Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Aksonal taşıma ve intraflagellar taşıma (LFT) akson ve kirpikler morfogenez ve işlevi için gerekli olan. Kinesin süper proteinler ve dinein anterograd ve retrograd taşıma, sırasıyla düzenleyen moleküler motorlar vardır. Bu motorlar Mikrotubul ağları raylar kullanır. Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT vivo içindeçalışmaya bir güçlü model organizmadır. Burada, aksonal transport ve LFT yaşam gözlemlemek için bir protokol tarif C. elegans. Taşınan kargo kargo protein flüoresan proteinler yeşil flüoresan protein (GFP) gibi kullanarak etiketleyerek görüntülenmeyecektir. C. elegans şeffaf ve kargo GFP öğesini proteinler hücre özel Organizatör altında belirli hücrelerdeki ifade edilebilir. Yaşayan solucanlar lastikteki % 10 özel jel üzerinde öldürmek veya solucanlar anesthetizing tekrarlanmasıyla çözülebilir. Bu koşullar altında kargo hareket doğrudan akson ve yaşam kirpikler gözlenen C. elegans diseksiyon olmadan. Bu yöntem hedef proteinler değiştirerek herhangi bir hücre ve/veya onlar ifade edilir hücreleri herhangi bir kargo molekül gözlenmesi için uygulanabilir. Moleküler motorlar gibi en temel proteinler ve aksonal transport ve LFT katılmaktadırlar adaptör protein C. elegansiçinde korunmuş. Diğer model organizmalar için karşılaştırıldığında, mutantlar elde edilen ve daha kolay C. elegansiçinde saklanır. Bu yöntem çeşitli C. elegans mutantlarla birleştirerek aksonal transport ve LFT moleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturmak.
Giriş
Canlı hücre görüntüleme hücre içi taşıma analiz etmek için önemli bir araçtır. Nöronal hücre Biyolojide canlı hücre görüntüleme ile aksonal taşıma nöronal fonksiyon ve morfogenetik1anlamak için gerekli analizlerdir. Aksonal transport kusurları birkaç nörodejeneratif hastalıklar2altında yatan. Sırasıyla kinesin süper proteinler ve dinein aksonal transport anterogradely ve retrogradely,1,2taşır.
Kirpikler Mikrotubul ağ ve kaçakçılığı makine gelişmiş3olan başka bir hücresel yuvası vardır. Protein sentezi makine kir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. numune hazırlama
- Generate transgenik C. elegans zorlanma transgenik metodolojisi 18 kullanarak ilgi. Alternatif olarak, uygun suşların Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) dan elde edilir. Sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşımacılığının görselleştirmek için transgenik çizgi wyIs251 kullanın [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. LFT gözlemlemek için transgenik çizgi mnIs17 [osm-6::gfp] 19 edinin. Bu protokol için bu suşlar kullanılır.
Not: Ya extrachromosomal dizi, genomik entegrasyonu veya bile GFP çakma çalışır. Arka plan sinyalle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aksonal DA9 nöron nakliyesi
Anterograd ve retrograd aksonal transport GFP::RAB-3 wyIs251 satırını kullanarak aynı anda DA9 motor nöron kaydedilebilir. Anterograd ve retrograd DA9 nöron proksimal dorsal axon taşımacılığında ortalama hızı yaklaşık 1,8 ve 2.6 mikron/s, sırasıyla22var. 0.03 ve akson s başına mikron başına 0,018 hakkında hareketli veziküller sayısıdır. Böylece, bir 30 s gözlem DA9 akson 100 x lens ile 10 mikron için bir yakl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sınırlama ile ilgili mevcut yöntemler
Burada açıklanan yöntemi aksonal transport ve LFT gibi hızlı olayları gözlemlemek için optimize edilmiştir. Böylece, immobilizasyon daha daha uzun kuluçka öncelik. Ise önemli pertürbasyon olmadan en az 20 dk için kaçakçılık olayları gözlemlemek mümkün olabilirdi, bu yöntem her zaman axon uzama ve hücre göç gibi uzun gözlem gerektiren yavaş olayları gözlemlemek uygun olmayabilir. Daha uzun gözlem için bir özel yüzdesini azaltarak koşulları optimize etmek gerekiyor .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Teşekkürler
Yazar Dr. Asako Sugimoto (Tohoku Üniversitesi) derinden yararlı onun tartışma için teşekkürler. wyIs251 Doktor Kang Shen (Stanford Üniversitesi) cömert bir hediye etmişti. mnIs17 araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Bu eser JSP'ler KAKENHI grant #17 H 05010 ve #16 H 06536 ve Daiichi Sankyo Vakfı, beyin bilim Vakfı ve Naito Vakfı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sürgülü cam (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Kapak Camı (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene mikroboncuklar 0.1 mikron | Polysciences | #00876 | |
| Isı bloğu | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Mikroskop | Olympus | IX-71 | geniş alan mikroskobu |
| Dönen disk Tarayıcı | Yokogawa | CSU-X1 | eğirme diski konfokal tarayıcı |
| Dijital CCD kamera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 dijital CCD kamera |
| Objektif lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipeti (5 inç) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Cam tüp (1,5 cm çap x 10,5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Kang Shen Laboratuvarı | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101, 6 kez vahşi tip ile geri çaprazlandı |
| Stereo mikroskop | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Ayna transillüminasyon ünitesi | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platin tel (0,2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastik tabak | Falcon | #351007 | |
| Fiji N/A | N/A | ||
| https://fiji.sc/ nematod büyüme ortamı (NGM) | % 1.7 (a / h) agaroz, 50mM NaCl,% 0.25 (a / h) Pepton, 1 mM CaCl2, 5 mg / mL Kolesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
Kaynaklar
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N En....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
