Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes

12K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56647

⸱

5 Şubat 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı bir vitro canlı görüntüleme fagositoz tahlil astrocytes fagositik kapasitesini ölçmek için sunar. Arıtılmış sıçan astrocytes ve microglia pH göstergesi Birleşik synaptosomes ile birlikte kullanılır. Bu yöntem gerçek zamanlı engulfment ve yıkımı Kinetik algılayabilir ve astrocyte fagositoz oransal faktörleri tanımlamak için uygun tarama platformu sağlar.

Özet

Astrocytes beyin büyük hücre türü ve sinapslarda ve kan damarları doğrudan bağlantı kurun. Ne kadar büyük bağışıklık hücreleri ve sadece fagositler beyin mikroglial hücreleri olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda astrocytes da gelişimsel synapse eleme ve gümrükleme gibi çeşitli fagositik süreçlerde katılmak göstermiştir Alzheimer hastalığı (Ah) içinde beta amiloid plaklar. Bu bulgular rağmen astrocyte engulfment verimliliğini ve yıkımı hedeflerinin microglia ile karşılaştırıldığında belirsizdir. Çoğunlukla astrocyte ve microglia aracılı fagositoz Kinetik kolayca karşılaştırılabilir bir tahlil sistemi olmaması nedeniyle bilgi bu olmaması. Bu hedefe ulaşmak için saf astrocytes ve microglia fagositik kapasitesini değerlendirmek için uzun vadeli bir canlı görüntüleme vitro fagositoz tahlil geliştirdik. Bu tahlil, engulfment ve yıkımı gerçek zamanlı algılama gibi organellerin asidik organelleri parlak kırmızı Floresans çıkaran pH göstergesi Birleşik synaptosomes, kullanarak mümkündür. Bizim roman tahlil fagositoz canlı görüntüleme ile basit ve etkili olarak algılanmasını sağlar. Buna ek olarak, bu vitro fagositoz tahlil bir tarama platform olarak kimyasallar ve artırabilir veya astrocytes fagositik kapasite inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılabilir. Sinaptik budama arıza ve patojenik protein birikimine ruhsal bozukluklar veya nörodejeneratif hastalıklar neden gösterilmiştir gibi kimyasallar ve gliyal hücreler fagositik kapasite modüle bileşikler çeşitli tedavisinde yararlı olmalıdır nörolojik bozukluklar.

Giriş

Beyinde telaşlı olmayan hücrelere başvuruda bulunan, gliyal hücreler merkezi sinir sistemi (MSS) büyük hücre tipinde vardır. Daha önce gliyal hücreler esas olarak nöronal hayatta kalma ve Bazal sinaptik özellikleri korumak pasif rol oynarlar sadece destekleyen hücreler olarak kabul edildi. Ancak, kanıt ortaya çıkan gliyal hücreler Nörobiyoloji synapse oluşumu1,2,3 ve synapse arabuluculuk beyin homeostazı korumak gibi çeşitli yönleriyle daha aktif rol oynarlar ortaya koymuştur Eleme4,5ve modülasyonlu sinaptik plastisite6,7. MSS gliyal hücreler astrocytes, microglia ve oligodendrocytes içerir. Bu hücreler, astrocytes ve microglia arasında sinapslarda4,5, apoptotik hücreler8, sinirsel enkaz9ve patojenik proteinler, amiloid beta gibi içine çeken fagositik oynamamızgerektiğini gösterilmiştir plaklar10,11. Gelişmekte olan beyin astrocytes dorsal yanal geniculate çekirdek (dLGN) ile MERTK ve MEGF10 bağımlı fagositoz4sinapslarda ortadan kaldırmak. Benzer şekilde, microglia da C1q kaplı sinapslarda ile klasik Kompleman art arda5gelişim dönemleri sırasında ortadan. İlginçtir, ekranlarda synapse budama bulunan çeşitli nörolojik bozukluklar başlatanlar biri olabilir sürülmüştür. Örneğin, tamamlayıcı bileşenindeki 4 mutasyonlar (C4), Kompleman aracılı synapse budama microglia tarafından artırır, güçlü insanlar12şizofreni yaygınlığı ile ilişkili olan gösterilmiştir. Son bir kağıt da klasik Kompleman yolu hyperactivated reklam başlatma aşamasında olduğunu ve bu hastalığı13erken synapse kaybına neden olmaktadır göstermiştir.

