Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

7.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56631

⸱

26 Ocak 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Bu makalede

Özet

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Özet

Beyin gelişimi temporo-kayma bir şekilde morfojenlerdeki ve farklı transkripsiyon programları gradyanlar tarafından kontrol edilir karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, gibi Histon metilasyonu, epigenetik Kromatin değişiklikler kurulması ve belirli hücre kaderi bu işlemde sürdürmek için önemli bir role sahiptir. Histon metilasyonu büyük çoğunluğu Histon değiştiriciler, silgi ve Histon okuyucu proteinlerin erişilebilen esnek Histon kuyruk üzerinde oluşur. Buna ek olarak, H3K79 metilasyonu Histon 3 küresel etki alanında bulunan ve farklı gelişim işlevlerinde karıştığı. H3K79 metilasyonu örümceklerle korunmuş ve türlerin geniş bir Homo sapiens Saccharomyces cerevisiaeiçin bulunabilir. Farklı hücre popülasyonlarının sinirsel ataları da dahil içinde değişiklik oluşur. Histon 3 küresel etki alanında H3K79 metilasyonu konumunu değerlendirmek zorlaştırır. Burada, biz izole etmek için yöntemler mevcut ve embriyonik kortikal beyin dokusu (E11.5-E14.5) veya serebellar taneli nöron ataları (CGNPs) Doğum sonrası doku (P5-P7) ve verimli bir şekilde immunoprecipitate (TBM) kültür kortikal progenitör hücre Kantitatif PCR (qPCR) ve genom çapındaki sıralama için H3K79me2.

Giriş

Beynin duyusal, motor ve Bilişsel işlevler son derece karmaşık ve fiziksel ve çevresel değişikliklere duyarlı. Beyin üç genel parçalar hind-, orta-ve ön, hangi derin bağlı oluşur. Ön içinde telencephalon dorsal telencephalon (DT) ve ventral telencephalon (VT) bölünmüş olabilir. DT farelerin, E11.5 ve E18.5 arasında bir "Inside-out" şekilde1' de kurulan altı kortikal Katmanlar oluşur. VT ganglionic efendiler gelişmede, daha sonra Bazal gangliyon2,3formu içerir. Çeşitli hücre tiplerinin nöronlar, astrocytes veya oligodendrocytes4, gibi memeli merkez sinir sisteminde temporo-kayma şekilde5' te geliştirmek sınıflandırılabilir. İlk olarak, nöral progenitör hücre (NPCs) nöronlar, interneurons VT ve projeksiyon nöronların farklı türde DT ve daha sonra üzerine gliyal hücreler (örneğin, astrocytes6) ortaya çıkmasına. Sırasında kortikal gelişim, en yüzeysel Katmanı (katman ben), hangi Cajal Retzius hücreleri içeren ilk oluşturulur. O zaman, E12.5 ve E14.5 arasında NPCs derin nöronal katmanları (VI, V) iken üst katmanı (IV-II) nöronlar7,814.5 ve 16.5, ataları vermek yükselişi arasında oluşturmak. Nöronal kimlik farklı morphogen kaynaklı temporo-kayma transkripsiyon program tarafından ve ayrıca epigenetik programları2tarafından belirtilir.

Motor koordinasyon içinde karıştığı, beyincik, arka beyin içinde yer alan ve E10 ve kabaca P20 arasında fare9' geliştirir. Serebellar korteksin ve serebellar çekirdeği10içerir. Yetişkin serebellar korteksin üç kat, en dıştaki moleküler katmanı, Purkinje hücre katmanı ve taneli nöronlar10içeren en içteki taneli katman oluşur. Serebellar granül hücre en küçük nöronlar vardır ve tüm omurgalı beyin11nöronlarda yaklaşık % 80'i temsil eder. Onlar üzerinden dış germinal bölgede bulunan öncüleri geliştirmek ve onların hedef12Purkinje hücre katmanı üzerinden göç. Telencephalon, beyincik geliştirilmesi birkaç önemli morfojenlerdeki tarafından düzenlenmiştir gibi hangi-si olmak belirli zaman ve uzay bağımlı görev ve başlatmak transkripsiyon programlar10tanımlı.

