Bu iletişim kuralı canlılık parametre ve düşük basınç plazma ile tedaviden sonra Bacillus subtilis sporlar canlandırıcı olarak DNA onarım işlemleri izleme alaka değerlendirmek için izleme tarafından gereken önemli ardışık adımlar gösterilmektedir Floresans etiketli DNA onarım proteinler confocal mikroskobu zaman karar vermek ve elektron mikroskobu tarama yoluyla.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma
Bu makalede
Özet
Özet
Plazma sterilizasyon geleneksel sterilizasyon yöntemleri sanayi, klinik ve uzay uçuşu amaçlar için umut verici bir alternatiftir. Alçak basınç plazma (LPP) deşarj için hızlı mikrobiyal inactivation kurşun etkin türleri, geniş bir yelpazede içerir. Verimlilik ve mekanizmaları sterilizasyon LPP tarafından çalışmaya, sporlar test organizmanın Bacillus subtilis geleneksel sterilizasyon prosedürleri karşı olağanüstü onların direnci nedeniyle kullanıyoruz. B. subtilis spor monolayers, bir çift İndüktif eşleşmiş plazma reaktörü, tarama elektron mikroskobu (SEM), kullanarak spor morfolojisi karakterizasyonu plazmada düşük basınç sterilizasyon işleminin üretim tarif ve çimlenme ve sporlar canlı cep mikroskobu tarafından akıbet analizi. Plazma türler uğrak bir genomik malzeme (DNA) ve plazma kaynaklı DNA lezyonlar spore canlanma üzerine tamiri organizmanın hayatta kalmak için çok önemli. Burada, biz sporlar çimlenme kapasitesi çalışma ve DNA'ın rolü onarım spor çimlenmesi ve akıbet sırasında LPP ile tedaviden sonra fluorescently etiketli DNA onarım proteinler (RecA) zaman çözüldü confocal Floresans mikroskobu ile takip ederek. Tedavi ve tedavi edilmezse spor monolayers çimlenme için harekete geçirmek ve bir ters confocal canlı cep mikroskobu ile bireysel sporlar reaksiyon izleyin zaman içinde görüntülenir. Gözlemlerimiz takımıdır ve sporlar büyümüş kısmını LPP-tedavi en az 120 RecA-YFP (sarı Floresans protein) Floresans sadece birkaç sporlar algılandı ve toplamda geliştirilen s. sonra ulaşma süresi bağlıdır ortaya LPP tedavi sporlar içinde hafif bir ayrıcalık hücrelerle büyümüş. Ayrıca, bazı bitkisel bakteri LPP tedavi sporlar sitoplazma içinde artış gösterdi türetilen ve koşullar olarak gördüler. Bireysel Sporlar çözümlenmesi için açıklanan yöntemleri diğer yönleri spor çimlenmesi ve akıbet çalışma için örnek olabilir.
Giriş
Uzay araştırmaları ana amacı yaşam formları ve biomolecules diğer gezegen organları ve uyduları Güneş Sistemi'ndeki imzalar için aramasıdır. Mikroorganizmaların transferi veya kritik alanlarda keşif için karasal kökenli biomolecules geliştirme ve hayat-algılama misyonlar Mars ve Europa1gibi gezegen Cesetlerdeki bütünlüğünü çarpışmaya belirli risk var. Gezegensel koruma Komitesi, uzay araştırma (gösterge tarafından) 1967'de kurulan, uluslararası kurallara ve diğer gezegenler, onların uyduları, asteroitler ve diğer Gök cisimleri insanlı ve robotik görev üzerinde sıkı kuralları empoze düzenleyen Temizlik ve sterilizasyon bir uzay aracı ve kritik donanım bileşenlerinin önceki karasal mikroorganizmaların kirletici ortadan kaldırmak ve Gök cisimleri2çapraz kontaminasyonu önlemek için başlatmak için. Son on yıl içinde sigara termik Plazmaları uygulanması geniş dikkat Biyomedikal ve beslenme araştırma yanı sıra uzay uçuşu uygulamaları3,4,5kazanmıştır. Nazik için hassas ve ısı değişken malzeme olurken hızlı ve verimli mikrobiyal inactivation6, sunduğundan plazma sterilizasyon geleneksel sterilizasyon yöntemleri için umut verici bir alternatiftir. Plazma deşarj serbest radikaller, parçacıklar, atomlar tarafsız/heyecanlı, hızlı mikrobiyal inactivation3' e yol fotonlar ultraviyole (UV) ve vakum ultraviyole (VUV) spektrum gibi reaktif maddeler karışımını içerir. Bu çalışmada, Bacillus subtilis Endosporlar cam test yüzey üzerinde dağıtılmış devre dışı bırakabilirsiniz için alçak basınç plazma Çift Kişilik İndüktif eşleşmiş alçak basınç plazma (DICP) kaynak7,8 tarafından oluşturulan kullanın.
