Yöntem makalesi

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

DOI:

10.3791/56736

⸱

26 Şubat 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin yayılmış teknikleri yaygın olarak gametogenesis, sperma için özellikle sırasında çeşitli proteinlerin yerelleştirme dinamik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu teknikler izin homolog kromozom çifti, gibi segregasyonun olaylar sırasında protein ve DNA yerelleştirme desen canlandırma için synapsis ve DNA tamir. Birkaç protokolleri literatürde tarif var, genel Kromatin yayılmış teknikleri memeli profaz yumurta kullanarak sınırlı ve fetal yumurtalık mayoz inisiyasyon zamanlama nedeniyle zor vardır. Buna karşılık, profaz spermatocytes mikrodiseksiyon gerek kalmadan daha yüksek verimleri ile genç erkek fareler gelen toplanabilir. Ancak, hücre saf bir eşitlenmiş nüfusu nedeniyle çocuk ve yetişkin testis segregasyonun ve sonrası segregasyonun germ hücre popülasyonlarının heterojen belirli aşamalarında elde etmek zordur. Mayoz sonraki aşamalarını için yumurta geçiren mayoz ben (MI) veya mayoz II (MII), çünkü yetişkin dişi fareler toplanan ve mayoz kültür devam etmek için teşvik olgun yumurta grupları değerlendirmek için avantajlıdır. Burada, yumurta kullanarak segregasyonun Kromatin yaymak hazırlıkları için yöntemler üzerinden fetal, Yenidoğan disseke ve yetişkin yumurtalık video gösteriler eşlik ile açıklanmıştır. Kromozom missegregation memeli yumurta olaylarda özellikle MI sırasında sıktır. Bu teknikler değerlendirmek ve etkileri farklı mutasyon veya çevre Etkilenmeler oogenesis çeşitli aşamalarında tanımlamak için kullanılabilir. Oogenesis ve sperma arasında belirgin farklılıklar olduğundan, içinde açıklanan teknikleri memeli oogenesis anlayışımızı ve kromozom ve protein dinamiği cinsel dimorfik özellikleri mayoz sırasında artırmak için çok değerli .

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sperma sırasında büyük yarı zaman uyumlu dalgalar segregasyonun germ hücrelerinin hızla ve sürekli olarak ergenlik ve yetişkinlik1boyunca başlangıçlı, testis içinde doldurulan vardır. Erkeklerin aksine, mayoz dişilerde fetal gelişim sırasında yalnızca başlatılır. Doğum yumurtalar profaz uzun süreli dictyate aşamasında tutuklanan kalır ben bir bozulmamış germinal vezikül (GV; nükleer zarf) ergenlik kadar ile. Ergenlik başlangıcında, yumurta kümesini cyclically seçilir büyüme ve olgunlaşma, segregasyonun yeniden başlamasını inisiyasyon işaretleme geçmesi. Köklerin yumurta içinde segregasyonun yeniden başlamasını GV germinal vezikül arıza (GVBD) bilinen bir işlemle ortadan kalkması ile kendini gösteriyor. Yumurta sonra kromozom yoğunlaşma ve segregasyon, kutup vücut ekstrüzyon tarafından takip uğrar. Yumurtalar MII ilerleme üzerine tutuklandı olmak ve döllenme sonra ikinci ve son segregasyonun bölümü tamamlamak için uyarılmış.