Kortikal ve serebellar katmanları gelişimi belirli morfojenlerdeki transkripsiyon ifadesi tarafından ve böylece, DNA'ın Kromatin devlet tarafından kontrol edilir. Basitleştirilmiş bir görünümde, Kromatin Birleşik transcriptionally etkin olarak euchromatin ve heterochromatin transcriptionally sessiz bölgeleri olarak ayrılabilir. Kromatin temel birim olarak nucleosome her çekirdek Histon H2A, H2B, H3 ve H4, DNA13147 baz çifti tarafından çevrili iki kopyasını içerir. Histon metilasyonu, asetilasyon, fosforilasyon, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, Deaminasyon ve prolin isomerization14,15tarafından son derece post-translationally değiştirilir. Histon lizin metilasyonu transkripsiyon, çoğaltma, Rekombinasyon16, DNA hasarı yanıt17ve genomik sürecinden18denetler en istikrarlı Histon değişiklik olarak kabul edilir. Lysines mono-, di- veya üç metillenmiş19 olması ve sadece erişilebilir Histon kuyrukları üzerinde aynı zamanda Histon20küresel etki alanı içinde görünür. H3K4 ve H3K36 belirli methylations euchromatin ile ilişkili, belirli methylations H3K9, H3K27 veya H4K20-esas olarak bulundu heterochromatic bölgelerde, her ne kadar tüm artıkları Histon kuyruk14içinde, yer alan 19,21. H3K79 metilasyonu Histon küresel etki alanı içinde yer alan ve transkripsiyon etkinlik, ama aynı zamanda transcriptionally etkisiz genomik bölgeleri22ile ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Maya, buzağı timus, tavuk ve insan23gözlenmiştir beri değişiklik örümceklerle korunmuş. H3K79 mono, di ve trimethylation (H3K79me1, me2, me3), Histon methyltransferases DOT1L24,25 ve26nükleer SET etki alanını içeren Protein 2 (Nsd2) tarafından katalize. DOT1L nükleer silahların yayılmasına karşı DNA tamiri ve27REPROGRAMING hücresel karıştığı. Dot1l kaybı farelerde çevresinde gelişimsel sahne E10.528,29doğum öncesi bir ölüme yol açar. Kalp Geliştirme sırasında ve myocardiocyte ayrımında DOT1L gen ifade Yönetmeliği30için esastır. Merkezi sinir sistemi DOT1L işlevi Nöral tüp geliştirme31' karıştığı, Tbr1bastırmak ilgilenmektedir-ön geliştirme32sırasında ifade ve ER-stres yönetmelikte çalışmayabilir Yanıt genler33. İçerik bağımlı etkinleştirme veya özellikle merkezi sinir sistemi gelişimi gibi vivo içinde durumlar ile H3K79me, bastırmak eylem için kısmen32anladım sadece tarihidir. H3K79 metilasyonu Histon 3 küresel etki alanında bulunduğundan, bu sterically daha az esnek Histon kuyrukları23değişiklikler ile karşılaştırıldığında erişilemez. H3K79 metilasyonu işlevini anlamak için güvenilir ve tekrarlanabilir analiz yöntemleri konumu ve genomik çevre belirlemek için gereklidir. Bu yöntemleri yazıda, biz izolasyon yöntemleri farklı sinirsel ataları (korteks için TBM'ler) ve CGNPs için beyincik, etkili DOT1L inhibitörü tedavisi ve bir çip yöntem H3K79 metilasyonu yolu ile qPCR ya da sıralama farklı zamanda analiz etmek için mevcut Puan kortikal ve serebellar geliştirme sırasında. Protokol ve olanakların genel bakış için bkz: şekil 1.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan refahı Komiteler Freiburg Üniversitesi ve yerel yönetimler aşağıdaki iletişim kuralında belirtilen tüm hayvan deneyleri (G12/13, G16/11) onayladı.