Microglia-aracılı fagositoz ile karşılaştırıldığında, astrocyte-aracılı fagositoz başlama ve ilerleme çeşitli nörolojik bozukluk olup katkıda bulunur o kadar net değildir. Ancak, son bir kağıt astrocytes tarafından normal synapse budama hızını değiştiren faktörler beyin homeostazı bozabilir ve reklam duyarlılık ve patoloji14' e katkıda öneriyor. Synapse budama astrocytes tarafından oranı güçlü güçlü artırılması oranı ve reklam (ApoE4) için bir risk alleli hızını önemli ölçüde azaltmayı ApoE İzomerler tarafından reklam (ApoE2) için koruyucu bir gen ile kontrol edilir. Ayrıca, ApoE4 ifade transgenik fareler denetim veya ApoE2 fareler14daha fazla sinaptik C1q birikmiş. Bu astrocyte-aracılı fagositoz erken engelliler bu verileri göstermektedir reklam beyin mikroglial Kompleman aracılı fagositoz, sinaptik bozulma sürüş etkinleştirir senescent C1q kaplı sinapslarda/sinaptik enkaz birikimi neden . Astrocytes ApoE4 taşıyıcıları olarak Engelli fagositik kapasite Ayrıca reklam etkilenen beynindeki beta amiloid plaklar kontrolsüz birikimi için katkıda bulunabilir.

Buna ek olarak, gliyal yaşlı Drosophila beyin hücrelerinde fagositik kapasitelerini Draper, sinapslarda phagocytosing için astrocytes kullanan Megf10 homolog azalmış çeviri nedeniyle kaybeder gösterilmiştir. Draper düzeyleri geri kurtarıldı verimli bir şekilde bu yaşlanma indüklenen gösteren benzer ölçüde bu kadar genç beyin, yaşlı beyindeki hasarlı aksonal enkaz temizlenmiş gliyal hücreler fagositik kapasite değişiklikler fagositik kapasite astrocytes beyin homeostazı15kesintileri için katkıda bulunabilir.

Bu yeni bulgulara dayanarak, astrocytes fagositik kapasite oransal önlemek ve çeşitli sinir hastalıkları tedavi için çekici bir tedavi stratejisi olabilir. Bu bağlamda, asidik nano tanecikleri16 ile organellerin asitleştirme inducing ve transkripsiyon faktörü EB (TFEB), hangi-ebilmek arttırmak overexpressing astrocytes, örneğin, fagositik kapasite geliştirmek için çeşitli girişimler olmuştur lysosome Biyogenez17. Bu girişimlerine rağmen nasıl astrocytes ve mikroglial hücreleri fagositik onların Kinetik farklı ve olup olmadığını biz azaltmak veya artırmak çeşitli hastalıklarında fagositik kapasitelerini hala belli değil.

Bu yazıda, biz astrocytes fagositik kapasite gerçek zamanlı olarak algılamak için bir roman vitro tahlil mevcut. Verileri farklı Kinetik engulfment ve yıkımı astrocytes ve microglia göster. Salgılanan faktörlerden yola çıkarak astrocytes içeren astrocyte şartına orta (ACM), astrocytes ve microglia etkili fagositoz için esastır. Ayrıca, Megf10, astrocytes ve homolog Ced-1 ve Draper, fagositik reseptör çalış önemli roller astrocyte-aracılı fagositoz8,18.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada Kore gelişmiş Enstitüsü bilim ve Teknoloji Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), KA2016-08 tarafından onaylanmıştır.

1. synaptosome arıtma

Not: Bu yordamları saf synaptosomes (şekil 1) verimini artırmak için birkaç değişiklik ile daha önce yayımlanmış kağıt19 uyarlanmış.