Kadın doğurganlık segregasyonun profaz başarısı üzerine son derece bağımlı ben ilerleme. Bu indüklenen DNA Çift Kişilik kırılmalara (DSBs) crossover rekombinasyon2bağlantısı tamiri tarafından aracılık ettiği chiasmata olarak bilinen homolog kromozomlar arasında fiziksel bir bağlantı oluşumunu anahtarıdır. Homolog kromozomlar arasında onların synapsis3kolaylaştırmak için formlar synaptonemal kompleksi (SC) olarak bilinen dinamik bir protein açısından zengin iskele bağlamında bu işlem gerçekleşir. SC homologs birlikte boyunca devam eden DNA tamiri tutan Merkez Bölge proteinler tarafından bağlı iki paralel yanal öğelerden oluşur bir fermuar gibi üçlü yapısıdır. Synapsis önce Aksiyel öğeler, adı yanal elemanlarının öncüleri arasında kardeş chromatids oluştururlar. Synaptonemal kompleks proteinlerin SYCP2 ve SYCP3 gibi kardeş Kromatit uyum eksenleri sırasında erken profaz colocalize eksenel öğeleri oluşturur. Daha sonra siteleri enine filaman protein, Merkezi öğesi derleme ve synapsis hizalanmış homologs4arasında kolaylaştırır SYCP1 için bağlayıcı olarak hizmet vermektedir. Fare yumurtalar tam synapsis 20 varlığı ile tamamen SYCP3 ve SYCP1 uzanıyor, Kromatin kullanarak görüntülenir üst üste hazırlıklar yaymak belirtilir. Synapsis sayede formu chiasmata homologs arasında mukadder olan olgun kesişim onların doğru işleme5,6 tanıtmak için mutL homolog (MLH1/3) dimer ile dekore edilmiş olup pachytene substage girdiği üzerine tamamlandı , 7. kromozom (SMC) kompleksleri, cohesin, condensin ve SMC5/6 karmaşık, dahil olmak üzere yapısal bakımından önemli kromozom dinamikleri ve yapısı mayoz8,9, boyunca düzenlenmesi için 10,11,12. Toplu olarak, bu olaylar uygun BI-yönünü homolog kromozomlar iğ Polonyalılar SC sökme takip karşıt sağlamak

Segregasyonun hücre döngüsü genom bakım programlanmış indüksiyon ve DNA DSBs sonraki onarım nedeniyle çeşitli proteinlerin rolleri incelemek için güçlü bir modeldir. Ayrıca, memeli mayoz Ayrıca, epigenetik değişiklikler ve basma13ilgili bir modelidir. Ancak, memeliler (şekil 1) fetal ve neonatal yumurtalıklarda yer alan kadın mayoz sırasında bu olayları değerlendirmek teknik olarak zordur. 5 substages ayrılabilir profaz: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ve dictyate. Burada, biz ayırmak ve fetal ve neonatal yumurtalıklar ve testis (Şekil 2) arasındaki farkı anlatan. Önceden açıklanan yöntemleri uyarlanmış, bu el yazması da bir iletişim kuralı (Adım 1) kadın segregasyonun profaz hazırlanması için video gösterisi ile özetliyor ben Kromatin yayılır14,15,16,17 . 6-7, adımlarda açıklandığı gibi immunolabelling ile birleştiğinde bu protokolü profaz detaylı mikroskopik analiz sağlar ben yumurta olaylarda.

Oogenesis hata eğilimli olduğunu ve kromozom missegregation olaylar ilk segregasyonun bölünme sırasında döl18,19genetik hastalığın en yaygın kaynağı temsil eder. Bu makale (iletişim kuralı adım 2), biz olgun yumurta GV sahnelenen yetişkin dişi fareler astarlanmalıdır yumurtalıklar ayıkladığınız bir protokol tanımlamak. Destekleyici koşullar altında köklerin yumurta yalıtım ve kültür20takip mayoz Lüteinizan bağımsız yeniden başlamasını tabi. Segregasyonun yeniden başlamasını takiben yumurta mayoz ilerleme sonra metafaz II tutuklayın. Yumurta döllenmiş sürece. metafaz II, tutuklandı kalır Adımları 2-5, biz daha önce raporlanmış iletişim kuralları toplamak, kültür ve yaymak Kromatin hazırlıklar21için MI ve MII yumurta hazırlamak nasıl açıklamak için video gösterisi ile uyum. Teknik yayılan bu Kromatin kromozom ile ilişkili proteinlerin açık immunolabelling sağlar. Ayrıca, bu iletişim kuralını bivalent ve univalent kromozomlar arasında ayırt etmek için de kullanılabilir ve daha fazla tek kız kardeşi çözümlemek için yumurta Ploitlik değerlendirilmesi kolaylaştırmak için chromatids. Bu nedenle, yerelleştirme desenleri segregasyonun proteinlerin açığa yanı sıra, bu iletişim kuralını da kromozom missegregation MI ve MII sırasında olası nedenleri elucidating paha biçilmez bir araç olarak hizmet edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Vahşi tipli C57BL/6J fareler üzerinde deneyler yapıldı.