1. hazırlıkları

  1. TBM yalıtım hazırlıkları
    1. (E11.5-E14.5 arası) korteks gelişiminin farklı aşamalarında embriyo elde etmek için çiftleşme Zamanı ayarlanmış kurmak. En az 8 hafta eski olan fareler baskı NMRI (deniz Tıbbi Araştırma Enstitüsü) kullanın. Çiftleşmeden sonra erkeğini, olumlu bir vajinal tak E0.5 de göz önünde bulundurun.
    2. Yeterli malzeme için bir H3K79me2 küçük parça--dan cortices E12.5 veya E14.5 için bir çöp NMRI farelerin kullanın. Daha sonra embriyonik aşamaları için bir çöp daha fazla çip analizleri için kullanın (ortalama çöp büyüklüğü NMRI: 10 embriyo).
    3. Hank´s dengeli tuz çözüm (HBSS) ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 ° c (uzun dönemde veri RT at) precool.
    4. Equilibrate 4 ° C tripsin-EDTA depolanan (% 0.05 w/v) 37 ° c
    5. Hazırlama kortikal hücreli orta (CCM): (Bkz. Tablo reçetesi) nöronlar için orta %2 (v/v) B-27 ek 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL glutatyon, 0,5 mM L-glutamin, 0.8 µg/mL süperoksit dismutaz ve %1 (v/v) son konsantrasyonları ile ek Penisilin-streptomisin-paromisin antibiyotik karışımı. 4 ° C'de depolayın Deneme için orta 37 ° c olarak equilibrate
    6. Fetal buzağı serum (FCS), aliquot çözülme bu (50 mL her) ve 37 ° c (uzun süreli depolama-20 ° c) bir aliquot equilibrate.
    7. Dnaz 1 (10 mg/mL) hisse senetleri H2O hücre kültürü için hazır olun. Aliquots-20 ° C'de depolayın
    8. Gerekirse, belirli DOT1L inhibitörleri EPZ-5676 veya SGC0946 DMSO içinde hisse senedi toplama 100 mm için geçiyoruz. 1-5 µM son konsantrasyon hücrelere 0 gün uygulayın ve engelleyici her iki günde yeniden uygulayın.
    9. TBM ekimi için hücre kültür tabak (6 iyi veya 12 iyi) en az 1 h RT için Poli-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL 150 mM Borik asit pH 8.4) ve daha sonra laminin (1 mg/mL) ile 37 ° C'de CCM ortamda gecede kat.
  2. CGNP yalıtım hazırlıkları
    1. P5-P7 hayvanlar beyincik (ChIP ve koşul başına 3-5 hayvanlar) yalıtım için oluşturmak için fare bir uygun çiftleşme düzenleyin.
    2. HBSS/glikoz 6 mg/mL ekleyerek glikoz HBSS arabellek için hazırlayın.
    3. CGNP hücre kültür orta (CGM) % 1 (v/v) N2 ek, DMEM-F12 için % 1 ' (v/v) penisilin-streptomisin-paromisin, 25 mM KCl ve % 10 FCS ekleyerek hazırlayın. CGNP ekimi CGM orta olmadan FCS ama 0.6 µg/mL sonic kirpi (SHH) (CGM-ŞŞŞ) dahil olmak üzere hazırlamak ve gerektiğinde 37 ° C ile equilibrate.
    4. 6-iyi hücre kültür pilakalar ve 100 µg/mL Poli-D-lizin RT 1-2 h glia hücreli kaldırılmak için kat. Daha sonra iki kez steril GKD2ile O yıkama ve kuru plakaları izin. En fazla bir hafta 4 ° C'de plakaları depolamak
    5. CGNPs kat 6-şey hücre kültür pilakalar ve poli-L-Ornitin (0.1 mg/mL) 4 ° C'de tarımı için bir gecede. Daha sonra iki kez ile H2O hücre kültürü için yıkama ve kuru plakaları izin.
      Not:-Ebilmek var olmak stok plakaları 4 ° C'de en fazla bir hafta için
    6. % 0,025 tripsin (w/v) HBSS/glikoz hazırlamak ve gerektiğinde 37 ° C ile equilibrate.
  3. H3K79me2 çip hazırlıkları
    1. PFA (PBS, pH %8 1) taze crosslinking Kromatin önce hazırlayın. Hazırlamak için İngiltere'de yılın ısı 50 mL PBS mikrodalga ile en fazla 65 ° c Sırasında sürekli karıştırmaya 0.5 mg PFA PBS için eklenir. Daha sonra 50 µL ekleyin 10 M NaOH ve İngiltere'de yılın eriyene kadar bekle. Daha sonra 42,5 µL eklemek HCl (% 37 v/pH 8 değeri almak için v). PH yeniden doğrulamak ve sonra izin % 1 İngiltere'de yılın çözüm ulaşmak RT.
    2. Hisse senetleri hazırlamak RNase (1 mg/mL) ve İndinavir K (20 µg/µL) ayrı ayrı içinde steril GKD2O. aliquots-20 ° C'de depolayın
    3. Aşağıdaki arabellekleri ve Kimyasalları hazırlamak: %0,02 içeren PBS ara, lizis arabellek, glisin, seyreltme arabellek, arabellek 1, ChIP tampon 2, ChIP tampon 3 ve TE tampon ChIP ve 4 ° C'de saklamak Elüsyon arabellek taze her zaman hazır olun.
      1. %0,02 içeren PBS hazırlamak ara. Çoğu bir haftalık 4 ° C'de için mağaza
      2. 50 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, %1 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ve 1 x proteaz inhibitörü kullanarak lysis arabellek hazırlayın.
      3. 2.5 M glisin hazırlayın.
      4. Seyreltme arabelleği (v/v) Triton X-100 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, % 1'i kullanarak, %0.25 (w/v) SDS ve 1 proteaz inhibitörü x hazırlamak.
      5. ChIP tampon 1 (v/v) Triton X-100 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, kullanımı % 1 ve % 0.2 (w/v) SDS hazırlayın.
      6. ChIP tampon 2 (v/v) Triton X-100 %1 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, kullanımı ve % 0.2 (w/v) SDS hazırlayın.
      7. ChIP tampon 3 (v/v) NP-40-%1 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, kullanımı ve %1 (w/v) SDS hazırlayın.
      8. TE arabelleği 20 mM Tris pH 8.0 ve 2 mM EDTA kullanarak hazırlayın.
      9. %1 (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3içeren taze elüsyon arabellek hazırlayın.

