Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için güvenilir bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım
Bu makalede
Özet
Özet
İç kulak gen tedavisi büyük söz işitme kaybı ve baş dönmesi için potansiyel bir tedavi olarak sunmaktadır. İç kulak gen terapisi başarısı önemli belirleyicileri işitme kaybı en aza indirerek tutarlı iletim verimliliği hedef hücre tiplerinin sonuçları bir teslimat yöntemi bulmak için biridir. Bu çalışmada, iç kulak gen teslim yenidoğan farelerde için uygun bir yöntem olarak posterior semisirküler kanal yaklaşım tarif. Gen teslim posterior semisirküler kanal aracılığıyla tüm iç kulakta sıvı mümkün olduğunu göstereceğiz. Posterior semisirküler kanal kolay anatomik tanımlanması, hem de en az gerekli temporal kemik manipülasyon, iç kulak gen teslim için cazip bir seçenek yapmak bu cerrahi yaklaşım.
Giriş
İç kulak gen terapisi araştırma çalışmaları hızla gelişmekte olan bir alandır. Bu savaş ototoksisite, gürültü travma ve kalıtsal işitme kaybı1çeşitli hayvan modellerinde uygulanmıştır. Birkaç son çalışmalar mutant farelerde iç kulak gen terapisi teslim2,3,4,5,6sonra, işitme ve denge işlevlerini fonksiyonel iyileşme göstermiştir 7. bir anahtar faktörler iç kulak gen terapisi başarı iç kulak erişmek için kullanılan cerrahi yaklaşım olduğunu belirleme. İdeal olarak, cerrahi yaklaşım gerçekleştirmek kolay olurdu, anatomik işaretlerini tutarlı ve kolay tanımlamak olurdu ve hedeflenen hücre tiplerinin elde edilen iletim yüksek olacaktır.
Bir son çalışmada, viral gen terapisi whirler mutant fare (işitme kaybı ve Vestibüler disfonksiyon bir model) posterior semisirküler kanalından enjekte edildiğinde duyusal saç hücrelerinin verimli iletim Vestibüler içinde görülmüş gösterdi organları de olduğu gibi koklea5. Duyusal saç hücre iletim yüksek verimlilik iyileştirme bu mutant farelerde işitsel ve Vestibüler fonksiyonların sonuçlandı.
Bu makalede, Yenidoğan fare iç kulak erişmek için posterior semisirküler kanal yaklaşım biz ayrıntılı olarak tarif.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Enstitüsü sağırlık ve diğer iletişim bozuklukları (NIDCD ASP1378-15) tarafından kabul edildi.
1. yordam kurulum ve hazırlık
- Etilen oksit denemenin başında tarafından tüm aletleri sterilize. Hayvanlar arasında boncuk sterilizasyon kullanarak aletleri temiz.
- Bir micropipette üzerinde mikro-enjektör içine viral gen terapisi içeren çözüm yükleyin. Bu çalışmada kullanılan viral vektör AAV2/8-whirlin yapıldı (1 x 1013 genom kopya sayısı mililitre, malzemelerin tabloya bakın).
Not: Genellikle, 1.1 µL Toplam hacim micropipette yüklenir.
2. anestezi
Not: Bu çalışmada kullanılan fare zorlanma whirler faredir. Homozigoz mutantlar (okulwi/kablosuz) ve heterozigoz littermates (okul+/ wi) kullanılmıştır.
- Anne ayrı kafese (çöp ayrıdır) yerleştirin.
- Fareler sıcak tutmak için bir dolaşım ısı yastık (set 37,5 ° c) üzerinde çöp (P0 - P5 pups) içeren ev kafes yerleştirin.
- Lateks eldiven başparmak kısmı keser ve bir yavru içine yerleştirir.
- Yavru bir kova dolusu buz ~ 2 min için lateks eldiven başparmak yerleştirin.
- İmzalat yavru bir 4 "x 4" gazlı bez pup ve pack'ın yüzeyi arasında büyük kare ticari plastik donma paketiyle yerleştirin.
- Ağır bir lateks eldiven ezilmiş buz ile doldurun ve buz eldiveni yavru fok çevresinde yer.
- Yavru fok (bir firma ayak çimdik dahil) çeşitli uyaranlara karşı bir yanıt tam eksikliği ile yeterli anestezi Eğer görmek için kontrol edin. Yavru fok buz torbası (yaklaşık 5-10 dk) ameliyat süresince bırakın.
Not: Belgili tanımlık pups ameliyat sırasında en fazla 15 dakika buz torbası açık bırakmak öneririz.