1. hasat Fetal veya Neonatal yumurtalık ve profaz Kromatin hazırlanması yayılır

  1. Post-coitum (dpc) embriyo 14,5-19,5 gün ayıklamak için servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre hamile kadın kurban.
    Not: Doğum sonrası gün 1 – 5 yumurtalık için 1.3 adıma atlayın. Şekil 1 farklı embriyonik ve doğum sonrası yaş zenginleştirilmiş segregasyonun profaz aşamalar özetler.
  2. V şeklinde bir açılış yapmak steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Anne rahim boynuz incelemek, embriyo Plasenta ayrı ve içine 35 mm petri yemekler Önceden ısıtılmış 1 fosfat tampon serum (PBS) 37 ° C'de x 3 mL içeren embriyo transferi
    Not: 37 ° C'de ayarla FLIPTOP İnkübatör ısısını korumak için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir sıcaklık düzenlenmiş cam sahne ısısını yumurtalık düzenleme sırasında korumak için de kullanılabilir.
  3. 3,5 inç Cerrahi makas ile embriyo ya da yavru IACUC esaslarına göre işten çıkarma yoluyla kurban. Üç embriyo veya yavru daha fazla diseksiyon önce Önceden ısıtılmış PBS yerleştirin.
  4. Önceden ısıtılmış PBS 37 ° C'de 3 mL içeren ayrı 35 mm petri kabına döneminde bir embriyo veya yavru incelemek Embriyo, ön ayakları altında ve hind-bacaklarda ve şekil 2A-Bbelirtildiği gibi kuyruk üstünde doğrudan ön yarısı boyunca arka yarısının ventral orta çizgi boyunca keserek devam edin.
  5. 3,5 inç Cerrahi makas kullanarak karın açın. İnce uçlu forseps kullanarak yerinden ya da çıkarmak belgili tanımlık karaciğer ve barsak, Önceden ısıtılmış PBS 37 ° C'de 3 mL içeren yeni 35 mm petri kabına yumurtalıklarda açığa döngüler ( şekil2B kılavuzuna bakın). Yumurtalık hemen altında ve böbrek Periton boşluğu (şekil 2B-C) arka duvarına doğru arkasında yer almaktadır. Erkek ve dişi gonads arasında differentiating için bir rehber şekil 2Bolarak sağlanır.
    Not: optimal koşullar için hamile kadın kurban sonra hızla yumurtalık incelemek.
  6. Her iki yumurtalık ince uçlu forseps bir diseksiyon kapsam ve seyretmek bardaklarda yer altında bir çift kullanarak her kadın fetus üzerinden kaldır yoksa ayrı Kuyu yapımı çok iyi Önceden ısıtılmış PBS içeren 0.5-1.0 mL plaka ve 37 ° C'de
  7. 0.5 mL hipo-ekstraksiyon arabellek (17 mM TRISODYUM sitrat dihydrate, 50 mM Sükroz, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, proteaz inhibitörü, pH 8.2) bir temiz izle cam veya yumurtalıkların comp sokmak emin bir 9-şey plaka küçük bir kuyu yumurtalıklar her çifti yer letely. En az 15 dakika ama en fazla 30 dk kuluçkaya.
    Not: hipo-ekstraksiyon arabellek taze olun ve DTT ek içinde 2 h kullanın.
  8. Bir hidrofobik bariyer PAP kalemi kuluçka sırasında iki 22 x 22 mm2 kare şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi bir temiz cam 25 x 75 mm2, 1 mm kalınlığında mikroskop slayt çizin.
    Not: Slaytlar vaktinden önce hazır olun.
  9. 100 mM Sükroz temiz bir slayt üzerine 45 – 50 µL pipette ve yumurtalık bir çift için açılan aktarın.
  10. İki 27 G iğneler keskin uçlarını kullanarak, yumurtalık ayrı hücreleri Sükroz çözüm içine serbest bırakmak için alay. Forseps ile büyük yumurtalık parçaları kaldırın ve dikkatli bir şekilde hücreleri dağıtmak için Sükroz çözüm pipet.
  11. Yer 40 µL sabitleştirici çözüm (%1 paraformaldehyde (PFA), % 0,2 deterjan (bakınız Tablo malzemeler), pH 9.2) her kareye bir hazırlanmış slayt içine. Bir 200 µl pipet ucuyla sabitleştirici çözüm eşit slayt yüzeye yayılmış.
  12. Her kareye bir sabitleştirici içeren slayt üzerine Sükroz karışımı 20 µL pipet.
    Not: Bu yumurtalık slayt başına bir çift kullanarak için eşittir.
  13. Gecede, oda sıcaklığında kapalı bir nemli odasında slaytlar kuluçkaya.
    Not: Gece kuluçka çevresinde değişebilir (12-15 saat) oda sıcaklığında.
  14. Odası kapağını açın ve slaytlar tamamen kurumasını bekleyin.
  15. 50 mL % 0,4 ıslatma ajanı PBS çözeltisi içeren bir Coplin kavanoz içindeki slaytları yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek) 2 min için kurutma ve immunolabelling Protokolü (adım 6) devam edin.
    Not: Slaytlar-80 ° c daha sonra kullanmak üzere saklamak mümkün olabilir, ancak bu faiz protein bağlı olarak değişir. En iyi sonuçlar için derhal immunolabelling Protokolü (adım 6) gidin.

