Yöntem makalesi

Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

6.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

25 Ocak 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İki substrat özgü γ-secretase deneyleri başarılı bir şekilde üretilip. Burada sunulan her iki hücre tabanlı deneyleri γ-secretase enzimatik faaliyetleri yolu ile ateş böceği luciferase gazetecilere verim ölçmek için tasarlanmıştır.

Özet

Biz hücre tabanlı muhabir gen deneyleri kantitatif farklı yüzeylerde γ-secretase bölünme ölçmek için bir çift geliştirdik. Bu el yazması γ-secretase-aracılı bölünme APP-C99 veya çentik, bir Gal4 ateş böceği organizatörü tahrik luciferase muhabir sistemi kullanarak izlemek için kullanılan yordamları açıklar. Bu deneyleri stabil CO HEK293 hücreleri Gal4 tahrik luciferase muhabir gen ve app (APP-C99; Gal4/VP16-tagged C-terminal parça transfecting tarafından kuruldu CG hücreleri), veya Gal4/VP16-etiketli çentik-ΔE (NΔE; NG hücreleri). Bu muhabir deneyleri paralel olarak kullanarak, biz bu göstermiştir bir ErbB2 inhibitörü CL-387,785, tercihen γ-secretase bölünme APP-C99 CG hücrelerdeki ama değil NΔE NG hücrelerdeki bastırmak. CL-387,785 ile tedavi ederken CG ve NG hücreleri tarafından sergilenen fark yanıt γ-secretase modülatörler için tercih edilen bir karakteristik, hem de bu yanıtları γ-secretase DAPT tarafından indüklenen pan inhibisyonu alışılmışın tersine olan. Çalışmalarımız γ-secretase faaliyetleri farklı yüzeylerde doğru hücresel bir bağlamda farklılaşmış doğrudan kanıt sağlar. Bu yeni deneyleri bu nedenle ilaç keşif geliştirilmiş AD tedaviler için yararlı araçlar olabilir.

Giriş

Amiloid-β (Aβ) oligomeric formları ateş hastalarda Alzheimer hastalığı (Ah)1' den beynindeki başlıca nedeni olduğuna inanılmaktadır. Aβ peptitler β-secretase ve γ-secretase2tarafından ilk amiloid precursor protein (APP), kademeli bir bölünme tarafından üretilmektedir. Son on yılda, reklam tedavisinde doğru tedavi yaklaşımları Aβ üretim3önlenmesi üzerinde odaklanmıştır. Çalışmalar çoğunluğu γ-secretase bölünme app engel ve böylece Aβ üretimi veya β-ve/veya γ-secretase faaliyetleri4inhibisyonu azaltır α-secretase etkinlik, her iki büyütme üzerinde odaklanmıştır. Ne yazık ki, non-selektif kaçınılmaz yan etkileri sonuçlarında β veya γ secretases inhibisyonu β ve γ secretase5,6diğer fizyolojik yüzeylerde, işleyişi ile girişim bu kaynaklanmaktadır. γ-secretase inhibitörleri ile ilgili son çalışmalar bir dizi üzerinde çentik7 temel γ-secretase-aracılı işlenmesi ihmal edilebilir etkileri uygulamakla süre Aβ üretim düzenleyen kimyasal ve genetik modülatörler keşfi bildirdin ,8,9,10,11,12, ancak, başarılı tedavi değil henüz geliştirilmiştir. Böylece, daha fazla sistematik ekranlar seçici APP işleme γ-secretase-aracılı modüle roman genetik ve kimyasal değiştiricileri bulmak için garanti altındadır.

Γ-Secretase 90'dan fazla farklı proteinler membran bağlantılı ayırmak olduğu bilinmektedir. Bu yüzeyler arasında düzeydedir, olan faaliyet hücre kaderini belirleme farklılaşma geliştirme13sırasında için önemlidir. Seçmeli olarak γ-secretase-katalize APP olmaması durumunda işleme oransal çentik etkileyen işleme minimizing çentik ile ilgili yan etkileri için γ-secretase inhibitörleri gerekli olacak ve bu seçicilik olacak birincil faktör olduğu düşünülmektedir Reklam kronik tedavisi için potansiyel γ-secretase modülatörler biyolojik etkinliği dikte. Arylsulfonamide türevleri, GSI-953 (begacestat) ve BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase14,15güçlü ve seçici inhibisyonu sergilemek bulunmuş gibi bir dizi olmuştur. Bir önceki çalışma γ-secretase dekolte APP ve çentik fark inhibisyon Zebra balığı16kullanarak vivo içinde validation ile birleşimiyle ELISA tabanlı bir nicel tahlil gözlenen göstermiştir. Ayrıca, hücre tabanlı tahlil paradigmalar γ-secretase APP ve çentik17,18doğru olası substrat selectivity gidermek amacıyla kurulmuştur. Burada açıklananlar için benzer protokolleriyle, biz son zamanlarda yeni bir sınıf (d) keşfettim-kuvvetli APP γ-secretase bölünme çentik tutumlu seçicilik19ile modüle leucinamides. Birlikte, bu çalışmaların bir kanıtı-of-substrat seçicilik/kullanılabilirliğini γ-secretase kimyasal modülasyon ve deneysel doğrulama tabi olabilir fikri destekleyen concept sağlar. Ancak, bu tahlil platformlar çoğunlukla nispeten düşük işlem hacmi dökümanları ve ilaç bulma programları için endüstri standartlarını karşılamıyor olabilir emek yoğun yaklaşımlar kullanır.