  1. Kesintili yoğunluk gradient ortam hazırlamak.
    1. Şu buz üstünde yer: % 3, % 10 ve % 23 yoğunluk gradient çözümlerinde degrade arabellek (250 mL su 109.54 g Sükroz, Tris 606 mg ve 5 mL 0,2 M EDTA, pH 7,4 de getirmek); homojenizasyon arabellek (4 degrade arabellek x 25 mL ve 50 mm DTT 74,5 mL su içine 500 µL ekleyin); homogenizer harç ve havaneli.
      Not: Yoğunluk gradient çözüm ve hazırlık Tablo 1' de sunulmaktadır. % 3, % 10 ve % 23 yoğunluk gradient çözümleri hazırlamak için ham yoğunluk gradient çözüm kullanın.
    2. Üç yetişkin fare başına altı Ultra temiz santrifüj tüpleri hazırlayın.
    3. Her santrifüj tüpü 1 mL pipet ile altındaki 3 mL % 23 yoğunluk gradient çözeltisi ekleyin. Sonra yavaş yavaş bir tabaka 3 mL % 10 yoğunluk gradient çözeltisi % 23 yoğunluk gradient çözüm bir mera pipet ve 1 mL pipet ile üstüne ile yapın. Son olarak, 3 mL % 3 yoğunluk gradient çözeltisi üzerine ekleyin. Bu adımda, kabarcıklar tanıtımı önlemek için dikkatli olun.
    4. Santrifüj tüpleri plastik wrap ile kapak ve tüpler buz üzerinde tutun.
  2. Bir yüksek hızlı santrifüj ve ultracentrifuge 4 ° c precool
  3. Cerrahî donanımlar (işletim makas, Castroviejo bahar makas ve eğri forseps) % 70 etanol ile sterilize. Bir küçük bardak ölçek buz homojenizasyon arabelleği 25 mL ile hazırlamak ve kabı tartın.
  4. Beyin üç yetişkin (yaklaşık 12 hafta yaşlı) erkek fareler ayıklayın.
    1. Servikal vertebra yerinden çıkar ve makas işletim sistemi çalıştıran boyun kesti. Baş ve işletim makas ve eğri forseps kullanarak orta çizgi boyunca kafatası derisini soyma. Olfaktör ampuller ve beyincik Castroviejo bahar makasla tüketim.
  5. Kalan beyin eğri Forseps ile kabı koymak ve beyin tartmak. Beyin kan beyin yüzeyinde kaldırmak için birkaç kez buz gibi homojenizasyon arabelleği ile yıkayın.
    Not: Daha önce beyin dokuları 1 g homojenizasyon arabelleğe 9 mL tavsiye edilmiştir.
  6. Tampon ve beyin dokuları homogenizer harç için 1 g homojenizasyon 4 mL ekleyin. Beyin homojenizasyon süre eklemek homojenizasyon tampon 8 mL.
  7. Homogenate iki 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpler içine bölün. 1 mL taze homojenizasyon arabelleği harçla yıkayın ve tüpler için ekleyin.
    Dikkat: mümkün olduğunca çabuk 1.3-1.7 adımları boyunca devam edin. Az 20 dk önerilir.
  8. Homogenates 1000 x g 4 ° C'de 10 dakika için yüksek hızlı santrifüj tüpler santrifüj kapasitesi ile daha yavaş frenler.
    Not: en yüksek hızı yavaşlama dokuz olduğunda iki ya da üç yavaşlama hızı (fren) ayarlayın.
  9. Dikkatli bir şekilde yeni bir 50 mL tüp süpernatant ekleyin ve ilâ 12 mL homojenizasyon arabelleği ekleyin.
  10. Dikkatli ve yavaş seyreltilmiş süpernatant 2 mL % 3 yoğunluk gradient çözüm üzerinde ile 1 mL pipet pipet ve tüpler Buza koyun.
  11. Frenler ile 31.000 x g-4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    Not: yavaşlama hızı teker (sıfır) ayarlayın veya sahil.
  12. Tüpler Buza koyun ve synaptosome kesir % 23 yoğunluk gradient çözüm ve % 10 yoğunluk gradient çözüm 2 mL pipet ile arasında 50 mL tüp içine toplamak. Buz gibi Sükroz/EDTA eklemek ilâ 80 mL tampon ve dört 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpler içine bölmek.
    Not: Resim 3 etiketli degradelerle fraksiyonlara synaptosomes görmek.
  13. 20.000 x g 30 dk daha az sonları ile 4 ˚C az için santrifüj kapasitesi.
    Not: en yüksek hızı yavaşlama dokuz olduğunda iki ya da üç yavaşlama hızı ayarlayın.
  14. Dikkatle süpernatant 1 mL pipet ile kaldırmak için synaptosome Pelet 1 mL izotonik fizyolojik arabellek (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES ve 10 mM glikoz, pH 7,4)20ile resuspend. % 10 DMSO 1 mL izotonik fizyolojik arabellekte ekleyin (DMSO son konsantrasyonu: % 5) ve synaptosomes bir 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpüne toplamak.
  15. 1.5 mL tüpler içine aliquot 1 mL. Bradford tahlil kullanarak synaptosomes protein konsantrasyonu ölçmek.
  16. Hızlı bir şekilde tüpler donma ve tüpler-80 ° C derin dondurucuya pH göstergesi konjugasyon kadar saklayın.