2. metafaz Ben yumurta toplama

  1. Her fare izole antral folikül sayısını en üst düzeye çıkarmak için intraperitoneally cinsel olgun bakire kadın fareler hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG, olarak da bilinen at koryonik gonadotropin (EKG)) ile 5 IU enjekte et.
    Not: hasat yumurta sayısı zamanla azalacak gibi için en uygun yumurta verimi, fareler 1-3 ay-in yaş, olmalıdır. PMSG hazırlamak için 5000 IU şişe 100 ml tek kullanımlık aliquots 600 µL-20 ° C'de, steril PBS (5 U/0.1 mL) deposunun dağıtılması
  2. 44-48 h sonra koleksiyon orta, % 5 fetal sığır serum (FBS) ve 3 mg/mL sığır serum albumin (BSA; ile takıma en az gerekli orta alfa (MEMα) orta hazırlamak MEMα/BSA/FBS). Medya 0.2 µm gözenek filtre sterilize. MEMα/BSA/FBS orta fare başına bir cam çanak içine ve 37 ° c % 5 CO2 kuluçka sıcak 2.5 mL dikkatle boşaltmak.
    Not: Diğer topluluk ve ticari olarak kullanılabilir (M2 ve M16) kültür ortam da yaygın olarak kullanılır.
    Dikkat: İşleme adımları sırasında ortam havası pozlandırmayı en aza indirmek sınırlı bir süre için bir defada %5 CO2 kuluçka makinesi bir kültür yemekleri kaldırma öneririz.
  3. Servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre fareler kurban.
  4. Büyük bir V-şekilli açılış yapma steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Forseps kullanarak, bağırsak fare başkanı doğru yerinden. Rahim her boynuzun bulun; Yumurtalık proksimal göğüs kafesi için mevcut vardır. Ovidukt iyi Forseps ile tutun ve şişko çift diseksiyon makası (şekil 4) kullanarak yumurtalık kesti. Devam ovidukt tutun ve iyi forseps başka bir set ile bursa ve yer yumurtalıktan MEMα/BSA/FBS orta içeren koleksiyon çanak içine yayın.
    Not: adım 1 olduğu gibi bu yumurtalık 37 ° C'de tutmak ve % 5 CO2' de sürdürmek için zorunludur. %5 CO2 karıştırmak için bağladım FLIPTOP İnkübatör sıcaklık ve CO2 düzeyleri en iyi bakım için izin vermek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir sıcaklık düzenlenmiş cam sahne ısısını oosit düzenleme sırasında korumak için de kullanılmalıdır.
  5. 1 mL şırınga ile bir 27'lik iğne (ya da benzer boyutta), kullanarak el ile büyük antral folikül delinme tarafından kümülüs oosit kompleksleri yayın.
  6. Diseksiyon mikroskop kesilmediğini gözleyerek, ağız ile çalışan cam pipet veya kılcal veya elle işletilen mikrometre-enjektör (şekil 5) kullanarak GV sahnelenen yumurta toplamak. Yalnızca yayımlanan yumurta antral folikül toplamak. GV yumurta var bir çapı yaklaşık 90 µm. GV yumurta 2-3 kat granulosa hücreleri tarafından çevrili olması ve yaklaşık 200 µm toplam bir çapa sahip.
  7. Kültür yumurtalar temiz izle cam veya MEMα/BSA/FBS orta metafaz ulaşmak 6 h için içeren bir 9-şey plaka ben % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de.
  8. Adım 4'e geçin.