Biz-si olmak son zamanlarda oluşturmak kantitatif γ-secretase iki farklı yüzeylerde, APP (APP-C99) 99-amino asit C-terminal parçası ve ekstraselüler katalitik aktivitesini belirleyebilirsiniz hücre tabanlı luciferase muhabir gen deneyleri Çentik peptid (NΔE) etki alanı silindi. APP-C99 ve NΔE olarak γ-secretase çeşitli deneyleri içinde doğrudan yüzeylerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Homojen ve tutarlı luciferase muhabir gen deneyleri için APP-C99 veya NΔE γ-secretase bölünme üretmek için yapısal bir Gal4 ateş böceği organizatörü tahrik luciferase muhabir (ifade eder bir istikrarlı hücre HEK elde edilen satır (CG) oluşturulan Gal4-Luc) ve Gal4/VP16-öğesini APP-C99 füzyon protein (C99-GV). Buna ek olarak, yapısal Gal4-Luc ve NΔE (NΔE-GV) Gal4/VP16-öğesini ifade başka bir istikrarlı hücre HEK elde edilen satır (NG) oluşturulan. Bu roman substrat özgü γ-secretase deneyleri kullanarak, biz şimdi ölçmek ve γ-secretase farklı yüzeylerde (CG hücrelerindeki APP-C99) veya NΔE NG hücrelere doğru katalitik aktivitesini ayırt etmek için bir yöntem sağlar. Ayrıca, substrat özgü γ-secretase deneyleri yüksek içerik tarama platformları için elverişli olması için tasarlanmıştır. Bu yeni oluşturulan γ-secretase deneyleri bilişsel işlev yeni nesil tedavisi için istenmeyen çentik inhibisyon alabilme olmadan Aβ üretim baskılayarak artırabilirsiniz roman γ-secretase modülatörler keşfi için önünü açabilir Reklam.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Luciferase gazeteci sinyalleri, γ-Secretase bölünme APP-C99 veya NΔE için karşılık gelen ölçümü

Not: Lütfen CG ve NG hücreleri20,21nesil ayrıntılı açıklamaları için önceki yayınlara bakın.

  1. Tohum hücreleri NG veya CG (20, 000 hücre/iyi) 96-şey Mikroplaka 200 μL/kuyuda Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) artı % 10 fetal sığır serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiyotik (örneğin oluşan büyüme orta bir son seste üzerine zeocin) ve 200 μg/mL hygromycin d.
    1. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
    2. Mikroplaka bir oksijen CO2 kuluçka aktarmak ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  2. 100 μL büyüme ortamının her kuyudan çıkarın.
  3. 100 μL/iyi büyüme eklemek orta ya % 0,2 Dimetil sülfoksit (DMSO), 2 mikron ile 2 μg/mL tetrasiklin içeren CL-387,785, 2 mikron N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) veya diğer ilgili ErbB1/ErbB2 inhibitörleri.
  4. Mikroplaka 24 h 37 ° C'de tedavi CG veya NG hücrelerde kuluçkaya.
  5. 150 μL/iyi büyüme orta Mikroplaka kaldırın.
  6. 50 μL/iyi luciferase tahlil reaktif ekleyin ( Tablo reçetesibakınız).
  7. Mikroplaka bir ışıldama Mikroplaka okuyucu aktarın.
    1. Mikroplaka nazik ajitasyon ile 5 min için oda sıcaklığında korumak.
  8. Ateş böceği luciferase (FL) belirlemek-ışıldama ışıldama Mikroplaka okuyucu içinde kayıtlı bir önceden tanımlı program kullanarak yayılan.
    1. Araç kontrol yazılımı açın ( Tablo reçetesi enstrüman Ayrıntılar için bakınız).
    2. 'Luminometry' 'Aracı' menüsünden seçin.
      1. 'Parameters' Ayarlar ' ın altında emisyon filtre, kene 'Normal' için emisyon diyafram, girmek için '1' için zaman sayma 'Filtre' seçin ve yukarı ışıldama okuma ayarlamak için 'Tamam' tıklatın.
    3. 'Araç kontrol' sekmesi altında etkin iletişim kuralları listesinde gezinin ve ışıldama okumak için önceden saklı protokolü seçin.
    4. 'Ekran canlı' sekmesinin altındaki aşağı açılır listesinden ölçek tanımlamak ve 'Logaritma' veya 'Lineer' türü için seçin.
    5. 'Isı' sekmesinde, 'Off' tabak Isıtma için seçin.
    6. Okuma ışıldama gerçekleştirmek için 'Başlat' düğmesini tıklatın.
    7. Gerektiğinde, sonuçları 'gömülü kontrol yazılımı içinde belgili tanımlık keşfe çıkmak' kullanarak elektronik tablo biçimine dışa aktarabilirsiniz.

