoaktif, tritiated [3H]-timidin her iyi kültür 46 h sonra kültür ortamına (1.5 μCi/mL). Hücreler için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: radyoaktif malzemeler kullanılarak, eğitim kurumu, takip radyoaktivite güvenlik protokollerini ve uygun şekilde belirlenen atık kapları radyoaktif malzemelerin dispose alırsınız.
    3. Kaldırmak ve düzgün 2 h. eklemek 300 μL in % 0.25 tripsin-EDTA (0.5 mM) önceden ısındı sonra radyoaktif medya her kuyuya atın ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
    4. Hücre hasat açın (bkz: malzeme ve ekipman bölümü) ve pompa ve pompa basınç altında 200 PSI olduğundan emin olun. Hücre hasat uzayda filtre kağıdı yerleştirin ve kağıt yönlendirmesini işaretlemek için sağ köşedeki gözyaşı.
    5. Hücre hasat toplama tüpler boş bir "boş" tepsisine yerleştirin ve filtre kağıdı nemlendirmek için prewash basın. Toplama tüpler örnek kuyu yerleştirin ve (başlangıç) çalıştırın.
    6. Hücre hasat toplama örnekleri tamamlandığında, tüm örnek kümeleri için yinelemek için kelepçe ve önceden filtre kağıdı kaldırın. Her zaman boş, bir "boş" levha prewash.
    7. Filtre kağıdı bir ışık kaynağı altında kuru ve karşılık gelen şişeleri bir tepsi kurmak. Kağıt pusulaların tüpleri içine dışarı yumruk ve 2 mL sıvı mercek kokteyl her şişe ekleyin. Kapak ve etiket şişeleri.
    8. Sıvı mercek en az 1 h için kokteyl sayar / dakika (acentalar) bir mercek makinede okumadan önce şişeleri kuluçkaya.
  3. NPC S-faz giriş tahlil
    1. Asansör, ayırmak, cips ve hücreleri yeniden askıya alma Bölüm 3,4 adımları için bkz.
    2. Çanak başına 500.000 hücre içine Bölüm 4.1, sadece 1 çanak/koşul bu adım için hazırlanan 35 mm yemekler plaka.
    3. Yemekleri hücreler eşit dağılımı sağlamak için ileri geri her yöne tahrik. 46 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    4. 24 saat sonra durum PDL/Laminin ile kaplı üç 35 mm plakalar hazırlayın. Örneğin, % 30 genişleme medya bir 35 mm çanak ve bir 35 mm çanak % 30 genişleme medya + FGF ise (10 ng/mL) ertesi gün kullanmak için 6 PDL/Laminin plakaları kat.
    5. 2 μL/mL 5 mm EdU kültürler için 2 h 46 h. Incubate sonra ekleyin.
    6. Ayırmak ve (bkz. Bölüm 3,4) hücreleri cips. Hücre Pelet 3 mL % 30 genişleme medya veya % 30 genişleme medya + istenilen büyüme faktörleri/uyuşturucu 3 mL yeniden askıya alma.
    7. Tabak çanak önceden kaplanmış PDL/Laminin yemekleri başına 1 mL. Yemekleri hücreler eşit dağılımı sağlamak için ileri geri her yöne tahrik. Yemek için uygun hücrelere izin vermek 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. Basitleştirilmiş zaman çizelgesi için bkz: Şekil 2 .
  4. S-faz giriş analiz
    1. Yemekleri ile buz gibi %4 düzeltmek Paraformaldehyde (1 x PBS PFA) 20 dk için. Sonra 3 kez 1 x PBS ile 5 min için bulaşıkları yıkamak.
    2. 1 mL 1 x PBS % 0.05 ile ekleyin sodyum azid bakteriyel ve mantar büyüme önlemek için. Hücreleri saklanabilir 4 ° C'de 6 aya kadar (parafilm ile mühürlü) yemekleri tutulursa PBS + sodyum azid çözüm, yine de tüm immünolojik antijenleri iyi korunmuş analiz uzun gecikmeler sonra.
    3. Tahlil bir ticari EdU tepki kullanarak hücreleri (üretici Protokolü Bkz:) kit. Hücreleri DAPI veya başka bir nükleer işaretleyici kullanarak leke ve floresan mikroskopi kullanarak görüntü.
    4. EdU pozitif hücrelerinin oranı toplam canlı hücreleri (Toplam hücresini sayı) kör 10 sistematik olarak rasgele alan (10 x) üzerinden değerlendirmek. Ölü hücreleri analizde eklemeyin.