3. metafaz II (MII) yumurta toplama

  1. Her fare izole yumurtalar en üst düzeye çıkarmak için intraperitoneally cinsel olgun bakire kadın fareler PMSG ile 5 IU enjekte et. 44-48 h sonra intraperitoneally insan Korionik gonadotropin (hCG) ile 5 IU enjekte et.
    Not: hasat yumurta sayısı zamanla azalacak gibi için en uygun yumurta verimi, fareler 1-3 ay-in yaş, olmalıdır. HCG hazırlamak için bir şişe 10.000 U 200 ml PBS çözülür (5 U/0.1 mL). -20 ° C'de 600 µL tek kullanımlık aliquots saklayın
  2. 12-14 saat'dan sonra MEMα/BSA/FBS koleksiyon orta, adım 2.2, yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın.
  3. Servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma IACUC esaslarına göre fareler kurban.
  4. Büyük bir V-şekilli açılış yapma steril makas kullanarak abdominopelvic boşluğu açın. Forseps kullanarak, bağırsak fare başkanı doğru yerinden. Rahim her boynuzun bulun, yumurtalık proksimal göğüs kafesi için mevcut. Ovidukt iyi Forseps ile tutun ve şişko çift diseksiyon makası (şekil 4) kullanarak yumurtalık kesti. Sonra yumurtalık ve ovidukt çıkarın ve MEMα/BSA/FBS orta içeren koleksiyon çanak içine yerleştirin.
    Not: olduğu gibi 1 ve 2 numaralı adımları, bu yumurtalık 37 ° C'de tutmak ve % 5 CO2' de sürdürmek için zorunludur. %5 CO2 karıştırmak için bağladım FLIPTOP İnkübatör sıcaklık ve CO2 düzeyleri en iyi bakım için izin vermek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir sıcaklık düzenlenmiş cam sahne ısısını oosit düzenleme sırasında korumak için de kullanılmalıdır.
  5. 1 mL şırınga ile bir 27 G (veya benzer boyutu) kullanarak veya keskin forseps, MII yumurta serbest bırakmak için ovidukt ampulla bir delik gözyaşı.
    Not: ampulla yumurta zarar vermemeye dikkat et. Yumurta görülebilir (şekil 4) vardır öyle ki ampulla şişmiş ve yarı saydam görünür.
  6. Hasat MII yumurtalar bir ağız ile çalışan cam pipet veya kılcal veya elle işletilen mikrometre-enjektör (şekil 5) kullanarak toplama orta ile yeni bir çanak içine ovidukt ampulla üzerinden.
  7. Adım 4'e geçin.

4. yumurta Denuding ve Zona pelusida kaldırma

  1. 300 IU/mL, 3 mg/kümülüs hücreleri (2.5 mL/fare) izle cam ve 37 ° c, % 5 CO2tutun çevreleyen yumurta denude için mL BSA ile takıma MEMα orta hyaluronidase hazırlayın.
    Not: Hyaluronidase etkinliği keskin hazırlık 1 h sonra azalır. MII yumurtalar için hyaluronidase tedavi gerekli değildir.
  2. Oosit-kümülüs hücre kompleksleri 300 IU/mL, MEMα/BSA 3 dk yumurta kümülüs hücreleri çevreleyen denude için hyaluronidase için maruz.
    Dikkat: yumurta zarar verir gibi hyaluronidase, maruz 3 dk fazla olamaz.
  3. Yumurta yıkama, yumurtalar için yeni bir transfer için MEMα/BSA orta çanağı ısıttı. Küçük ağız ile çalışan cam pipet veya kılcal (biraz daha büyük yaklaşık 90 µm olan yumurta, çapı daha) kullanarak, yukarı kompleksleri pipette ve tamamen kümülüs hücreleri ayırmak için aşağı. Yumurtalar için bir sonraki adım hazırlarken da kuluçka makinesine kurtarmak izin verir.
  4. Sıcak asit Tyrode'nın çözüm, MEMα/BSA ve Waymouth'ın medya 37 ° c (500 µL/fare). Yer 300 µL küçük 9-şey cam plakanın her şey içinde.
  5. Zona pelusida (ZP) kaldırmak için 5-10 yumurta Tyrode'nın çözüm aktarın. Yumurtalar için sadece 30-45 s çözüm için ortaya çıkarmak.
    Not: Çözüm için çok az pozlama ZP tamamen, hangi-ecek önlemek yumurta patlama ve yayılmasını kromozomlar kaldırmaz. Çok fazla maruz zarar ve oosit öldürmek. ZP erime diseksiyon mikroskop altında izlerken çekim hızı optimize yardımcı olabilir.
    Dikkat: işlevini yaşla azalır taze Tyrode'nın çözümünü kullanarak, önemlidir. Tyrode'nın çözüm taze bir kuyu ZP Tekdüzen sindirim sağlamak için tedavi yumurta her grup için kullanın.
  6. Hemen ZP kaldırıldıktan sonra yumurta ısıtılmış MEMα/BSA/FBS orta transfer ederek yıkayın. Bu yıkama işlemi tekrarlayın.
    Not: aktarırken, yumurta kolayca birlikte sopa olacak gibi ve cam pipet veya ZP kapiller aşağıdaki kaldırılması için dikkatli olun. Cam pipet veya kılcal Waymouth'ın orta ön ıslatma birbirine yapışmasını yumurtalar en aza indirmek olacaktır.
  7. Aktarım ve yumurta Waymouth'ın orta % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 30 dakika kurtarmak izin verir.
  8. Adım 5'e geçin.