2. pH göstergesi konjugasyon

  1. 1.5 mL tüpler ile synaptosomes 21,092 x g 4 ° C'de 3-4 dakika, santrifüj kapasitesi
  2. Süpernatant kaldırmak, de pipetting tarafından 200 µL 0.1 M Na2CO3 ve karışımı ekleyin.
    Not: Na2CO3 pH succinimidyl ester en iyi şekilde yetiştirmek için tepki verir Birincil aminler hafif alkali pH ile eklenmiştir.
  3. PH göstergesi 2 µL tüp ve yavaşça girdap ekleyin.
    Dikkat: synaptosome çözüm 0.3 mg başına pH göstergesi 1 µL kullanın.
  4. Tüpler alüminyum folyo ile kaplayan ışık pozlandırmayı en aza indirmek ve onları bir twist shaker 30-40 devirde nazik ajitasyon ile kuluçkaya 1-2 h, oda sıcaklığında (RT) için.
  5. Ajitasyon durdurmak ve DPBS 1 mL ekleyin.
  6. 21,092 x g 1-2 min için de tüpler santrifüj kapasitesi.
  7. Süpernatant kaldırmak ve Pelet nazik pipetting resuspend DPBS 1 mL ekleyin.
  8. Adımları 2.6-2.7 ilişkisiz pH göstergesi kaldırmak için en az yedi kez yineleyin.
  9. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 200 µL % 5 DMSO ile DPBS ile resuspend.
    Not: Bu noktada, tüm synaptosomes işlevsel olmayan. Biz o Fosfatidilserin (PS) görür synaptosomes dış membran için maruz doğruladı bir "yemek-bana" sinyal (şekil 4).

3. astrocytes ve Microglia arıtma

Not: Bu astrocyte arıtma için daha önce yayımlanmış kağıt21kimden adapte protokolüdür. Bu protokol için fare astrocytes ve microglia arınma açıklanmıştır. Fare astrocytes ve microglia arıtma için belirli yordamlar da notlarda açıklanmıştır.