2. nöral progenitör yalıtım beyin dokusunun

  1. Yalıtım ve isteğe bağlı TBM'leri tarımı
    1. Hamile hayvanlar tarafından servikal çıkığı ötenazi ve buz gibi HBSS için embriyo transfer.
    2. Makasla kafatasını ve beyin izole, o zaman mümkünse küçük forseps ve küçük forseps kullanarak dürbün kapsamı altında diğer tüm beyin parçaları kaldırarak her iki hemisferlerin ayrı tut cortices (bütün, DT veya VT) ile ve meninkslerde kaldırmak gerekirse, küçük makas. İzole cortices 5 mL HBSS arabellek 15 mL tüp içinde 4 ° C'de depolayın.
    3. İzole beyin malzeme 1.000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj kapasitesi
    4. Cortices 5 mL ile yıkayın buz gibi HBSS ve onları yukarı ve aşağı pipetting 1 mL pipet ucu ile homojenize. Gerekirse, pipet ucu ucu kesilmiş.
    5. Homojenize örnek için 1000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj kapasitesi HBSS kaldırın.
    6. 3 mL tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için örnek kuluçkaya
    7. 1 mL FCS, 5 mL CCM ve 30 µL Dnaz 1 için örnek ekleyin ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetting tarafından örnek bir 5 mL cam pipet ile homojenize.
    8. 1000 x g ve 4 ° c, izole hücreler için 5 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak, 5 mL CCM ekleyin ve tekrar örnek homojenize.
    9. Bir aliquot örnek sulandırmak ve bir Neubauer sayma-odası ile saymak. 4.5 x 106 hücre başına embriyo bir ortalama tutarı bekleniyor. İzole TBM'leri ekimi için adım 2.1.10 ile devam edin. Çip için hemen adım 3 ile devam edin.
    10. Ekimi, plaka TBM'leri Poli-L-Ornitin (0.1 mg/mL) ve laminin (1 mg/mL) kaplı bir yoğunluk arasında 8 x 104 ve 2.5 x 105 hücreleri/cm2 CCM orta'yemekleri ve 37 ° C, % 5 CO2ve %100 bağıl nem kuluçkaya.
    11. Hücre kültürü nöronların içine (yaklaşık 4 gün sonra) ayırt etmek TBM başlatmak beri diseksiyon tarihi gün vitro 0 (0 gün) olarak düşünün. Daha uzun yetiştirme açısından orta yarısı dördüncü hergün taze CCM orta ile değiştirin.
    12. 1-5 µM uygulamak SGC0946 ya da EPZ5676 gün 0 (4-5 h hücre izolasyon sonra), DMSO içinde çözünmüş ve iki günde yenileyin. DMSO bir denetim tedavi olarak kullanın. Gerekirse inhibitörü tedavisi ile standart immunoblot yöntemleri, etkinliğini test.
  2. Yalıtım ve isteğe bağlı CGNPs tarımı
    1. P5-7 hayvanlar makas kullanarak işten çıkarma tarafından ötenazi. Kafa derisi deri kaldırmak, kafatası açın ve küçük makas ve forseps kullanarak beyin çıkarın. Beyincik yalıtmak ve buz gibi HBSS/glikoz için transfer. Ve soğuk HBSS/glikoz ile dolu 15 mL tüpler içine cerebella transfer tüm zarları ve kan damarları çıkarın.
    2. Cerebella 10 mL ile üç kez yıkayın buz gibi HBSS/glikoz (onları toplamak Santrifüjü 650 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından) ve cerebella daha sonra yavaşça yukarı ve aşağı 1 mL pipet ile pipetting tarafından homojenize (en fazla 2 - 3 kez) 0.5-1 almak için mm3 parçaları.
    3. HBSS/glikoz % 0,025 tripsin 5 mL ekleyin ve 5 mL CGM de ekleyerek 15 dk. Stop sindirimi için 37 ° C su banyosunda sürekli karıştırma altında doku kuluçkaya ve doku tarafından Santrifüjü 650 x g 4 ° C'de 5 min için de toplamak
    4. Ve 1 mL damlalıklı bahşiş 1 ml CGM dokuyla triturate ve yeni bir 15 mL tüp transfer süpernatant çıkarın.
      Not: Hava kabarcıklarını önlemek önemlidir.
      1. 5 mL CGM ekleyin ve karışımı doku kalıntıları yerleşmek için buz üzerinde 2 min için kuluçkaya. Süpernatant yeni 15 mL tüp içine aktarın. 2 mL CGM kalan doku ekleyin ve toz yordamı yineleyin.
    5. Supernatants (olmadan doku kalıntıları, toplamda yaklaşık 10 mL) havuz ve 650 x g 4 ° C'de serebellar hücreleri toplamak için 5 min için de santrifüj kapasitesi. Pelet 10 mL CGM resuspend.
    6. Astrocytes daha hızlı ve daha güçlü Poli-D-lizin CGNPs daha uygun beri 100 µg/mL Poli-D-lizin kaplı 6-iyi-tabaklar hücrelerdeyse plaka (ilâ 4 mL iyi başına) ve 37 ° C'de astrocytes kaldırmak için 20 dk için kuluçkaya.
    7. Plaka sallamak ve süpernatant toplamak. O zaman vasıl 650 x g 15 mL tüp içinde 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Pelet 10 mL CGM resuspend ve hücreleri bir Neubauer odası sayma saymak.
      Not: CGNPs küçük yuvarlak, ve faz kontrast mikroskobu kullanarak yansıma bir hale göstermek.
    8. Eğer gerekli, tohum 37 ° C hücrelerinde CGM Poli-L-Ornitin-kaplamalı plakalar (6-şey başına 3 x 106 hücre) üzerinde önceden ısıttı ve 37 ° C, % 5 CO2 ve %100 bağıl nem kuluçkaya.
      Not: tohum gerçekleştirilmez, 3.1 adıma geçin.
      1. 6-12 h sonra orta olarak CGM-ŞŞŞ değişimi. İzole CGNPs 6 h tedavi (ya da CGM-sus için değişen) yalıtım DOT1L inhibitörü ve DMSO ile sonra kontrol ve her iki günde (2.1.12 ile karşılaştırın) yenilemek. Gerekirse inhibitörü tedavisi standart immunoblot yöntemleri ile etkinliğini test. Küçük parça için adım 3.3 ile devam edin.
        Not: CGM plakalar üzerinde (ve o FBS) bırakarak CGNPs ayrımında serebellar taneli nöronlar (CGNs) içine neden olur.