    5. Faz kontrast görüntüler ve floresan resim olumlu EdU boyama belirlemek ve ölü hücreleri tespit için veya canlı (şekil 3) kullanmaktadır.
    6. Bu hücreler vardır canlı olarak (şekil 3A-B), leke içeren tüm hücreleri her ikisi de düzgün sayısı ve hatta hücre zarı faz kontrast ayarlarında ve floresan DAPI nükleer tarafından büyük bir parçalanmamış çekirdek.
    7. Faz parlak olan tüm hücreleri dışlamak, kırık bir düzensiz hücre zarı var ve küçük, yoğun çekirdeği var gibi bu hücreler ölü olduğu gibi görüntüleme DAPI floresan tarafından (şekil 3A-B) görüntülenir. EdU ifade canlı hücreleri kapsayan tüm çekirdeği veya benekli floresan çekirdeğinde (şekil 3 c) Boyama leke parlak floresan EdU içeren hücreleri tespit ederek değerlendirmek.
  5. NPC hücre sayı tahlil
    1. 2 gün sonra kültür, etiket ve 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve 0.5 mL microcentrifuge tüpleri hazırlayın. Her 0,5 mL tüp Trypan mavi 5 μL ekleyin.
    2. Her şey bir 24 iyi plaka için orta kaldırın ve kuluçka için 10-15 dk 200 μL 1 x hücre dekolmanı çözümü ve yer ekleyin.
    3. Hücreleri kaldırdı sonra ayrılan süre sonra her şey için 1 x PBS istenilen miktarda ekleyin.
      Not: Genellikle, 2 günde 1 x PBS 300 μL de içeren hücreleri artı 200 μL dekolmanı çözeltinin 500 μL toplam hacmi için ekleyin. Hücreleri daha Konfluent olmak gibi ek kültür kuluçka süresi ile gerektiği şekilde seyreltme birim artırın. Örneğin, gün 4, 1 x PBS ve gün 6 500 μL ekleyin, 1 x PBS 800 μL ekleyin. Toplam birimleri 700 μL ve 1 mL, sırasıyla olacaktır.
    4. P-1000 pipet kullanarak, yukarı ve aşağı her iyi 4 hücreleri kaldırmak için 5 kere için pipet. Plaka tüm hücreleri ayırdıktan emin olmak için mikroskop altında incelemek. Hücreleri 1,5 mL tüpler için transfer.
    5. 1.5 mL tüpler seyreltilmiş hücreleri ile 2-3 kat tersine çevirin. Sonra 50 μL tüp ortasında hücre aliquot al ve Trypan mavi ile 0.5 mL tüpler için eklemek (4.5.1 bakın).
    6. Pipet hücre çözümü 2 3 kez yukarı ve aşağı. Hücreler için hemasitometre ekleyin ve hemen analiz edin. 10 dk hücre ölümü veya Trypan Mavi takım almış hücreler varlığı artırabilir daha uzun bekliyor.
    7. Dikkatli bir şekilde hücre + Trypan mavi karışımı 10 µL Çoğalt sayımları gerçekleştirmek için hemasitometre her tarafına ekleyin. Faz kontrast mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Ölü hücreleri veya Trypan Mavi takım almış koyu mavi hücreleri saymaz.
    8. Toplam hücresini sayı, kullanım ortalama almak için cep telefonu numarasını hemasitometre 4 köşesinden sayılır ve aşağıda ki formül uygulamak:
      Cep numarası medya hacmi (mL) x 10,000 x Yani toplam hücresini sayı/iyi =
    9. Aspire edin ve kalan wells yordamı yineleyin. Medya, her gün 4'te 48 h. tekrar tahlil ve 6 sayılır değil hücrelerde değiştirin.

5. NPC Neurite tahlil

  1. Yemekler ve medya Neurite tahlil için hazırlanması
    1. Poli-d-lizin (PDL) 1 mg/mL stok çözeltisi dH2içinde O yapmak ve filtre sterilize. 1:10 0,1 mg/mL PDL çözüm olun ve 1 mL her 35-mm çanak eklemek için dH2O sulandırmak. Dik, 20 dk için kuluçkaya
    2. Bu arada, % 30 genişleme medya (bkz. Kısım 3.5) hazırlamak ve medyaya 5 μg/mL (5 µL/mL) fibronektin çözeltisi (1 mg/mL stok) ekleyin.
    3. Bir kez medya hazırlanır, araçlar, büyüme faktörleri veya uyuşturucu ilgi istenen konsantrasyonları ekleyin.
      Not: Araç, büyüme faktörleri veya uyuşturucu, birimler eklemek en uygunudur < fibronektin ve diğer bileşenleri % 30 genişleme orta sulandrarak önlemek için toplam çözüm yüzde 10'u.