Gram-pozitif bakteri Bacillaceae ailesinin yaygın olarak toprak, çökeller ve hava de temiz Oda imkanları ve Uluslararası Uzay İstasyonu9,10 gibi olağandışı ortamlar gibi doğal habitatları dağıtılır ,11. En farklı cins Bacillus besin tüketme12gibi olumsuz koşullar hayatta kalmak için son derece dayanıklı uyuyan Endosporlar (bundan sonra sporlar anılacaktır) oluşturmak için yetenek özelliğidir. Sporlar onların bitkisel hücre göre daha genellikle çok daha dayanıklı çeşitli tedaviler ve çevresel stresleri, ısı, UV, gama ışınlama, kuruma, mekanik bozulma ve güçlü oksitleyiciler gibi zehirli kimyasallar da dahil olmak üzere veya pH değişen ajanlar (başvurular13,14' te gözden) ve bu nedenle mikrobiyal inactivation yöntemleri verimliliği test için ideal nesneleridir. Genomik DNA uğrak bir bakteri15,16, plazma kaynaklı DNA lezyonlar tamiri plazma tedavisinin olduğu (örneğin DNA çift iplik sonları) Spor canlanma bakteri13, yaşam için çok önemlidir 17.
Bu nedenle, biz sporlar çimlenme kapasitesi ve DNA tamiri rolü spor çimlenmesi ve akıbet sırasında düşük basınç argon plazma ile sporlar aşağıdaki bireysel sporlar tarafından tedavi sonra çalışma ve onların ifade Floresans etiketli DNA onarım protein RecA zaman çözüldü confocal Floresans mikroskobu ile. Biz ulaşmak tekrarlanabilir test sonuçları, spor monolayers sterilizasyon için düşük basınç plazma ile tedavisi, tedavi plazma sporlar için hazırlanması için monolayers içinde bir adim adim öğretim B. subtilis sporlar hazırlanması vermek Bireysel Sporlar etkin DNA izleme ile konser düzeyinde tarama elektron mikroskobu (SEM) ve canlı cep mikroskobu çözümlemesi kullanarak ultrastructural değerlendirme süreçleri plazma tedaviye yanıt hücre içerisinde meydana gelen onarın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. bacillus subtilis Spore üretim ve arıtma
- Spore üretimi için ilgili 5 mL gecede kültürünün aktarım B. subtilis zorlanma, 200 mL çift-güç sıvı Schaeffer sporulation orta (başına litre 16 gr besin et suyu, KCl 2 g, 0.5 g MgSO uygun antibiyotikler ile takıma 4* 7 H2O, 2 mL 1 M Ca (NO3)2, 2 mL 0.1 M MnCl2 * • 4 H2O, 2 mL 1 mM FeSO4, 2 mL % 50 (w/v) glikoz18
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Plazma tedavi B. subtilis yaşama sporlar
B. subtilis sporlar tedavisinde plazma plazma tedavi (Şekil 2) süresi artan ile hayatta kalma bir düşüş Bu çalışma göstermek kullanılır. Sporlar recAifade baskı-gen YFP için erimiş hayatta kalma eğrileri benzer sporlar genetik değişiklik bakteriyel canlılık üzerinde önemli bir etkisi olduğunu belirten vahşi türü baskı gösterdi. Sporlar...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Düşük sıcaklık kullanarak yüzeyler sterilizasyon, alçak basınç plazma alternatifi bir umut verici iyonize radyasyon, kimyasallar ile tedavi gibi oldukça konvansiyonel sterilizasyon yordamlarına (örneğin gazlar tarihlerde H2O2 veya etilen oksit) veya kuru ve nemli ısı23. Sıradan sterilizasyon yöntemleri çoğunlukla etkili bir sterilizasyon sağlar, ancak onlar işleci için potansiyel bir riski ve tedavi malzeme etkisi bilinmektedir. Alçak basınç plazma UV fotonlar, serbe...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar Andrea Schröder bu iş ve Nikea J. Ulrich parçaları video çekimi sırasında yardımını sırasında onun mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Biz de Lyle A. Simmons Bacillus subtilis suşları onun cömert bağış için teşekkür etmek istiyorum: LAS72 ve LAS24. Bu eser yerlerinde hibe tarafından Alman Araştırma Vakfı (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) PA (AW 7/3-1) desteklenen bir durumdu ve DLR-FuW-Projekt ISS hayat, program RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, Mr ve RM) RM (MO 2023/2-1) ve DLR verin. F.M.F. adlı Alman Havacılık ve Uzay Merkezi (DLR) Köln, Almanya, 6 yıl (bir süre içinde Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) tarafından finanse edildi Helmholtz alanı Yaşam Bilimleri Araştırma okul (SpaceLife) bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir Grant No VH-ko-300) ve Havacılık yönetim kurulu ve Havacılık tıp Enstitüsü gibi DLR ek fon aldı. Bu çalışmanın sonuçları Felix M. Fuchs Doktora tez dahil edilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| İki maddeli nozul (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0,8 mm delik çapı |
| Luria Bertani Orta | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Boru bağlantı elemanları | Festo | n/a | G 1/8 |
| Mıknatıs valf DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Poliamid tüp | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Cam kaydıraklar | VWR | 48300-026 | |
| Elektrikli Zamanlayıcı 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor hücre odası | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d = 25 mm, yuvarlak |
| MgSO4 * 7 H < alt > 2 < / alt >O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca (NO< alt > 3 < / alt >) < alt > 2 < / alt > | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl < alt > 2 < / alt > * 4 H < alt > 2 < / alt >O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O< / sub> | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glikoz | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Besin Suyu (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96 kuyulu | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 ve ZEN lite 2012 (Yazılım) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, sürüm 13.0 (İstatistik yazılımı) | Systat GmbH, Erkrath, Almanya | n/a | |
| Attofluor hücre odası | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, yüksek Grid-500 Cam Tabanlı | ibidi | 81168 |
Kaynaklar
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR's Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma - A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907(2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sneath, P. A. 2, Williams and Wilkins. Baltimore, MD. 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826(2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401(2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972(2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