  1. Bir gün önce arıtma
    1. Önceden kaplanmış hücre kültür yemekleri ve çözümleri hazırlayın.
    2. Beş 145 mm x 20 mm Petri yemekler 25 mL 50 mm Tris-HCl (pH 9,5) ile hazırlayın. Birincil veya ikincil antikor tedavisi Petri yemeklerinde aşağıda açıklandığı gibi ayrı olarak yerleştirin. Yemekleri dondurucuda gecede kuluçkaya.
      BSL-1 tabak: 20 µL (griffona simplicifolia lektin) 5 mg/ml BSL-1
      Sadece orta çanağı: 60 µL 2.4 mg/mL keçi Anti-fare IgG + IgM (H + L)
      CD45 çanak: 60 µL 2.4 mg/mL keçi Anti-fare IgG + IgM (H + L)
      O4 çanak: 2.4 mg/mL keçi Anti-fare IgM (μ-zinciri özel) 60 µL
      Itgb5 (Integrin β5) yemek için fare astrocytes: 60 µL 2.4 mg/mL keçi Anti-fare IgG + IgM (H + L)
      Not: düşük sıcaklıklarda yavaş ek ikincil antikor Petri kabına hidrofobik yüzeye takmak için önerilir. Ancak, Petri kabına 37 ° C'de 2 h için ikincil antikor ile kat mümkündür Astrocyte kaydırma için antikorlar hayvan türlerinin bağlı olarak farklı şekilde kullanılır; Örneğin, HepaCAM yemek için fare astrocytes: 60 µL 2.4 mg/mL keçi Anti-fare IgG + IgM (H + L)
  2. Gün arınma
    1. İmmunopanning için hazırlanın.
    2. 50 mL tüpler hazırlamak ve hisse senetleri tüpler için ekleyin. Detaylı stok çözüm hazırlama Tablo 1' de sunulmuştur.
      1. Tüp 1 (enzim) hazırlamak: enzim stokunun 22 mL (enzim hisse senedi: 1 x Earle ün dengeli tuz solüsyonu (EBSS)+0.46% D (+)-glikoz + 26 mM NaHCO3 ve0,5 mM EDTA).
      2. Tüp 2 (düşük Ovo) hazırlamak: inhibitörü stokunun 42 mL (inhibitörü hisse senedi: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glikoz + 26 Mm NaHCO3).
      3. Tüp 3 (yüksek Ovo) hazır olun: inhibitörü stokunun 10 mL.
    3. 0,22-µm şırınga filtreleri bir CO2 (% 95'i O2 ve %5 CO2) tanka bağlı 2 mL Pipetler ipuçları ekleyin. Kabarcık CO2 tüpler 1-3. Çözümler turuncu açtığınızda köpüren durdurmak.
    4. Komple çözümler.
      Dikkat: Tamamlamak ve enzim harekete geçirmek için kullanmadan önce tüp 1 çözüm 15 dakika 34 ° C'de kuluçkaya.
      1. Tüp 1 (enzim) hazırlamak: 22 mL enzim stok + 180 U papain + 0,004 g L-sistein.
      2. Tüp 2 (düşük Ovo) hazırlamak: 42 mL inhibitörü stokunun + düşük Ovo 3 mL + Dnaz 200 µL.
      3. Tüp 3 (yüksek Ovo) hazırlamak: 10 mL inhibitörü stokunun + yüksek Ovo 2 mL + Dnaz 20 µL.
      4. Tüp 4 (% 0,2 BSA) hazırlamak: 19 mL 1 X DPBS + 1 mL % 4 BSA + Dnaz 8 µL.
      5. Tüp 5 (%0.02 BSA) hazırlamak: 1 X DPBS 45 mL + 5 mL tüp Dnaz 4 + 50 µL.
    5. Bir su banyosu ve ısı blok 34 ° C'de ısıtın
  3. Sıçan korteks ayıklayın.
    1. Cerrahî donanımlar % 70 etanol ile sterilize ve DPBS ile 100 mm Petri yemekler hazırlamak.
    2. Akrilik bir kutu hazır olun. 2-3 kat dokuların kutusunun altına koymak ve isoflurane 1 mL ve metin kutusuna ekleyin.
    3. Yavrular 20-40 s kutusunda için anestezi ve anesthetization ayak çimdik tarafından Forseps ile onaylayın. Kalp22 açığa ve DPBS ile bir 10 mL şırınga kullanarak pups sıvı.
      Not: Perfüzyon microglia kaydırma adım sırasında kan hücresi kirlenmesini önlemek için kullanılır.
    4. Boyun pups üst servikal çizgi çalışma makasla kesme ve orta çizgi boyunca baş cilt deşmek. Orta çizgi boyunca kafatası bir kesi yapmak ve kafatası eğri Forseps ile açın.