    4. 20 dk sonra 3 kez aşırı PDL kaldırmak için dH2O ile 5 min için PDL bulaşıkları yıkamak. Yemekleri medya eklemeden önce kuru olduğundan emin olun.
    5. Medya (veya uyuşturucu/büyüme faktörleri olmadan) + fibronektin çözüm 1 mL her PDL boyalı çanak yerleştirin.
    6. Yemekleri için en az 30 dk. 37 ° C'de hücreler fibronektin uygun ek PDL için sağlamak için kaplama önce kuluçkaya.
    7. Her deneme için koşul (örneğin, 3 araç içeren yemekleri, 3 uyuşturucu içeren yemekleri) başına 2-3 yemekleri ayarlayın.
  2. NPCs Neurite tahlil için kaplama
    1. Asansör, ayırmak, cips ve hücreleri resuspend Bölüm 3,4 adımları için bkz.
    2. Bölüm 5. 1'hazırlanan yemekler amacına başına plaka 50.000 hücreleri. Yemekleri hücreler eşit dağılımı sağlamak için ileri geri her yöne tahrik.
    3. 48 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  3. Neurites analizi
    1. Hücreler 48 h için kuluçka sonra Aspire orta ve yemekler buz ile soğuk %4 düzeltmek PFA 20 dk için.
    2. 20 dk sonra 3 kez 1 x PBS ile 5 min için bulaşıkları yıkamak. Son yıkama sonra 1 mL 1 x PBS % 0.05 ile ekleyin sodyum azid.
    3. Bulaşık sırası körü körüne faz kontrast mikroskop 32 X analiz. Toplam hücreleri ve neurites ama tekrarlanabilir pozisyonlar rastgele seçilmiş 3, 1 cm satırlardaki hücreleri saymak. Çanak yeterli örnekleme sağlamak için başına 150 hücre en az say.
      Not: Bir neurite olan hücre vücuttan bir uzantısı (işlem) olarak tanımlanır > 2 hücre gövde çapı uzunluğunda. Birden çok işlem içeren hücreleri için en uzun süreç için kriter olarak kabul edilir. Hücreleri olan işlemleri ile < 2 hücre gövde çapı uzunluğunda değildir dahil (şekil 4).
    4. Birlikte toplam hücreleri ve hücre neurites ile toplam sayısı her yemeğin ekleyin. Neurites içeren hücrelerin % hesaplamak. Neurites hücrelerle yüzdesi Çoğalt yemekleri arasında ortalama. Deneysel tekrarlanabilirlik güven kurulan her yemeğin içinde tüm satırları benzer ve ortalamalar yemekleri arasında son derece benzer, standart hata ortalamaya (SEM) ile < % 10.
    5. Alternatif olarak, immunocytochemistry beta-III-tübülin (TUJ1) gibi işaretleri yaparak neurites analiz veya MAP2. Faiz için marker boyama sonra 10 sistematik olarak rasgele görüntüler üzerinde floresan mikroskop 10 X al. Görüntü en az 200 hücreleri. Bu durumda, çanak kenarına çok yakın görüntüler elde etmek. TUJ1 veya MAP2 + neurites ( şekil 10 bir örnek için bkz) içeren hücrelerin yüzdesi analiz.

6. NPC Neurosphere geçiş tahlil

  1. Neurosphere oluşumu
    1. 1 mL % 100 genişleme medya yok kaplama yüzey ile bir 35 mm çanak içine ekleyin. Önce orada olduğundan emin olmak için 2-3 yemekleri NPCs. hazırlama kaplama hücre göç tahlil için yeterli neurospheres yemekleri için en az 15 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Bir kaplama substrat yokluğu NPCs neurosphere oluşumu için gerekli olan ortamda, askıda kalmasını sağlar. Kaplama yemekleri neurosphere oluşumunu engeller.
    2. Bölüm 3,4 merdivenlerinde kaldırın, ayırmak ve hücreleri cips için bkz. Hücre Pelet Önceden ısıtılmış %100 2-5 mL resuspend genişleme medya. Plaka 1 milyon NPCs Bölüm 6.1.1 hazırlanan her 35-mm çanak içine.
    3. 48-96 h NPCs toplamak ve formu neurospheres için izin vermek için 37 ° C'de NPCs kuluçkaya. Canlı bir cetvel üzerinde faz kontrast mikroskop kullanarak küre boyutunu değerlendirmek. Çoğu küreler 100 µm (± 20 mikron) yaklaşık bir çapı ulaşmak bekleyin (şekil 5). Daha küçük küreler tamamen dağıtmak ve geçiş tahlil sırasında parçalayın.