5. MI ve MII oosit Kromatin formaları

  1. PAP kalem kullanma, şekil 6Aiçinde gösterildiği gibi cam slayt üzerinde 11 x 44 mm2 dikdörtgen çizin.
  2. Slayt sabitleştirici ince bir tabaka ile kat (% 1'paraformaldehyde, % 0,2 Triton-X 100 H2O, pH 9.2) 100 µL sabitleştirici bir slayda, pipetting ve slayt ileri geri sallanan tarafından. Slayt aşırı sabitleştirici kurtulmak için dokunun.
  3. 5-10 yumurta iğneyle küçük ağzını pipet ile mümkün olduğunca küçük medya olarak arasında al ve iğne bir çizgide sabitleştirici kaplı slayt sabitleştirici çözüm içine slayt üzerinde 1 cm yumurta bozdurulması sürüklemek. Yumurtalar yatırılır ve patlama emin olmak için bir diseksiyon mikroskop kullanarak bu adımı gerçekleştirin.
    Not: Yumurtalar hemen slaytta patlaması. Yumurta olan yükseklik etkisi yayılan Kromatin derecesini yatırılır. Şekil 6 temsilcisi sonuçlarında daha ayrıntılı bilgi için bkz.
  4. Slaytlar Kromatin bağlı kalmak izin vermek için bir kapalı oksijen odasına gecede oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Tamamen kurumasına ve slaytlar % 0,4 ıslatma ajanı-H2O, pH 8.0 50 mL içeren bir Coplin kavanoza durulama slayt izin.
  6. Adım 6'ye gidin.

6. Immunolabelling

  1. Tablo 1' de açıklanan antikor seyreltme arabellek (ADB) hazırlayın.
  2. 50 mL yıkama arabellek (WB) çözeltisi (ADB seyreltilmiş PBS içinde % 10) içeren iki Coplin kavanoz ve 50 mL WB ve % 0.05 deterjan solüsyonu içeren bir Coplin kavanoz hazırlamak (örneğin, 50 mL WB 250 µL % 10 deterjan ekleyin).
  3. WB 50 mL içeren bir Coplin kavanoza 1 ve 5 10 dk için bu protokol bölümünde hazırlanmıştır slaytları yıkayın.
    Dikkat: immunolabelling sırasında herhangi bir noktada kuru slayt izin vermeyin.
  4. 10 dk Coplin kavanoz içeren 50 mL WB ve % 0.05 deterjan solüsyonu slaytlarını yıkayın. Sonra kalan Coplin kavanoza WB çözüm için 10 dk 50 mL içeren slaytlar yıkayın.
  5. Seçili birincil antikorların ADB içinde seyreltilmiş 100 µL ile aşırı sıvı ve kapak slaydın dışına dokunun. Gecede odasında bir kapalı nemli 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Kuluçka 2 3 kısaltılmış gönderilen 37 ° C'de Antikor (örneğin, 50 µL) daha küçük hacimli bir coverslip veya parafilm içeren slaydı kapsayan tarafından kullanın.
  6. Slaytlar 50 mL % 0,2 ıslatma ajanı PBS çözeltisi, pH 8.0 içeren bir Coplin kavanoza durulayın.
  7. 6.2-6,5 olan adımları yineleyin.
  8. Seçilen ikincil antikorların ADB içinde seyreltilmiş 100 µL ile aşırı sıvı ve kapak slaydın dışına dokunun. Slayt 1'e 2 kuluçkaya gönderilen bir kapalı nemli odasında 37 ° C'de.
  9. Slaytları 10 dk 50 mL % 0,2 ıslatma ajanı PBS çözeltisi, pH 8.0 içeren Coplin kavanoz için 2 kez yıkayın.
  10. Slaytları 2 kez 5 dakika % 0,2 ıslatma ajanı-H2O çözeltinin pH 8.0 50 mL içeren Coplin kavanoz içinde yıkayın.