3. cerrahi yaklaşım (şekil 1)
- Hayvan anestezi bir kez deri bir iyot temizleme işlemi ve bir alkol silme ile kulak arkasında temiz.
- Postauricular kesik ~ 2 mm mikro-makas kullanarak kulağının arkasında olun ve mikro-makas ile boyun kas bölün.
- Yüz sinir ve bulla tanımlar. Bulla kıkırdak ve yarı saydam bu yaşta ve bu yüz sinir medial yatıyor. Stapedial arter bulla ile yararlı bir dönüm noktası olduğunu bu yaşta görülebilir.
- Yüz sinir konumlanmıştır ve özafagusu izleyin posterior semisirküler kanal (bundan) bulmak için. Kas lifleri ve yumuşak doku posterior semisirküler kanal mikro-makas kullanarak örten kaldırın.
Not: Bundan bu yaşta kıkırdak. - Bir cam micropipette (~ 10 mikron çapında) mikro-enjektörü kullanarak bundan nüfuz.
- Viral gen terapisi iç kulak enjekte.
Not: Genellikle, Toplam 49 20 enjeksiyonlari nL gen tedavisi teslim edilir posterior semisirküler kanal 40 ~ s (Toplam hacim ~ 1 µL). Kullanılan viral titresi mL başına 1 x 1013 genom kopya oldu. - 5-0 polyglactin dikiş kullanarak cilt kesi kapatın.
4. ameliyat sonrası bakım
- Yavru fok anestezi sürekli manuel stimülasyon/haddeleme ile eldivenli insan parmak ile kurtarma sırasında normal vücut ısısı geri yüklemek için Isınma bir yastık yerleştirin.
- Yavru fok uyanık olduğunda, geri onun ev kafesin içine yerleştirin.
- Her yavru için eve kafes yatak maruz bir pamuk bez ile okşadı.
Not: Bunun amacı onu çöp ameliyat sonrası yeniden kabul anne olasılığını artırır ameliyat öncesi yaptıkları gibi kokuyorsun fareler sahip olmaktır. Mümkünse, idrar anneden toplanan ve daha fazla reddedilme olasılığını azaltmak için bir pamuklu çubukla kullanarak pups ovuşturdu. - Onun8duyarsızlaştırmak için annenin Burun madeni yağ uygulayın ve ev kafesin içine annesinin reintroduce.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Enjeksiyon AAV8 whirlin gen tedavisi yenidoğan whirler fareler posterior semisirküler kanal aracılığıyla içine S.1 genel enfeksiyon verimliliği ile sonuçlandı (yeşil) ifadesinde utricular saç hücreleri (Resim 2), whirlin (SD 38,1, n = 28)5 . Transduced saç hücreleri uzamış kontralateral sigara enjekte kulaklarından saç hücrelerine göre stereocilia (kırmızı) (5.35 ± 2.11 µm 3.20 ± 0.34 µm, vs sırasıyla)5.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Birkaç cerrahi yaklaşım kemirgen iç kulak erişmek için tarif edilmistir. Posterior semisirküler kanal ve endolymphatic kesesi yaklaşımlar genellikle Vestibüler organları1erişmek için kullanılır, ancak Cochleostomy ve yuvarlak pencere yaklaşımlar en sık koklea, erişmek için kullanılır. Bir son çalışmada, o posterior semisirküler kanal enjeksiyonları viral gen tedavisi saç hücre iletim Vestibüler organ veya koklea5yüksek verimliliği sonuçlandı gösterdik. Aslında, koklear saç ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar yapmak için hiçbir ilgili açıklamalar var.
Teşekkürler
Bu eser NIDCD bölümü, Intramural araştırma /NIH (DC000082-02 W.W.C.) yanı sıra DC000081 fonlarından için gelişmiş görüntüleme çekirdek tarafından desteklenmiştir. Bizim hayvanlar için bakım için NIDCD hayvan tesis personel için sana şükrediyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ameliyat mikroskobu | Zeiss | OPMI Pico KBB mikroskobu. Diğer diseksiyon mikroskopları da işe yarayacaktır. | |
| Mikro forcepts | Güzel Bilim Araçları | 11251-10, 11295-51 | # 5 ve # 55 Dumont |
| Mikro makas | Güzel Bilim Araçları | 15002-08 | |
| Nanolitre2000 mikroenjektör | Dünya Hassas Aletler | ||
| Isıtma yastığı | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl sütürler | Ethicon | ||
| AAV8-girdap | Vektör Biolabs | ||
| Cam pipet | Sutter Instruments | B100-75-10 | Borosilikat cam |
Kaynaklar
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295(2015).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
- Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
- Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
- Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).
- Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
- Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524(2017).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