    5. Beyincik Castroviejo bahar makasla tüketim. Kalan beyin almak ve DPBS ile dolu bir 100-mm Petri yerleştirebilirsiniz.
    6. Orta ve Hipokampus gibi diğer alanlarda korteks--dan mikroskop altında Castroviejo bahar makasla kaldırın. Meninkslerde iyi Forseps ile kaldırın.
    7. Korteks yeni 60 mm çanak içine aktarmak ve kalan DPBS yemeği kaldırın. Doku No 10 bıçakla doğrayın.
  4. Korteks bir tek hücre süspansiyon ayırmak
    1. Filtre uygulanan tüp 1 çözüm 60 mm çanak içine dökün ve DNase1 50 µL ekleyin. Çözüm tabakta girdap.
      Not: Dnaz toplama rüptüre hücrelerden DNA transkripsiyonuna engel olma özelliklerinden kullanılır.
    2. 34 ° C ısı bloğu içine çanak yerleştirin ve ortasında bir delik vardır bir kapak ile kapağı. Delik 60 mm Petri kabına kapağını açmak için bir havya kullanın.
    3. 22-µm şırınga filtreleri CO2 tank tüp bağlamak ve filtre uç deliğe yerleştirin.
    4. 45 dk. girdap için 34 ° C'de tabak tabak her 10-15 dk içinde çözüm kuluçkaya.
  5. Kaydırma yemeklerin hazırlanması bitirmek.
    1. Dondurucu bir gün önceden gelen ikincil antikorlar ile kaplı kaydırma yemekleri kaldırın. BSL-1 tabak ve ikincil salt antikor çanak RT., bırakın
    2. Üç kez DPBS 20 mL ile diğer bulaşıkları yıkamak.
    3. %0,02 BSA yeterli miktarda bulaşıkları dökün. Belirli birincil antikorlar karşılık gelen yemekleri yerleştirin:
      CD45 çanak: 12 mL % 0.02 BSA + 0,5 mg/ml fare Anti-fare CD45 20 µL
      Itgb5 çanak: 12 mL % 0.02 BSA + 0,5 mg/ml Itgb5 20 µL
      O4 çanak: 8 mL % 0.02 BSA ve O4 antikor 4 mL
      Not: fare immunopanning için kullanın fare Anti-sıçan CD45 (0,5 mg/mL) microglia ve HepaCAM (0,5 mg/mL) için astrocytes için.
    4. %30 30 mL hazırlamak FBS ile neurobasal kitle iletişim araçları ve 10 mL 1 X EBSS. Her iki çözüm de 34 ° C su banyosunda ısıtın.
  6. Papain tepki inhibe.
    1. Papain tedavi dokular için yeni bir 50 mL tüp aktarın. Yerleşmek dokular için bekleyin. Sıvı emme tarafından Aspire edin.
    2. Düşük Ovo çözüm 4 mL tüp ekleyin ve hücreleri yıkamak için çözüm girdap.
    3. Adımları 3.6.1-3.6.2 enzim reaksiyon durdurmak için üç kez tekrarlayın.
  7. Korteks dokulara triturate.
    1. Düşük Ovo 6 mL küvet için ekleyin. Aspire edin ve 5 mL pipet hızlı bir şekilde kurcalayarak bırakın.
      Dikkat: kabarcıklar tanıtmak değil.
    2. Yeni bir 50 mL tüp hazırlamak ve düşük Ovo 5 mL ekleyin. Yeni bir tüp tek hücreleri toplamak.
    3. Adımları 3.6.1-3.6.2 iki kez tekrarlayın ve 5 mL pipet 1 mL pipet değiştirin.
    4. Dokularda % 95'den fazla görünür değildir kadar toz yineleyin.
    5. Yüksek Ovo çözüm tabakası düşük Ovo-içeren altında bir 10 mL pipet ile ayrışmış tüp 3 hücrelerden olun.
    6. Kaç frenler ile 190 x g-6 dk, santrifüj kapasitesi.
      Not: dokuz en yüksek hızı yavaşlama olduğu zaman bir ya da iki yavaşlama hızı ayarlayın.
  8. Tek hücre filtrate.
    1. Dikkatle süpernatant emme tarafından Aspire edin sonra Pelet 3 mL 1 mL pipet ile %0,02 BSA çözeltisi ile resuspend.
    2. %0,02 BSA çözüm ekleyin ilâ 9 mL.
    3. Yeni 50 mL tüp ve 20 µm hücre süzgeç üstünde tepe-in tüpü hazırlayın. Hücre süzgeç 1 mL % 0.02 BSA çözeltisi ile ıslak.