3. hücre ve Kromatin yamultma fiksasyonu

Not: hücreleri değil kültürlü 3.1 ve 3.2 adımları gerçekleştirin, onlar ise 3.3 adıma geçin.

  1. Santrifüjü 4 dk 1000 x g de tarafından hücreleri toplamak ve 1.3 mL PBS ekleyin. Örnek bir 1,5 mL tüp aktarın. 1000 x g 4° C'de, 4 dk santrifüj Örnek 1.3 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  2. Kritik adım: 350 µL % 1 eklemek PFA örnek ve 22 ° C'de 5 min için kuluçkaya Reaksiyon durdurmak için 18,4 µL glisin ve 1 mL PBS ekleyin. Örnek için 1000 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
    1. Örnek iki kez buz gibi PBS ile yıkayın. Santrifüjü 1000 x g de 5 min ve 4 ° c için tarafından sabit hücreleri toplamak Buz üzerinde örnekleri şu andan itibaren devam et.
      Not: En iyi sonuçları elde etmek için tam 5 dk fiksasyon zaman olması gerekir. Farklı hücre sayıları zaman uyarlamalar gerektirir.
  3. Kritik adım: Kültürlü CGNPs (TBM'ler), ilâ 1 mL % 1 ekleme PFA doğrudan hücre kültür plaka wells için. Sonra 5 dk kuluçka 22 ° c, glisin ve PBS uygun bir miktarda ekleyin ve hücreleri hücre sıyırıcı hasat.
    1. Hücreleri 1,5 mL tüpler içine aktarmak ve örnek için 1000 x g ve 4 ° c'de 5 dk santrifüj kapasitesi Örnek iki kez buz gibi PBS ile yıkayın. Tarafından Santrifüjü 5 minat 1000 x g 4 ° C'de sabit hücreleri toplamak Buz üzerinde örnekleri şu andan itibaren devam et.
  4. Kritik adım: 700 µL lizis arabellek (+ proteaz inhibitörü) ekleyin ve örnek 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Girdap örnek her 5 dk. lysed hücre sonicator (30 s darbe, 30 s Duraklat) maksimum güçte 3 x 10 dk Kromatin kesme.
    1. Birimin tüp başına 350 µL aşmaz olun. Girdap örnekleri her 10 dk. faz kontrast mikroskopla lysate kalan çekirdeklerin için kontrol edin.
      Not: Daha sonraki analizler için en uygun kesme sonuçları ( 1B rakamile karşılaştırın) elde etmek önemlidir. Kromatin yamultma için diğer yöntemleri kullanarak durumunda, 200-500 bp arasında boy Kromatin parçaları için kesme optimize edin.
  5. Hücre kalıntıları 10 dk, 13.000 x g, 4 ° c için cips Süpernatant preclearing adım 5.2 için kullanın. -20 ° c daha sonra kullanmak örnek gerekirse dondur.

4. boncuk ve Preclearing hazırlanması

  1. 45 µL manyetik boncuklar ChIP/protein A ve 20 µL manyetik boncuklar/örnek %0.02 içeren 1 mL buz gibi PBS ile yıkayın üç kez manyetik bir stand kullanarak ara. Sonra buz gibi PBS 1 mL boncuk için ekleyin.
  2. 1 mL buz gibi PBS ve 45 µL boncuk/ChIP, antikor/Chip (H3K79me2 ya da tavşan IgG) 3 µg ekleyin. Örnekleri boncuk için antikorlar bağlamak için bir rotator üzerinde 4 ° C'de 2 h için kuluçkaya. Antikor bağlı olarak ~ 3 µg antikor/ChIP kullanın.
  3. Antikor bağlı boncuk üç kez %0.02 içeren 1 mL buz gibi PBS ile yıkayın ara. (Kullanılan manyetik boncuklar hacmi başlayarak) uygun boncuk birim buz gibi PBS yıkanmış antikor-birleştiğinde-boncuklar için ekleyin.
  4. (Toplam hacim 1,320 µL) preclearing için örnek 600 µL seyreltme arabelleği ve yıkanmış manyetik boncuklar 20 µL ekleyin ve bir rotator üzerinde 4 ° C'de 2 h için kuluçkaya. Manyetik bir stand kullanarak boncuk kaldırın. %5 (33 µL) giriş örnekleri olarak lysates almak ve bunları-20 ° C'de dondurmak

5. Kromatin Immunoprecipitation

  1. Precleared özü iki tüpler (yaklaşık 643.5 µL) içine bölmek, aynı hacmi seyreltme arabellek ve antikor-bağlı-boncuk (45 µL/örnek; Ekle H3K79me2 veya tavşan IgG). Gecede bir rotator üzerinde 4 ° C'de örnekleri kuluçkaya.
  2. Bir rotator üzerinde 4 ° C'de boncuk buz gibi ChIP tampon 1, ChIP arabellek 2 ve 10 min için ChIP tampon 3 ile yıkayın. Daha sonra üç kez TE arabellek bir rotator üzerinde 4 ° C'de 5 dakika yıkayın.
  3. Boncuk oda sıcaklığında bir shaker 1400 rpm'de 1 h için elüsyon arabellek ile elute.
  4. 10 µg RNase çip örnek başına (1 mg/mL) ve 5 µg giriş örnekleri ekleyip örnekleri 30 dk 37 ° C'de (1400 rpm) için kuluçkaya.
  5. 100 µg İndinavir K ekleyin (20 µg/µL) başına ChIP örnek ve giriş başına 50 µg ve gecede 1400 rpm'de 65 ° C'de kuluçkaya.