  2. Neurosphere geçiş tahlil için tabak hazırlanması
    1. (Bkz. Bölüm 3.2) ECM-taklit jel aliquots 6 mL % 30 genişleme medya geçiyoruz. ECM-taklit gel/30% genişleme medya çözüm hazırlanır sonra Araçlar, büyüme faktörleri veya uyuşturucu ve ilgi alanları istenen konsantrasyonları ekleyin.
      Not: Araç, uyuşturucu ve büyüme faktörü konsantrasyonları hesabına neurospheres Bölüm 6,3 içinde 200 µL eklenmesi için artırılması gerekiyor.
    2. Plaka ECM-taklit 1 mL jel /30% genişleme medya çözüm (± Araçlar, büyüme faktörleri veya uyuşturucu) 6-şey plaka bir kuyunun içine. Deneysel koşul başına 2-3 Kuyu olun. Alternatif olarak, 35 mm yemekleri kullanılabilir. Kaplamalar, en az 30 dk. 37 ° C'de. için kuluçkaya
      Not: ECM-taklit gel/30% genişleme medya çözüm bu tahlil için Aspire değil. Küre üzerine bir emişli ECM-taklit jel kaplama hızlı ve aşırı göç götürecek.
  3. Kaplama Neurospheres
    1. Bölüm 6.1 içinde oluşan neurospheres toplamak ve konik tüp içine koyun. 35 mm yemekleri ile 1 mL 1 x PBS tüm neurospheres emin olmak için toplanan yıkayın. Spin aşağı vasıl 100 x g 5 min için toplanan neurospheres.
    2. Neurospheres Önceden ısıtılmış %30 1-3 mL yeniden askıya alma genişleme medya. Neurospheres 1 fincan toplanan medya 1 mL küreler resuspend için kullanılır. 2 yemekleri toplanır, medya 2 mL küreler resuspend eklenir, vb yavaşça pipet ve küreler kırık değildir sağlamak için yalnızca bir P-1000 kullanın.
    3. Resuspended neurospheres 200 μL ECM-taklit gel/30% Bölüm 6.2 yapılan genişleme çözüm içine plaka. Rock plakaları her yöne eşit neurospheres dağıtmak için. Plakayı 37° c de 48 h için kuluçkaya
    4. ECM-taklit gel/30% genişleme medya çözümü kaldırmak ve hücreleri %4 PFA, yıkama ve 1 x PBS + % 0.05 hücrelerde tutmak düzeltmek sodyum azid.
  4. Neurospheres analizi
    1. Tüm neurospheres 10 X, faz kontrast ayarlarını kullanarak görüntüleri elde etmek. Küreler birbirlerine dokunuyorlar değil emin olun. Ortalama geçiş ImageJ yazılımını kullanarak ölçmek.
    2. Serbest Çizim aracını kullanarak neurosphere dış kontur takip et. Serbest Çizim "düz" çizgi simgesine sağ tıklatarak erişebilirsiniz. El ile bir fare kullanarak izleme.
    3. İzleme alanı hesaplamak için ölçü işlevini kullanın. "Alanı" olarak bir eşleştirmeyi çözümlemek etiket altında bulunan "Ayarla ölçümleri" penceresinde seçili olduğundan emin olun. Şekil 6 dış kontur mavi iz için bkz:.
    4. Küre ve ölçü birimi alanının iç hücre kütlesi takip et. Şekil 6 iç kontur kırmızı iz için bkz:. Ortalama geçiş iç hücre kütlesi toplam neurosphere alanından çıkararak ölçmek.