7. montaj slaytlar

  1. 2. adımda hazırlanan profaz Kromatin yayılır için montaj orta 4', 6-diamidino-2-phenylindole içeren 100 µL ekleyin (DAPI, 1.5µg / mL). İçin hazırlanan adım 5 MI ve MII Kromatin yayılır, DAPI içeren montaj orta 50 µL Ekle (1.5µg / mL). Yavaşça uzak aşırı sıvı leke.
  2. 22 mm x 60 mm coverslip üstüne koyun ve açık oje ile mühür. 4 ° C veya -20 ° C de bir slayt kutu değerlendirme Floresans mikroskobu ile kadar saklayın.
    Not: aşırı montaj orta oje ile sızdırmazlık önce kurtulmak dokunun hafifçe kapak notu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görselleştirme ve yumurta segregasyonun kromozomlar değerlendirilmesi için iki teknik anlatmıştık. İlk teknik profaz ilerlemesinde embriyonik ve neonatal yumurtalıkların değerlendirilmesi doğru yiyecek ve içecek. Profaz Kromatin yayılmış ürünleri çok sayıda dinamik süreçler kromozom çifti, synapsis dahil olmak üzere, mayoz sırasında görüntülenmesi için son derece değerli ve desynapsis, homolog rekombinasyon ve epigenetik kromozom remodeling. Burada, bu yöntemin güçlü görselleştirme için b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin yayılmış hazırlıklar araştırmacılar dişi memeli mayoz ve proteinlerin dahil dinamik yerelleştirme kronolojik olarak çalışmaya izin verir. Embriyonik ve neonatal Kromatin yayılır segregasyonun profaz boyunca olayların yakın analiz için izin verir. Metafaz ben ve metafaz II Kromatin yayılır tek kız kardeşi fark için kullanılan chromatids gelen kız ve eşlenmiş homolog kromozomlar, Ploitlik değerlendirmek yanı sıra eşleştirilmiş. Buna karşılık, burada açıklanan Protokolü sık sık yüksek düzeyde Kromatin bağlı protein...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser G.H. ve J.H. eğitim grant bursu üzerinden Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH) (CA009110) ve NIGMS (R01GM11755) P.W.J için tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10X Fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4Kalite Biyolojik119-069-161
60 mm x 15 mm petri kaplarıDenvilleT1106
35mm x 12mm petri kaplarıDenvilleT1103
İnce forsepsVWR300-050
Mikro diseksiyon makasıTed Pella1340
Diseksiyon  makas, keskin uç, 41/2"VWR82027-578
Cam kare izle 1 5/8Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi742300Her kullanımdan önce otoklav
SükrozSigmaS8501
Trisodyum Sitrat DihidratSigmaS1804
EDTASigmaE6758
Trizma BazSigmaT1503
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma646563Kullanmadan hemen önce hipotonik tampona ekleyin
50x Proteaz İnhibitörüRoche11873580001Kullanmadan hemen önce hipotonik tampona ekleyin
İğneli turberculin şırınga (1cc, 27 G x 1/2 inç)Becton, Dickinson (BD)309623
Altın mühür ultra buzlu cam slaytlar (25X75mm, 1mm kalınlığında)Thermo3063-002
Süper PAP kalemi, büyük (sıvı engelleyici)ElektronMikroskobu Bilimleri (EMS)71310
%16 Paraformaldehit suluElektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)15710
Triton X-100SigmaT8787El yazması deterjan
İmmüno leke nem odası Yaprakdökmeyen240-9020-Z10
Coplin kavanozlarıFisher08-815
Photo-flo 200Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)74257El yazmasında ıslatıcı ajan
Hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG)SigmaG4877Alikotları -20C'de saklayın
İnsan koryonik gonadotropin (HCG)SigmaC0434Alikotları -20C'de saklayın
Dokuz içbükey boşluklu PYREX Spot PlakalarıFisher13-748BHer kullanımdan önce otoklav
Cam kılcalFisher22260943Oosit toplama iğneleri yapmak için
Marka Parafilm MSigmaBR701501Oosit toplama iğneleri yapmak için
Lateks kauçuk boru (3,2 mm iç çap x 6,4 mm dış çap)Fisher14-178-5BOosit toplama iğneleri
yapmak içinLateks kauçuk boru (6,4 mm iç çap x 11,1 mm dış çap)Fisher14-178-5DOosit toplama iğneleri yapmak için
Esnek silikon kauçuk burunluk, sert plastik ağızlık ve 15 inç lateks boruSigmaA5177-5EAOosit toplama iğneleri yapmak için