6. arıtma yonga örnekleri

  1. ChIP ve DNA arıtma ile giriş örnekleri arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek) kit kılavuzuna göre. DNA'ın 5'ten fazla µg beklendiğinde daha fazla arıtma sütunları kullanın. 2 x 15 µL kit ile sağlanan DNA elüsyon arabelleği ile örnek elute.
  2. Miktar (kullanmak 1 µL) örneklerinin görüntülenmesi bir fluorophore ve bir fluorospectrometer kullanarak gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek).

7. analiz yonga örnekleri ile qPCR

  1. QPCR analiz için astar tasarım için bütünleştirici genomik Viewer (IGV) tarayıcı34genom dizileri ilgi almak. H3K79me2 orada bulunduğu büyük olasılıkla bu yana astar çevresinde bir gen, transkripsiyon başlangıç sitesi (TDH) tasarlayın. Bir denetim olarak kodlamayan genomik düşünün bölgeler ve bölgeler 10 Kb akıntıya karşı TSS veya transkripsiyon sonuna 10 Kb aşağı sitesi (TES).
    1. Astar https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 70 ve 200 bp arasında bir ürün boyutu kullanarak oluşturun ve en uygun bir sıcaklık 60 ° c önceden Deneme amaçlı, astar genomik bölgelerin Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 ve Npm1 Tablo 1' de listelenen kullanın.
  2. Aşağıdaki qPCR programı, ana mix ve 58 ° C ve 63 ° C arasında bir tavlama sıcaklığı degrade ile yeni tasarlanmış astar test ve tavlama sıcaklığı en yüksek ürün miktarı ve kalite ile seçin.
    1. Beklenen ürün boyutunu denetlemek için DNA Jel Elektroforez uygulamak. QPCR analiz için gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanın (bkz. Tablo malzeme).
    2. 10 µL DNA polimeraz ana mix, 0.5 µL astar ileri (10 µM), 0,5 µL astar ters (10 µM), 4 µL nükleaz ücretsiz su ve 5 µL DNA ana karışımının hazırlamak (1 ng/µL).
    3. 2-adım qPCR programı aşağıdaki gibi kullanın: 5 min 95 ° c, 50 x (30 s 95 ° c, 30 s 58 ° C - 63 ° c) ve sürekli 4 ° C'de denatürasyon gradyan
  3. Genomik, yamultulmuş, saf DNA örnekleri (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL ve 0,125 ng/µL) seyreltme serisi oluşturmak ve 5 µL qPCR kullanarak bir verimlilik testi için kullanın. Standart eğrinin eğimini belirlemek ve astar verimliliği aşağıdaki formülle hesaplar:
    Verimlilik (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Astar ile verimliliği % 90 ve %105 ideal bir durumda ya da arasında kullanın en az % 85 ve % 115 arasında verimliliği ile.
  4. ChIP ve giriş örnekleri analiz uygulamak 0.1-1 ng çip DNA'ın karışık ile ilgili ileri ve geriye doğru astar, nükleaz ücretsiz su ve DNA polimeraz master mix 20 µL her qPCR reaksiyon için son bir hacim içinde.
  5. ChIP ve giriş örnekleri eşik döngüsü (Ct) değerlerini belirlemek ve zenginleştirme (% giriş) aşağıdaki formül ile hesaplamak için giriş Ct değerleri için Ct örnek normalleştirmek. Arka plan düzeyini belirlemek için IgG denetiminden elde edilen kullanım Ct değerler.
    % giriş = 100-2^(döndük giriş − norm. ChIP)
    norm. giriş Ct (giriş) − günlük2(seyreltme faktörü) =
    norm. Çip Ct (ChIP) − günlük2(seyreltme faktörü) =
    Not: norm. = Normalleştirilmiş