    5. Hücreler bitişik bir halı (şekil 6) göç yoğun paketlenmiş iç hücre kütlesi sergi ölçü neurospheres.
    6. Hücreleri halı dışında ya da ölçüm için neurosphere dan müstakil eklemeyin. Bkz. şekil 6 örnekler dış halı ölçüm hariç tutulur (beyaz daire içine alınmış) hücre için. En az 20 neurospheres her koşul için analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmaların bir gol NPCs, diğer bir deyişle, bir hücre sayıları artış proliferatif aktivitesini tanımlamaktır. Bu DNA sentezi toplam hücresini nüfusun radyoaktif izleyici tritiated timidin birleşme hücre özleri içine ölçer ve bunların olup tüm hücreleri S-aşamasında nişanlı yansıtan bir yüksek-den geçerek yaklaşım değerlendirme tarafından sağlanır sentezleme 5 dakika veya tüm iki saat için. Ayrıca, bu deneyleri S-faz ve toplam hücresini sayı, tek hücre daha emek yoğun bir tahlil girme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokolleri temel nörogelişimsel işlemler çalışma ve büyüme faktörleri ve sinirsel habercisi hiPSC elde edilen hücreleri kullanarak uyuşturucu testi için hızlı ve basit yöntemleri gösterilmektedir. hiPSC teknoloji nörogelişimsel hastalıkların patogenezinde çalışmanın bizi insan nöronal hücre etkilenen bireylerin yaşamak için eşi görülmemiş erişim sağlayarak devrim yarattı. Gerçekten de, Rett sendromu, Timothy sendromu, Fragile X sendromu, dahil olmak üzere Nörogelişimsel bozukluklarının çok sayıda hiPSC ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser tıbbi araştırma ve otizm tedavisi (CAUT13APS010; için New Jersey valisi Konseyi tarafından desteklenmiştir CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie Aile Vakfı, Mindworks Hayır kurşun güven ve Yahudi cemaati Vakfı büyük MetroWest NJ işaretleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PSC Nöral İndüksiyon Ortamı:
Protokol Bağlantısı: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801Bu, Nörobazal (NB) ortam ve 50x Nöral İndüksiyon Takviyesi'nden (NIS) oluşan bir kittir. NIS, 1X Nöral İndüksiyon Ortamı ve %100 Genleşme Ortamı
Gelişmiş DMEM/F12 OrtamıThermoFischer Scientific12634-010%100 Genleşme Ortamının Bileşeni
Neurobazal OrtaThermoFischer Scientific21103049Hem NIM hem de %100 Genleşme Ortamının Bileşeni 
hESC nitelikli MatrigelCorning354277hESC onaylı hücre dışı matris taklit jeli (ECM-mimik jel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgKök Hücre Teknolojileri72302ROCK inhibitörü
6 kuyulu plakalarNPC bakımı ve Nörosfer Migrasyon Testi için kullanılanCorningCOR-3506
24 kuyulu plakalarThermoFischer Scientific2021-05Polistiren plakalar: NPC DNA Sentez Testi için kullanılır
35 mm'lik tabaklarThermoFischer Scientific2021-01Polistiren plakalar: NPC S-Fazı Girişi ve Nörit Testi için kullanılır
Doğal Fare LamininInvitrogen23017-015Kaplama plakaları için substrat: NPC DNA sentezi, S-fazı girişi ve hücre sayısı tahlilleri
için kullanılırKaplama plakaları için FibronektinSigmaF1141Substrat: Nörit Testi için kullanılır;
Poli-D-LizinSigmaP0899Kaplama plakaları için substrat
Penisilin / StreptomisinThermoFischer Scientific15140122Antibiyotik, NIM bileşeni,% 100 Genleşme ve% 30 Genleşme Ortamı 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Hücre Ayırma Solüsyonu 
% 2.5 Tripsin (10X)Gibco15090-04610X enzimatik çözelti
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261DNA sentezi tahlili için hücrelerin kaldırılması için tripsin çözeltisinde kullanılır
tritiye edilmiş [3< / sup>H] -timidinPerkinElmerNET027E001 Radyoaktif trityum, timidin
Fisherbrand 7 mL HDPE Sintilasyon ŞişeleriFisherbrand03-337-1Sıvı sintilasyon sayımı için şişeler
EcoLite(+)MP Biyomedikal0188247501 Sıvı sintilasyon kokteyli
LS 6500 çok amaçlı sıvı sintilasyon sayacıBeckman Coulter8043-30-1194Sıvı Sintilasyon Sayacı
Skatron Yarı otomatik Hücre Biçerdöver Tip 11019Moleküler Cihazlar ve Skatron Aletleri A.Ş.Yarı otomatik hücre hasat makinesi
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Görüntüleme KitiThermoFisher ScientificC10337EdU ve S-Fazı Giriş Testi için boyama kiti
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4ThermoFisher Scientific15250061Hücrelerin canlılığının değerlendirilmesi
Sınıf GF/C filtre kağıdıGE Healthcare Yaşam Bilimleri, Whatman1822-849Cam elyaf filtre kağıdı
İnsan Temel FGF-2Peprotech100-18Bbüyüme faktörü
Hipofiz Adenilat Siklaz Aktive Edici Polipeptit (PACAP-38)BACHEMH-8430nöropeptit
Polistiren plakalar , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9(2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10(2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Neural Precursor CellsProliferation AssayMigration AssayNeurosphere FormationEdU LabelingPhase Contrast ImagingImmunocytochemical StainingCell DetachmentTrypan Blue CountingECM Mimic Gel

İlgili makaleler