Mitutoyo mikrometre kafasıMituoyo150-208Oosit toplama iğneleri yapmak için
Şırınga 5 mLBD Biosciences309646Oosit toplama iğneleri yapmak için
Şırınga filtresi 0.45 & mu; m filtreCorning431220Oosit toplama iğneleri yapmak için
Cam Pastör Pipet 5 3/4 "Fisher13-678-6AOosit toplama iğneleri yapmak için
83 x 0,5 mm pipet ucuDenvilleP3080Oosit toplama iğneleri yapmak için
&alfa;-MEMInvitrogen11415049
Waymouth'un ortamıYaşam Teknolojileri
Fetal sığır serumuFisherA3160602
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA3311Oosit kültür ortamı için
500ml filtre üniteleri 0.22umDenvilleF5227
HyaluronidazSigmaH3506
Tyrode ' s çözeltisiSigmaT1788Alikotları -20C'de saklayın
ADB / yıkama tamponu içinat serumuSigmaH-1270
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA1470ADB / yıkama tamponu için
Vector LabsH-1200VECTASHIELD antifade montaj ortamı
Mikroskop kapak slaytları (22mmx60mm)Fisher12-544-G
Şeffaf ojeAmazon N/A
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Mikroskoplar
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Gözlemci Z1Zeiss
Name<strong>Company>Katalog NumarasıComments
Primer Antikorlar
Mouse anti-MLH1Yaşam TeknolojileriMA5-15431Seyreltme faktörü - 1:100
Tavşan anti-SYCP1Yaşam TeknolojileriPA1-16763Seyreltme faktörü - 1:1000
Keçi anti-SCP3Santa Cruzsc-20845Seyreltme faktörü - 1:50
İnsan anti-sentromer proteinAntikorları Dahil15-235Seyreltme faktörü - 1:100
Tavşan anti-TOPOIIAbcamab109524Seyreltme faktörü - 1:100
Fare anti-Histon H4 (di metil K20, tri metil K20)Abcamab78517Seyreltme faktörü- 1:500
Tavşan anti-Rec8Dr. Karen Schindler'inN/ASeyreltme faktörü- 1:10.000
NameCompanyKatalog NumarasıYorumlar
İkincil Antikorlar
Eşek anti-keçi IgG (H + L) Alexa Fluor 568 eşlenikThermo-Fisher ScientificA-11057Seyreltme faktörü - 1:500
Eşek anti-fare IgG (H + L) Alexa Fluor 488 eşlenikThermo-Fisher ScientificA-21202Seyreltme faktörü - 1:500
Eşek anti-tavşan IgG (H + L) Alexa Fluor 647 eşlenikThermo-Fisher ScientificA-31573Seyreltme faktörü - 1:500
Keçi anti-fare IgG (H + L) Alexa Fluor 568 eşlenikThermo-Fisher ScientificA-11004Seyreltme faktörü - 1:500
Keçi anti-İnsan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo-Fisher ScientificA-11013Seyreltme faktörü - 1:500
Keçi anti-tavşan IgG (H + L) Alexa Fluor 568 eşlenikThermo-Fisher ScientificA-11011Seyreltme faktörü- 1:500
11220035DAPI ile izniyle

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  2. Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
  3. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
  4. Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
  5. Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
  6. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
  7. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
  8. Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
  9. Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
  10. Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
  11. Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413(2014).
  12. Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
  13. Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
  14. Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
  15. Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
  16. Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
  17. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  18. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  19. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
  20. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  21. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
  22. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oosit ToplamaMayoz lerlemeFare OositleriProtein LokalizasyonuKromozom MorfolojisiMayotik Kromozom Ayr lmasHomolog Kromozom E le mesiSinapsis AnaliziDNA Onar m De erlendirmesi

İlgili makaleler