8. analiz yonga örnekleri sıralama yoluyla

  1. Yonga örnekleri (giriş ve immunoprecipitated DNA örneği) bir sıralama tesisine transfer.
  2. Bir uygun Kütüphane hazırlık ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve 2 dönüştürmek bir kütüphane önceden, kullanım hazırlamak için ng giriş DNA immunoprecipitated DNA dizin oluşturulmuş kitaplıklar için en yakın üretme içine her şeyi üzerinde sıralama multiplex ve Platform göstermiştir ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Kritik adım: Kiti yönergeleri izleyerek sıralama adaptörler (15 µM bir çalışma konsantrasyonu ile) tamir ve dA kuyruklu DNA parçalarının sonuna kadar ligate. Sıralama adaptörleri ve PCR için astar uygun oligos ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın. Giriş DNA bu miktar için 6-9 PCR döngüleri bakmaksızın adaptör DNA parçalarının zenginleştirmek için kullanın.
    Not: Normalde, o bir boyut seçim bakmaksızın adaptör DNA'ın gerçekleştirmek gerekli değildir. Birçok PCR güçlendirme devir sonucu PCR çoğaltmaları ve yüksek bir GC önyargı beri mümkün olduğunca az PCR döngüleri kullanmak en iyisidir.
  4. Son Kütüphane için uygun bir aygıt üzerinde boyut dağılımını görselleştirmenizi analiz için toplam reaksiyon 0.5 µL çek ( Tablo malzemelerigörmek). Miktar için bir fluorospectrometer ya da diğer yöntemleri ( Tablo malzemelerigörmek) ile birlikte görüntülenmesi bir boya kullanın.
  5. H3K79me2 daha büyük genomik bölgeler üzerinde geniş yayılmış bir Histon değişiklik gibi görünüyor bu yana örnekleri eşleştirilmiş-son okuma uzunluğu 50 sıra bp ve 75 Mio okuma sıralama derinliği olan.
  6. Galaxy/Uni Freiburg sunucu (galaxy.uni-freiburg.de) ile ChIP-seq veri analiz.
  7. Kalite kontrol FastQC ile elde edilen ChIPseq ile gerçekleştirmek ve uygunsa, doğrudan Bowtie2 sürümü 2.2.035 veya düzeltme olmadan ile eşleştirin. Genom derleme başvurmak mm9 veya en yeni sürüm mm10; ve 79 Ensembl FTP başvuru ek açıklama bırakın.
  8. İsteğe bağlı: Kaldır Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) kullanarak Yinelenenleri tepe aramadan önce okuyun.
  9. Tepeler için H3K79me2 'geniş' seçeneğini kullanarak MACS2 sürüm 2.1.036 ile çağırın.
  10. Oran her iki örnekleri arasında ChIP ve giriş örnek, okuma, okuma sayısı günlük2 günlük2 oranı elde etmek için BamCoverage ve BamCompare kullanın.
  11. DeepTools2 sürüm 2.3.5 veya 2.4.137, çip tahmin etmek için kapsama parça dosyaları (bamCoverage) yongası yalnızca, bamCompare çip karşılaştırma için giriş için oluşturmak için Yani tüm diğer derinlemesine ChIP-seq belirli bir analiz için geçerlidir performans plotFingerprint ve genel bir bakış oluşturmak için computeMatrix, plotHeatmap kullanır. K-computeMatrix işlemi sırasında kümeleme H3K79me2 dağıtım göre genomik bölgeleri kümelemek için ortalama seçin.
  12. Kullanım H3K79me2 E14.5 NCBI deneme amaçlı yatırılır DT olarak ChIP-seq veri yayınlandı (üyelik numarası: SRP057733).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nöral progenitör yalıtım, ekimi, H3K79me2 ChIP ve çipi analiz yöntemleri genel düzeni: H3K79me2 çip kortikal progenitör hücre embriyonik beyin gelişimi sırasında farklı zaman noktalarda veya serebellar taneli nöron ataları, postnatal aşamalarında gerçekleştirmek için bir akış şeması şekil 1 gösterir. Bir ilk adım olarak beyin izole olmak zorunda ve telencephalon (E11.5-E14.5 arası) veya beyincik (P5-P7) alınması gerekir. DT ve VT. bölerek tel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Histon değişiklikler, transkripsiyon faktörleri, Histon Kodu okuyucular, yazarlar veya silgi genomik doluluk algılamaya Kromatin immunoprecipitation gerçekleştirmek için iki ana yolu vardır. Bir sindirilmiş, nükleaz için immunoprecipitation, yerel Kromatin kullanarak yerel çip yöntem ve diğer içinde oluşturarlar ve diğer DNA bağlı proteinler kovalent DNA'yı bağlı olduğu İngiltere'de yılın sabit, yamultulmuş Kromatin kullanarak sunulan yöntemdir 39. yerli küçük parça ile yüksek antikor algılama ora...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek

Teşekkürler

Henriette Bertemes laboratuar CGN ekimi protokolde kurmak için yardım ettiğin için teşekkür ederim. Bu yöntem kağıt DFG tarafından finanse edilen CRC992 tıbbi epigenetik tarafından TV için fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Freiburg Galaxy takım destek kabul: Pavankumar Videm, Björn Grüning ve Prof. Dr. Rolf Backofen, Biyoinformatik, Freiburg Üniversitesi, Almanya ortak araştırma merkezi 992 tıbbi epigenetik tarafından (DFG grant SFB 992/1 2012) finanse ve Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-GAPDHAbcamab8245Kategori: Antikor
Kısaltma/Yorum: İmmünoblot seyreltme 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Kategori: Antikor
Kısaltma/Yorum: İmmünoblot seyreltme 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Kategori: Antikor
Kısaltma/Yorum: ChIP antikoru
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Kategori: Antikor
Kısaltma/Yorum: İmmünoblot seyreltme 1:1000
Anti-tavşan-IgGDiagenodeC15410206Kategori: Antikor
Kısaltma/Yorum: ChIP Ctrl antikoru
Anti-Tubulin alfaAbcamab108629Kategori: Antikor
Kısaltma/Yorum: İmmünoblot seyreltme 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg / ml)Sigma-AldrichT1147Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CCM
B27 Eki için (50x)Life Technologies17504044Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CCM
BiyoanalizörüAgilent teknolojileriiçin G2940CAKategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: Kesilmiş kromatinin analizi için
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: Ultrasonicator
Borik asit pH 8.4Sigma AldrichB6768Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CPC kültürü için
CFX Connect RT PCR Tespit SistemiBio-Rad1855201Kategori: ChIP Analizi
Kısaltma/Yorum: qPCR
DMEM-F12Yaşam Teknolojileri11320-033Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DKategori: ChIP
kısaltma/Yorum: Manyetik boncuklar, ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062içinKategori: DOT1L inhibisyonu
Kısaltma/Yorum: Hücre kültüründe DOT1L inhibisyonu için
Etilendiamin tetraasetik asitSERVA39760.01Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: EDTA
Fetal Sığır Serumu %10 (h/h)Gibco10082147Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CPC izolasyonu ve CGM
Glucose içinSigma-AldrichG5767Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CGNP izolasyonu için
Glutatyon (1.25 mg / ml)Sigma-AldrichG4251Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CCM
GlisinCarl Roth3187Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: Hücre fiksasyonu için
GoTaq mastermixPromegaA6002Kategori: ChIP Analizi
Kısaltma/Yorum: qPCR Hank' için DNA polimeraz ana karışımı
s Dengeli Tuz ÇözeltisiYaşam Teknolojileri14025-100Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: HBSS
L-glutamin (200 mM)Yaşam Teknolojileri25030081Kategori: Hücre kültürü
kısaltma/Yorum: CCM
LamininSigma-AldrichiçinL2020Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum:
Lityum klorürSigma-AldrichL4408Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: LiCl
N2 takviyesiYaşam Teknolojileri17502048Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: DNA miktar tayini için Florospektrometre
NEB Sonraki Ultra DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti IlluminaNEBE7645SiçinKategori: ChIP Analizi
Kısaltma/Yorum: Kütüphane hazırlama kiti
NEB E7335için NEBNext Multipleks OligosKategori: ChIP Analiz
Kısaltma/Yorum: Kütüphane hazırlığı için oligolar
Nörobazal ortamGibco21103049Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CCM
NP-40 Alternatifiiçin Calbiochem492016Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: ChIP tamponu
için ParaformaldehitCarl Roth335Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: PFA, hücre fiksasyonu için
Penisilin-Streptomisin-Neomisin %1 (h/h)Life Technologies15640055Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: PSN, CCM ve CGM için
Fosfat tamponlu tuzlusu Life Technologies10010023Kategori: Hücre kültürü
kısaltma/Yorum: PBS, TBM izolasyonu için
PicoGreen KitThermo FisherP11496Kategori: ChIP Analizi
kısaltma/Yorum: DNA miktar tayini için boyanın görselleştirilmesi
Poli-D-lizinSigma-AldrichP6407Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CGNP izolasyonu için
Poli-L-ornitin hidrobromürSigma AldrichP3655Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: TBM kültürü için
Potasyum klorürThermo FisherAM9640GKategori: Cell culture
Kısaltma/Yorum: KCl, CGM Proteaz
inhibitörüRoche4693159001Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: ChIP
Proteinaz KSigma-Aldrich3115879001içinKategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: for ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Kısaltma/Yorum: DNA saflaştırma kiti
RNAseSigma-AldrichR6513Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Kategori: DOT1L inhibisyonu
Kısaltma/Yorum: Hücre kültüründe DOT1L inhibisyonu için
Sodyum bikarbonatCarl Roth8551.1Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: Elution tamponu için
Sodyum klorürCarl Roth9265Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: NaCl, ChIP tamponu için
Sodyum deoksikolatSigma-Aldrich30970Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: ChIP Sodyum için
dodesilsülfatCarl Roth183Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: SDS, ChIP için
Sonic kirpi (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CGNP izolasyonu için
Süperoksit dismutaz (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Kategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CCM
için Tris(hidroksimetil)aminometanCarl Roth9090Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: TRIS, ChIP tamponu için
Triton X-100Carl RothX100Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: ChIP tamponu için
Tripsin-EDTA %0,05 (w/v)Sigma Aldrich59417CKategori: Hücre kültürü
Kısaltma/Yorum: CPC izolasyonu için
Tween20Carl Roth28320Kategori: ChIP
Kısaltma/Yorum: Boncuk hazırlama için
Diğer Lab cihazları: Neubauer sayma odası, İnkübatör, Döndürücü, Çalkalayıcı, Diseksiyon seti, Su banyosu
CCM: Kortikal hücre ortamı
CGM: CGNP hücre kültürü ortamı
için algılama sistemi için içinIllumina için için

Kaynaklar

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485(2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Serebellar Gran ler N ron Projenit rleriKortikal Projenit r H crelerDoku DigestionuH cre K lt rAk SitometrisiWestern BlotqPCR Analizi
Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.