    4. Tek hücre süspansiyon hücre süzgeç aktarın. 1 mL teker teker filtre.
    5. Hücre süzgeç 3 mL % 0.02 BSA çözeltisi ile yıkayın. Filtre uygulanmış tek hücre süspansiyon 15 mL den fazla yapmayın.
    6. 34 ° C su banyosu için 45-60 dk hücre kurtarma için tüpte kuluçkaya. Relocalization membran için hücre yüzey proteinlerin hücre kurtarma adım sağlar.
  9. Hücreleri yatay kaydırma yapın.
    1. CD45 kaydırma çanak üç kez DPBS 20 mL ile yıkayın. Her yemek DPBS 20 mL kullanımdan hemen önce üç kez yıkayın.
    2. Çanak kaydırma tek hücre süspansiyon CD45 içine dökün. Yemek için 28 dk bırakın ve yemek için 14 dk sallamak. İlişkisiz hücreleri altındaki çıkarın için dikkatle çanak sallayın.
    3. Hücre süspansiyon yalnızca ikincil yemek için transfer. 20 dk bekleyin ve dikkatli bir şekilde yemek 10 min için çalkalanır. CD45 yemek microglia edinmek için 3.9.2 adıma gidin.
    4. Hücre süspansiyon BSL-1 tabak içine aktarın. Yemek 10-12 dk için bırakın.
    5. O4 çanak içine aktarın. 20 dk bekleyin ve 10 dakikadır sallamak.
    6. Itgb5 çanak içine aktarın. Yemek için 40 dk bırak ve yavaşça her 10 min sallamak.
      Not: fare kaydırma için hücre süspansiyon HepaCAM çanak içine aktarın.
  10. Çanak hücrelerden bağlantısını kesin.
    1. Preincubated 8 mL 1 X EBSS ile karışımı 400 µL tripsin (30.000 U/mL EBSS) in.
    2. Çanak müstakil hücre süspansiyon atık kova içine dökün.
    3. Sekiz kez ile DPBS çanak yıkayın.
    4. EBSS 8 mL tripsin ile çanak içine dökün.
    5. Yemek için 5-10 dk 37 ° C kuluçka kuluçkaya. 10 dk CD45 yemek için ve 5 min Itgb5 ve HepaCAM yemekleri için kuluçkaya.
    6. Çanak dokunun ve mikroskop altında çanak gözlemlemek.
      Not: astrocytes çoğunu bağlantısız değil, yemeğin geri başka bir 5 min için kuluçka makinesi içine koymak.
    7. %30 10 mL dökün FBS çanak içine tripsin nötralize etmek için.
    8. Yukarı ve aşağı astrocytes veya microglia ayırmak için tüm tabakta pipet.
    9. Çözüm 50 mL tüp içine aktarın.
    10. %30 10 mL ekleyin FBS ve Dnaz 200 µL çanak içine. Hücreleri yeniden bağlantısını kesin. Dnaz toplama rüptüre hücrelerden DNA transkripsiyonuna engel olma özelliklerinden kullanılır.
    11. Çözüm tüpün içine aktarın. Hücreleri tabak içinde kalırsanız, başka bir 10 mL % 30 ekleyin FBS ve hücrelerin tekrar ayır.
  11. Hücreleri plaka.
    1. Tüp vasıl 213 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
    2. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet medya ile resuspend.
      Not: immunopanned astrocyte temel medya (IP-ABM) ile immunopanned astrocyte klimalı ortam (IP-ACM) microglia için astrocytes ve retina microglia temel medya (MBM) için kullanın. IP-ABM ve MBM kompozisyon Malzemeler tablosunulmaktadır.
    3. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
    4. Astrocytes ve microglia ayrı ayrı PDL kaplı levha içinde plaka.
      Not: kullanmadan önce PDL kaplı plaka hazırlayın. PDL kaplı plakalar hazırlamak için 1 mg/mL Poli-D-lizin 50 µL 5 mL distile su ekleyin ve çözüm yeterli miktarda iyi plaka/çanak içine dökün ve üç kez distile su ile plaka/çanak 30 dk. yıkama için bekleyin.
    5. Plaka kuluçkaya. Medya her 7 gün için astrocytes ve microglia için 3 gün yarısı değiştirin.