2. miktar γ-Secretase aktivitesinin

  1. CG tarafından yayılan bir ışıma sinyal veya büyüme orta % 100 göreli γ-secretase etkinlik olarak yalnız 1 μg/mL tetrasiklin içeren % 0,1 DMSO ile tedavi hücreleri NG tanımlayın.
    1. Arka plan ışıldama CG veya NG hücreden tetrasiklin içermez büyüme orta hücrelerle tedavi tarafından tahmin ediyoruz.
  2. Luciferase sinyalleri ile büyüme orta 1 μg/mL tetrasiklin içeren kültürlü CG veya NG hücreleri normal duruma getirmeye ve ya 1 mikron CL-387,785 veya 1 mikron luciferase sinyali ile DAPT CG DMSO tedavi veya NG tarafından yayılan hücreleri (% 100 göreli γ-secretase etkinlik, olarak 2.1 içinde tanımlanmış olan).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnhibisyon ErbB2 CL-387,785 tarafından differentially APP-C99 tarafından işlenmesini teşvik γ -secretase çentik bölünme etkilemeden
Kantitatif belirli γ-secretase substrat proteolitik bölünme ölçebilirsiniz hücre tabanlı bir tahlil oluşturmak için biz oluşturulan CG HEK293 elde edilen hücre kültürünü bir tetrasiklin-indüklenebilir C-ölümcül Gal4/VP16-öğesini, istikrarlı co transfection tarafından APP-C99 ve bir Gal4 ateş böceği organiz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Aducanumab immünoterapi evre 1b deneme reklam için gelen umut verici sonuçlar sıkıca Aβ kritik rolü yılında22 patogenezinde kurduk ve anti-Aβ yaklaşımlar hala Anti-reklam uyuşturucu gelişimi için uygun bir strateji olduğunu göstermektedir. Burada γ-secretase-katalize proteolizis APP-C99 ve ateş böceği luciferase muhabir sistemleri kullanarak NΔE miktarının için hücre tabanlı deneyleri tarif. APP-C99 ve NΔE iki en iyi okudu γ-secretase yüzeylerde ve birlikte γ-secretase13pat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar çekirdek tesis cep Enstitüsü ve Organismic biyoloji, Academia Sinica, teknik destek için teşekkür ederiz. Bu Çalışma Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan (Y.-F. için en 103-2320-B-001-016-MY3 tarafından desteklenmiştir L.), Program translasyonel biyofarmasotik geliştirme-Platform eksen destekleyen teknoloji yenilik için Düzen (Y.-Tayback için NP7) ve Academia Sinica (Y.-Tayback için).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VictorLight lüminesans plaka okuyucuPerkinElmer2030-0010
Sınıf II, Tip 2 Biyolojik Güvenlik KabiniThermo Scientific1300 Serisi A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Termo Fisher12100046büyüme ortamının ana bileşeni
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidinThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Higromisin BGibco10687010
HemositomerSigma-AldrichBR717805 Aldrich
96 kuyulu mikroplakaNunc156545
TetrasiklinSigmaT7660
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD2650
Steady-Glo lusiferaz test reaktifiPromegaE2510
Nemlendirilmiş CO2 inkübatörRevcoUltima II
T-REx293 hücre hattıInvitrogenR71007
Wallac 1420 yazılım sürümü 3.0Lüminesans mikroplaka okuyucununPerkinElmer
cihaz kontrol yazılımı

Kaynaklar

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gama Sekretaz AnaliziAPP Kesilme l mNotch Kesilme AnaliziL iferaz Raporlay c SistemiHEK293 H cre K lt rCL 387 785 UygulamasDAPT nhibisyon al masSubstrat Se icilik AnaliziAlzheimer Hastal Ara t rmasla Ke if Platformu

İlgili makaleler