4. IP-ACM toplamak

  1. Astrocytes aşırı Konfluent olduğunda 100-mm yemek hazırlamak.
  2. Medya atmak ve üç kez DPBS 10 mL ile çanak yıkama.
  3. Düşük protein medya 15 mL çanak içine dökün.
    Not: Düşük protein medya kompozisyon Malzemeler tablosunulur.
  4. 7-10 gün 37 ° C kuluçka için çanak kuluçkaya.
  5. Toplamak ve medya 10 k ile konsantre (veya 30k) santrifüj filtre tüpler.
  6. Vasıl 851 x g 4 ° C'de tüpler santrifüj kapasitesi
    Not: kadar kalan medya az 1 mL tüpler santrifüj kapasitesi.
  7. Toplamak konsantre medya (IP-ACM) yeni bir 1.5 mL tüp içine.
  8. IP-ACM nicel analizi ile konsantrasyon ölçmek

5. fagositoz canlı görüntüleme tahlil (Şekil 2)

  1. 24-şey plaka (ya da herhangi bir plaka/canlı görüntüleme için hazır yemek) hangi astrocytes Konfluent hazırlamak (genellikle, sonra arıtma hücreleri sabitleme için idealdir kuluçka 7-10 gün).
  2. Her kuyuya medyayı çıkarın ve DPBS, 1 mL Wells'le üç kez yıkayın. Hava pozlandırmayı en aza indirmek için hızlı bir şekilde kuyuları yıkayın.
  3. IP-ABM 300 µL 5 µL pH göstergesi Birleşik synaptosomes ve gliyal hücreye fagositoz modüle IP ACM gibi ek etkenler ile ekleyin.
  4. Plaka CO2 kuluçka 40 min için kuluçkaya. Bu adımı pH göstergesi Birleşik synaptosomes plakaları altına yerleşmek izin verir.
  5. İlişkisiz pH göstergesi Birleşik synaptosomes ile medyayı çıkarın ve yıkama DPBS 1 mL ile her şey, üç kez.
    Dikkat: sert yıkama yok. Hava pozlandırmayı en aza indirmek için hızlı bir şekilde kuyuları yıkayın.
  6. IP-ABM 500 µL kuyu test etmek için ek etkenler ile ekleyin.
  7. Canlı görüntüleme araç plaka almak ve pozisyonlar seçin. Odak, pozlama süresi, parlaklık ve LED güç ayarlayın.
    Not: Pozlama süresi, parlaklık ve LED güç ayarlarını floresan yoğunluğu bağlı olarak değişken ve deneme amacı vardır. PH göstergesi Birleşik synaptosomes ile canlı görüntüleme assay olarak, biz genellikle bu değerler aşağıdaki gibi ayarlayın: pozlama: ~ 150-200 ms, parlaklık: 15 ve LED güç: 4-6.
  8. Resim biçimi, zaman aralığı ve döngüleri canlı görüntüleme için toplam sayısını ayarlayın. Zaman aralığı 1 olarak ayarlayın veya 2 h kaç pozisyonları bağlı olarak seçilir. 150'den fazla pozisyonları canlı görüntüleme için seçildiğinde 2 saatlik aralıklarla tavsiye edilir.
  9. Canlı görüntüleme deneyler başlatın.
  10. Verileri analiz.
    1. Fiji programını açın.
    2. Görüntü sırası alın. Resim 8-bit gri tonlamalıya dönüştürün.
    3. Bir bar 50 piksel yarıçapı haddeleme ile arka plan çıkarma gerçekleştirin.
    4. Zaman serisi analyzer V3 eklentileri başlatın.
      Not: Saat serisi analyzer V3 eklentileri için adres Malzemeler tablosunulur.
    5. Sürükle bölgenin ilgi (ROI), belgili tanımlık imge ve tıkırtı eklemek ROI Yöneticisi'nde.
    6. "Toplam yoğunluk al" saat serisi V3_0'ı tıklatın.
    7. Sonuçları kaydetmek ve verileri tümleştirebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu vitro fagositoz assay olarak uzun vadeli canlı görüntüleme, biz üzerinden % 23 degrade çözüm ve % 10 degrade çözüm arasında degrade çözümde ayrı kaldık ultrasantrifüj () tarafından Yetişkin fare beyin homogenates synaptosomes kullanılan Şekil 3). Hazırlık sonra telkin onların işlevini kaybetti ve PS reseptörleri astrocytes ve microglia tarafından tanınan PS onların dış membran (şekil 4), synaptosomes maruz. Astrocytes...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede, biz yöntemleri arıtılmış gliyal hücreler ve pH göstergesi Birleşik synaptosomes kullanarak uzun vadeli bir canlı görüntüleme vitro fagositoz tahlil için mevcut. Biz microglia ile karşılaştırıldığında göstermek astrocytes synaptosomes fagositoz sırasında farklı engulfment ve yıkımı kapasitesine sahip. Buna ek olarak, bizim veri köprüleme moleküllerin GAS6, proteinler ve MEGE8 içeren astrocyte salgıladığı faktörler, verimli PS-bağımlı fagositoz beyinde gliyal hücreler için gerekli olduğunu göstermekte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Yeon-Joo Jung onun deneysel destek için synaptosome arınma ve Jungjoo Park sırasında synaptosomes PS pozlama ile yansımaları için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, tüm üyelerinde Chung'ın laboratuvar yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser Kore (NMG) hibe Kore hükümeti (MSIP) (NMK-2016M3C7A1905391 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1C1B3006969) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir (W. S. C).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sinapttozom saflaştırma
PercollGE sağlık yaşam bilimleri17-0891-01
Hızlı Başlangıç Bradford Protein Test Kiti 2BIO-RAD5000202
pH indikatörü konjugasyonu
Dimetil sülfoksit (DMSO)LPS çözeltisi
pHrodo kırmızısı, süksinimidil esterMolecula problarıP36600
İmmünopanning
10X Earle' s dengeli tuz çözeltisi (EBSS)SigmaE7510
Sığır serum albüminiBovogenBSA025
Deoksirebonukaz 1 (DNase)WorthingtonIs002007
(DMEM)Gibco11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco16000-044
Griffonia Simplicifolia Lektin(BSL-1)Vektör LaboratuvarlarıL-1100
Keçi anti-fare IgG + IgM (H + L)Jackson ImmunoResearch115-005-044
Keçi anti-fare IgM (μ -zincir)Jackson ImmunoResearch115-005-020
Heparin bağlayıcı epidermal büyüme faktörüSigmaE4643
İnsan HepaCAM antikoruR& D sistemleriMAB4108
İntegrin beta 5 monoklonal antikor (KN52)eBioscience14-0497-82
L-sisteinSigmaC7880
L-glutamatGibco25030-081
N-asetil-L-site (NAC)SigmaA8199
Nörobazal medyaGibco21103-049
O4 hibridoma süpernatant(fare IgM)Bansal ve ark.23
PapainWorthingtonIs003126
Penisilin/streptomisinGibco15140-122
Pluristrainer 20 & mu; mPluriSelect43-50020-03
Poli-D-lizinSigmaP6407
ProgesteronSigmaP8783
Putresin dihidroklorürSigmaP5780
Saflaştırılmış sıçan anti-fare CD45BD Pharmingen550539
Saflaştırılmış fare sıçan önleyici CD45BD Pharmingen554875
Sodyum piruvatGibco11360-070
Sodyum selenitSigmaS5261
TransferrinSigmaT1147
TripsinSigmaT9935
Tripsin inhibitörüWorthingtonLS003086
Ultra berrak tüp (Tüp, İnce Duvar, Ultra Berrak)Beckman Coulter344059
Collect IP-ACM
PALLMAP010C37Santrifüj Cihazları (30k)
Omega Membranlı Macrosep Advance Santrifüj Cihazları (30k)PALLMAP030C37
Fagositoz canlı görüntüleme testi
Juli aşamasıNanoEntek
Time Series Analyzer V3 eklentilerihttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html
DMSO100Omega Membranlı Advance PALL

Kaynaklar

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871(2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355(2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Astrosit FagositozupH İndikatörlü SinaptozomlarGlial Hücre YutulmasıMikroglia KarşılaştırmasıSinaptozom HazırlamaZaman Atlamalı GörüntülemeFloresan KantifikasyonuMEGF10 NakavtıNörolojik Bozukluk Taraması
Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.